De oprichting en het gebruik van patiënt-afgeleide xenograftmodellen van metastasen van het centrale zenuwstelsel

De ontwikkeling van nieuwe therapieën voor CZS-metastase is belemmerd door het gebrek aan goede preklinische modellen. Onze patiënt-afgeleide xenograftmodellen recapituleren CNS-metastase beter dan historisch gebruikte cellijnmodellen. Door gebruik te maken van verschillende routes van tumorinenting, kunt u verschillende aspecten van de metastatische cascade bestuderen.

Elke route heeft voordelen die kunnen worden gebruikt voor uw studie. De procedure wordt gedemonstreerd door Ben Yi Tew, een postdoctoraal fellow uit mijn laboratorium. Voor subcutane flankimplantatie van gecryopreserveerde PDX-tumoren, ontdooi het gecryopreserveerde tumorweefsel snel in een waterbad van 37 graden Celsius.

Spoel het vervolgens af in vijf milliliter DPBS in een weefselkweekschaal. Maak vervolgens, na bevestiging van de anesthesie bij een drie tot acht weken oude vrouwelijke NOG-muis, een incisie van 0,5 tot één centimeter op de linker- of rechterflank en breng een stuk van 2x2x2 millimeter van het tumorweefsel diep in de zak in. Laat de muis na het sluiten van de incisie herstellen van anesthesie met monitoring totdat deze ambulant is.

Zodra de tumor begint te groeien, meet u de tumor drie keer per week met een remklauw. Identificeer op het juiste experimentele eindpunt metastasen door middel van een obductie en bevestig de aanwezigheid van tumoren in het doelorgaan door middel van een histologische analyse. Plaats de gereseceerde PDX-tumor in DMEM op ijs.

Was de tumor in vijf milliliter DPBS in een weefselkweekschaal en verwijder de necrotische gebieden als die er zijn. Snijd de tumor in kleine stukjes van twee tot vier millimeter en breng de stukjes over in een buis met dissociatie-oplossing. Gebruik het juiste programma op een dissociator om het weefsel mechanisch te dissociëren en de resulterende celsuspensie door een 70-micrometer celzeef te spannen.

Gebruik 20 milliliter DMEM om eventuele resterende cellen uit de zeef te wassen en de gedissocieerde celsuspensie te centrifugeren. Suspensie vervolgens de cellen en DPBS voor het tellen en pas de cellen aan tot een concentratie van vijf tot 10 keer 10 tot de vierde cellen per één tot twee microliter DPBS. Om het chirurgische gebied voor te bereiden, scheer je de vacht op het hoofd van de muis om de hoofdhuid bloot te leggen.

Plaats de muis vervolgens in een stereotaxisch frame en zet de kop van de muis stevig vast met behulp van oorbalken. Zorg ervoor dat u ook een geschikt pijnstillend middel toedient. Desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende scrubs van povidon-jodium en 70% ethanol.

Maak een longitudinale incisie van vijf tot zeven millimeter om de schedel bloot te leggen en de hoofdhuid in te trekken. Schraap het botvlies af met een tang om de bregma te lokaliseren. Plaats de naald van het stereotactische frame bovenop de bregma en zet de coördinaten op nul.

Beweeg de arm een millimeter naar achteren en een millimeter lateraal naar rechts van de middellijn en markeer deze locatie met een permanente markering. Boor vervolgens een klein braamgat in de schedel op de gemarkeerde locatie en zorg ervoor dat u niet in de hersenen boort. Laad tot vijf microliter 26 gauge Hamilton spuit met een tot twee microliter cellen en bevestig de spuit aan de stereotaxische arm.

Steek de naald langzaam twee millimeter in de hersenen en begin met het injecteren van cellen met de gewenste snelheid. Wanneer alle cellen zijn afgeleverd, trekt u de naald langzaam in, vult u het braamgat met botwas en sluit u de incisie. Plaats de muis terug in zijn kooi met monitoring tot herstel van de anesthesie.

Na het euthanaseren van het dier op het juiste experimentele eindpunt, bevestigt u de aanwezigheid van tumoren in de hersenen door middel van een histologische analyse. Om PDX-tumoren te implanteren door intracardiale injectie, bereidt u de tumorcellen voor zoals aangetoond en plaatst u de verdoofde ontvangende muis in rugligging. Scheer de vacht op de borst van het dier en desinfecteer de blootgestelde huid met povidon-jodium en 70% ethanol.

Trek 0,5 tot 10 keer 10 tot de vijfde tumorcellen en tot 100 microliter DPBS in een spuit uitgerust met een naald van 28 gauge. Lokaliseer de injectieplaats iets links van het borstbeen halverwege tussen de sternale inkeping en het xiphoid-proces. Steek vervolgens de naald verticaal in de muis op de injectieplaats.

Zodra de terugstroom wordt waargenomen, wat wijst op een succesvolle binnenkomst van de naald in de linker ventrikel, geeft u langzaam de tumorsuspensie in de linker ventrikel zonder de naald te bewegen. Wanneer alle cellen zijn afgeleverd, trekt u de naald langzaam en verticaal in en brengt u gedurende ongeveer een minuut een stuk steriel gaas aan op de injectieplaats totdat het bloeden stopt. Laat de muis herstellen op een verwarmde pad met bewaking totdat deze ambulant is.

Identificeer op het juiste experimentele eindpunt metastasen door middel van een obductie en bevestig de aanwezigheid van tumoren in het doelorgaan door middel van een histologische analyse. Ondanks verschillen in de micro-omgeving van de tumor, vertonen de PDX-tumoren vergelijkbare morfologieën met cellen met kleine kernen en schaars cytoplasma, ongeacht de plaats van implantatie. In deze analyse resulteerde de intracardiale injectie van menselijke melanoomcellen in metastasen van de tumorcellen naar de muizenhersenen, terwijl de intracardiale injectie van hersenmetastaserende menselijke kleincellige longkankertumorcellen resulteerde in metastase naar de buikholte en lever van de muis.

Deze protocollen maken het mogelijk om preklinische studies op te zetten voor het testen van nieuwe behandelingen en behandelingscombinaties, en kunnen helpen bij het bestuderen van biologische processen en tumormetastase.