Name: Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Leer een craniotomieprocedure voor chronische in vivo beeldvorming van neuronale activiteit in de dorsale hippocampus van zich gedragende muizen. Deze methode maakt langdurige optische toegang en gerichte toediening van virale vectoren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen alle leden van de Molecular BioEngineering Group van westlake university bedanken voor alle hulp en nuttige discussie. We danken ook Jinze Li en Jie-Min Jia van de Westlake University voor de hulp bij het filmen van de chirurgische ingreep.
Dit werk werd ondersteund door startfinanciering van de Foundation of Westlake University, 2020 BBRF Young Investigator Grant en National Natural Science Foundation of China grant 32050410298 allemaal aan K.D.P.

<ol><li>Leutgeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Codes+for+Spatial+and+Episodic+Memory+in+Hippocampal+Neuronal+Ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles.</a> Science. 309 (5734), 619-623 (2005).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Polanco, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+tau+complexity+-+towards+improved+biomarkers+and+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).</li>
<li>Henneman, W. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+atrophy+rates+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Added+value+over+whole+brain+volume+measures%22%5BJournal%5D)">Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease.</a> Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).</li>
<li>Camicioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+is+associated+with+hippocampal+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy.</a> Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).</li>
<li>Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Engineering+and+Application+of+Optogenetic+Indicators+for+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience.</a> Applied Sciences. 9 (3), 562(2019).</li>
<li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+neural+activity+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population imaging of neural activity in awake behaving mice.</a> Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).</li>
<li>Fan, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-Optical+Electrophysiology+Reveals+the+Role+of+Lateral+Inhibition+in+Sensory+Processing+in+Cortical+Layer+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1.</a> Cell. 180 (3), 521-535 (2020).</li>
<li>Shemesh, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+Calcium+Imaging+of+Dense+Neural+Populations+via+a+Cell-Body-Targeted+Calcium+Indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator.</a> Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).</li>
<li>Villa, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+Synapses+Are+Repeatedly+Assembled+and+Removed+at+Persistent+Sites+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo.</a> Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22Paxinos+and+Franklin%27s+The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , (2013).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).</li>
<li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Genetically+Encoded+Bright+Positive+Calcium+Indicator+NCaMP7+Based+on+the+mNeonGreen+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644(2020).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li>
<li>Roche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+with+a+water+immersion+objective+affects+brain+temperature%2C+blood+flow+and+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation.</a> eLife. 8, 47324(2019).</li>
<li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+8+and+9+in+marmoset%2C+mouse+and+macaque+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex.</a> Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).</li>
<li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastle%2C+MJ+%22Gene+Therapy+for+Neurological+Disorders%3A+Methods+and+Protocols%22">Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols</a>. Manfredssonn, F. P. , Springer. New York. 133-149 (2016).</li>
<li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+hippocampal+activity%2C+plasticity%2C+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li>
<li>Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-endoscopic+system+for+functional+assessment+of+neural+circuits+in+deep+brain+regions%3A+Simultaneous+optical+and+electrical+recordings+of+auditory+responses+in+mouse%27s+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus.</a> Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).</li>
<li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li>
<li>Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+In+Vivo+Imaging+of+Hippocampal+Dendrites+and+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147(2004).</li>
<li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+soluble+amyloid-%CE%B2+for+early+hippocampal+hyperactivity+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical role of soluble amyloid-β for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740(2012).</li>
<li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Consolidation+of+Ensemble+Neural+Plasticity+Patterns+in+Hippocampal+Area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li>
<li>Castello-Waldow, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurons+with+stable+excitatory+connectivity+become+part+of+neuronal+representations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations.</a> PLOS Biology. 18 (11), 3000928(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Hier beschrijven we een methode voor langetermijnbeeldvorming van de hippocampus CA1-regio bij zich gedragende muizen. De methode is gebaseerd op de chronische implantatie van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster, dat ook de gerichte toediening van virussen of geneesmiddelen rechtstreeks aan de betrokken neuronen mogelijk maakt. Het huidige protocol bestaat uit vier belangrijke onderdelen: i) het assembleren van beeldvormend implantaat; ii) installatie van beeldvormend implantaat; iii) virusinjectie via beeldvormend implantaat; iv) functionele beeldvorming bij zich gedragende muizen. Hieronder beschrijven en bespreken we kritieke stappen in het protocol, probleemoplossing, wijzigingen en beperkingen van de methode. We bespreken ook het belang van de methode en de mogelijke alternatieve toepassingen ervan.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het beschreven protocol die vrij belangrijk zijn voor een succesvolle operatie: (i) voorbereiding van een hoogwaardig beeldvormend implantaat; ii) steriele chirurgische aandoeningen; iii) aspiratie van de cortex; iv) nauwkeurige plaatsing van het beeldimplantaat; v) virale injectie. Zoals stap 1.6 aangeeft, zou overtollig soldeerblik een grotere craniotomie vereisen en dus het risico op ontsteking verhogen. Het is ook erg belangrijk om een geschikte hoeveelheid van de zelfklevende optische lijm te gebruiken bij het bevestigen van het afdekglas aan de beeldvormende canule, zoals aangegeven in stap 1.11, omdat een onvoldoende hoeveelheid kan leiden tot lekkage van cerebrospinale vloeistof in de beeldvormende canule en deze ondoorzichtig kan maken. Aan de andere kant kan overtollige optische lijm resulteren in de verminderde transparantie van het glasraam. Mogelijke besmetting van het beeldvormingsimplantaat kan een actieve proliferatie van bindweefsel onder het optische venster en/of ernstige ontsteking veroorzaken, wat zal leiden tot vroegtijdige beëindiging van het experiment. Daarom is het assembleren en voorbereiden van beeldvormende implantaten vóór de operatie bijna net zo belangrijk als de chirurgische procedure zelf.
Tijdens de operatie wordt het deel van de cortex onder craniotomie verzwepen door zachte aspiratie, wat resulteert in onvermijdelijke bloedingen. Bloed op de chirurgische plaats vermindert de zichtbaarheid van het hersenweefsel dat moet worden verwijderd aanzienlijk. Dit bemoeilijkt de nauwkeurige beoordeling van de vereiste diepte van weefselablatie. Zorgvuldig spoelen van de chirurgische site met PBS elke keer voordat u zuiging toepast om het volgende deel van het weefsel te verwijderen, zorgt voor een betere controle van de diepte. Het hersenweefsel moet altijd stap voor stap in kleine porties worden verwijderd om de diepte van het gebldeerde weefsel te bevestigen voordat u verder gaat met meer zuigkracht. Fijnere zuigkracht kan ook worden bereikt met een dunnere stompe naald. We raden aan om een naald van 26 G te gebruiken, maar kleiner dan 26 G diameter is gevoeliger voor verstopping. Bovendien is er meestal veel oefening nodig om de precieze diepte van de aspiratie te bepalen die nodig is voor elk dier, omdat de kleur van de cortex, corpus callosum en hippocampus van muis tot muis kan verschillen (Figuur 3).
Het inbrengen en vastzetten van het beeldvormingsimplantaat moet zeer nauwkeurig worden gedaan om een zo dicht mogelijke positie van het beeldvormingsvenster bij het dorsale oppervlak van de hippocampus te garanderen. De grootte van de voorbereide craniotomie moet nauw overeenkomen met het implantaat en het inbrengen ervan mogelijk maken zonder significante weerstand. Tegelijkertijd mag er geen zichtbare opening zijn tussen de schedel en het implantaat om een goede afdichting te garanderen en blootstelling aan hersenweefsel te voorkomen. Zachte en stabiele druk moet worden uitgeoefend op de bovenkant van het implantaat tijdens de afdichting op de schedel. Het is bijna onvermijdelijk om bloed onder het beeldvormingsvenster te hebben tijdens de installatie van het implantaat. Als de chirurgische procedure goed wordt uitgevoerd, moet het venster binnen 3-7 dagen worden gewist en wordt de vasculatuur van de hersenen duidelijk zichtbaar. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat het virus correct onder het raam wordt geïnjecteerd. In het geval van mislukte expressie kan het virus meerdere keren opnieuw worden geïnjecteerd.
De grootste complicatie die we in sommige gevallen tegenkwamen, is een verminderd zicht op het beeldvenster. Er zijn verschillende mogelijke redenen voor een slechte beeldvormingskwaliteit: i) aanhoudende ontsteking; ii) uitgroei van bindweefsel op het glas; iii) grote opening tussen het raam en hippocampus. Ontsteking wordt meestal veroorzaakt door besmetting tijdens de operatie of door niet goed gesteriliseerd beeldvormingsimplantaat. We raden aan om de chirurgische instrumenten voor en na elke operatie te autoclaafen, het operatiegebied vlak voor de ingreep te desinfecteren en schone persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen tijdens de operatie. Beeldvormende implantaten moeten na montage worden gereinigd, gesteriliseerd en in steriele omstandigheden worden bewaard. De uitgroei van bindweefsel op het glas van beeldvormingsimplantaat kan te wijten zijn aan mechanische verontreiniging op het oppervlak van het glas of overmatig trauma van het hersenweefsel tijdens cortexablatie. Na het monteren van het implantaat is het belangrijk om te bevestigen dat het glasoppervlak schoon en glad is. Ook moeten alle stukjes beschadigd hersenweefsel zorgvuldig worden verwijderd voordat een beeldvormend implantaat in de craniotomie wordt geplaatst. In bepaalde gevallen resulteert de opening tussen het glazen raam en hippocampus in de ophoping van cerebrospinale vloeistof, waardoor de kwaliteit van de beeldvorming wordt verminderd. Daarom is het tijdens de installatie van implantaten cruciaal om het helemaal in te voegen om een goed contact tussen hippocampus en glasraam te garanderen. Soms is het moeilijk om de exacte reden voor ondoorzichtig beeldvenster te identificeren. We stellen voor om postmortale analyse uit te voeren om de omstandigheden onder het optische venster te onthullen en de daaropvolgende operaties dienovereenkomstig aan te passen.
De methode heeft verschillende fundamentele en technische beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden voor en tijdens in vivo beeldvorming. Een van de belangrijkste beperkingen is cortex ablatie. Een deel van de visuele en sensorische cortex wordt tijdens de operatie verwijderd. Hoewel het moeilijk is om de impact van cortexablatie nauwkeurig te evalueren, omdat verwijderd hersenweefsel niet direct op hippocampus projecteert, toonden verschillende studies geen merkbare stoornis van hippocampaal-afhankelijk leren of andere relevante hippocampusfuncties15,16aan . Er moet ook rekening worden gehouden met de optische beperkingen, vooral wanneer objectieve lenzen met een hoge NA-doelstelling worden gebruikt. In deze studie gebruikten we bijvoorbeeld een 1,75 mm lange canule met een binnendiameter van 1,9 mm. De geometrie van deze canule zal niet de volledige NA van luchtdoelstelling met NA meer dan ~0.5 of waterdoelstelling met NA meer dan ~0.6 bewaren aangezien het wat van licht zal knippen. Een andere beperking, gebruikelijk voor alle hersenbeeldsimplantaten, is dat een deel van de hersenen wordt blootgesteld, waardoor warmteverlies17,18wordtbevorderd . Fysiologische hersentemperatuur kan echter gemakkelijk worden hersteld tijdens beeldvorming door perfusie van een warme buffer.
De beschreven methode kan eenvoudig worden aangepast of aangepast voor andere toepassingen. Het preparaat kan bijvoorbeeld worden aangepast voor beeldvorming van striatum7. Omdat het striatum iets dieper ligt dan hippocampus, moet de langere beeldvormingsconule worden gebruikt voor het assembleren van beeldvormend implantaat. We raden aan om 2,0 mm beeldvormende canule te gebruiken. De coördinaten van de craniotomie moeten dienovereenkomstig worden aangepast (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Bovendien maakt virusinjectie via infusie canule het mogelijk om de expressie van een transgeen in een dunne laag neuronen te bereiken bij gebruik van AAV-serotype met beperkte verspreiding19,20. Het is vooral gunstig voor beeldvorming met één foton als gevolg van verminderde fluorescentie buiten de focus van diepere lagen en, als gevolg daarvan, verbeterde beeldvorming met een enkele celresolutie. Bovendien kan injectie canule ook worden gebruikt tijdens functionele beeldvorming voor de toediening van geneesmiddelen of andere chemicaliën rechtstreeks op de neuronen in FOV (Figuur 5B). Algehele infusie canule voegt nuttige functionaliteiten toe aan het beeldvormingsimplantaat, verbetert de beeldkwaliteit vanwege de gerichte virale expressie en maakt farmacologische stimulatie van neuronen in FOV mogelijk. De gebruikte hoofdplaat biedt buitengewone stabiliteit van beeldvormingsimplantaten die bewegingsartefacten minimaliseren, zelfs bij actief bewegende dieren op een loopband. De kopplaat is klein en licht, veroorzaakt minimaal ongemak voor dieren en blijft enkele maanden na installatie stabiel. Het beeldvormende implantaat is ook compatibel met multifotonen beeldvorming15,16,21 en kan worden gecombineerd met micro-endoscopen22,23. Een soortgelijk beeldvormingsimplantaat werd ook gebruikt voor multifotonen beeldvorming van de diepere hippocampusstructuren, waaronder stratum radiatum, stratum lacunose en dentate gyrus16,24,25,26,27. Het richten van de diepere hippocampusstructuren met AAV's via infusie canule kan echter verdere optimalisatie van het AAV-serotype en volume19vereisen.
We geloven dat het beschreven protocol studies zal vergemakkelijken die gericht zijn op het onderzoeken van neuronale activiteit met een hoge spatiotemporale resolutie in de hippocampus van zich gedragende muizen met behulp van eenvoudige en betaalbare beeldvormingsopstellingen met één foton.

De hippocampus is een belangrijk hersengebied dat verantwoordelijk is voor leren en geheugen1 en voor ruimtelijke navigatie2. Hippocampale atrofie wordt geassocieerd met neurologische en psychiatrische aandoeningen met geheugenverlies en cognitieve achteruitgang3,4,5. Bij muizen is de hippocampus een zeer bekend model om ruimtelijk, contextueel en associatief leren en geheugenvorming te bestuderen op cellulaire en netwerkniveaus4,5. De mechanistische studies van leren en geheugen vereisen longitudinale ondervraging van neuronale structuur en functie bij zich gedragende muizen. Fluorescentiebeeldvorming in combinatie met genetisch gecodeerde sondes6 biedt ongekende mogelijkheden om membraanspanningsdynamiek7,8, calciumtransiënten9en structurele veranderingen10 over grote subsets van neuronen intravitaal vast te leggen. Optische toegang tot de hippocampus bij muizen wordt echter belemmerd door de cortex, die meer dan 1 mm dik kan worden. Hier beschreven we een procedure voor het assembleren van een op maat gemaakt beeldvormingsapparaat en de chronische implantatie ervan in de muiskop voor langdurige optische toegang tot de CA1-subregio van de dorsale hippocampus bij zich gedragende muizen. Infusie canule geïntegreerd in het beeldimplantaat maakt toediening van virussen of geneesmiddelen rechtstreeks op de neuronen in het gezichtsveld mogelijk. Het beschreven preparaat in combinatie met wide-field microscopie maakt terugkerende beeldvorming van de grote subsets van neuronen in zich gedragende muizen over lange perioden mogelijk. We gebruikten dit preparaat om calcium- en spannings genetisch gecodeerde indicatoren in hippocampaal CA1-gebied uit te drukken via gerichte injectie van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) voor neuronale activiteitsopnamen bij eencellige resolutie. We voerden ook longitudinale calciumbeeldvorming uit van de overeenkomstige neuronale subsets bij een hoge spatiotemporale resolutie bij zich gedragende dieren. Bovendien is dit preparaat compatibel met multifotonenmicroscopie en micro-endoscopie, waardoor de toolbox van beeldvormingstechnieken verder wordt uitgebreid om neuronale netwerken op cellulaire en subcellulaire niveaus bij zich gedragende muizen te bestuderen. We beschreven kritieke stappen en probleemoplossing van het protocol. We bespraken ook de mogelijke valkuilen en beperkingen van de methode.

<table><tbody><tr><td>Cover glass</td><td>Deckgl&auml;ser</td><td>72296-03</td><td></td></tr><tr><td>Denture&nbsp;Base Resin</td><td>ShangHai New Centery Dentel Material</td><td>N/A</td><td>Type I, zelfverhardend</td></tr><tr><td>Dummy Cannula</td><td>RWD Life Science Co.,LTD</td><td>62102</td><td>OD 0.30mm</td></tr><tr><td>Guide Cannula</td><td>RWD Life Science Co.,LTD</td><td>62003</td><td>26G</td></tr><tr><td>Head Fork</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Head Plate</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Imaging Cannula</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt; OD 3mm, ID 2.7mm, Hoogte 1.8mm, #108 roestvrij staal</td></tr><tr><td>Internal Cannula</td><td>RWD Life Science Co.,LTD</td><td>62203</td><td>&nbsp;0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td></tr><tr><td>Kwik Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>SuperBond C&amp;B</td><td>SUN MEDICAL</td><td>N/A</td><td>SuperBond C&amp;B kit</td></tr><tr><td>Treadmill Kit</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>UV-cured Adhesive</td><td>NORLAND PRODUCTS</td><td>NOA 60</td><td></td></tr></tbody></table>

craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in hippocampus van zich gedragende muizen

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Beeldvorming neuronale activiteiten bij eencellige resolutie bij wakkere zich gedragende dieren is een zeer krachtige benadering voor het onderzoek van neurale circuitfuncties in de neurowetenschappen van systemen. Echter, hoge absorptie en verstrooiing van licht in zoogdierweefsel beperken intravitale beeldvorming meestal tot oppervlakkige hersengebieden, waardoor diepe hersengebieden, zoals de hippocampus, buiten bereik blijven voor optische microscopie. In deze video laten we de voorbereiding en implantatie van het op maat gemaakte beeldvormingsvenster zien om chronische in vivo beeldvorming van het dorsale hippocampale CA1-gebied in head-fixed behaving muizen mogelijk te maken. Het op maat gemaakte venster wordt aangevuld met een infuuskanule die gerichte levering van virale vectoren en geneesmiddelen aan het beeldvormingsgebied mogelijk maakt. Door dit preparaat te combineren met wide-field imaging, voerden we een langetermijnregistratie uit van neuronale activiteit met behulp van een fluorescerende calciumindicator van grote subsets van neuronen bij zich gedragende muizen gedurende meerdere weken. We hebben ook de toepasbaarheid van dit preparaat voor spanningsbeeldvorming met single-spike resolutie aangetoond. Hoogwaardige genetisch gecodeerde indicatoren van neuronale activiteit en wetenschappelijke CMOS-camera's maakten de terugkerende visualisatie van subcellulaire morfologische details van afzonderlijke neuronen met een hoge temporele resolutie mogelijk. We bespreken ook de voordelen en mogelijke beperkingen van de beschreven methode en de compatibiliteit ervan met andere beeldvormingstechnieken.

In vivo beeldvorming van neuronale activiteit met behulp van een genetisch gecodeerde calciumindicator. Gemiddeld begint in vivo beeldvorming 3-4 weken na implantatie als een voldoende niveau van transgene expressie wordt bereikt. Tegen die tijd zijn hersenoedeem en bloeding meestal volledig verdwenen en kan vasculatuur van de hersenen gemakkelijk worden waargenomen door het optische venster. Hier gebruikten we de beschreven voorbereiding om de herhaalde opnames van neuronale activiteit in het dorsale hippocampale CA1-gebied uit te voeren bij het gedragen van muizen onder fluorescentie-breedveldmicroscoop. Om neuronale activiteit vast te leggen, gebruikten we een heldere genetisch gecodeerde calciumindicator, genaamd NCaMP713, die vergelijkbare calciumgevoeligheid en temporele resolutie vertoont als die van GCaMP6s14. Om de NCaMP7-indicator in de hippocampus uit te drukken, injecteerden we het rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-virus met behulp van een infuuskanule en startten we de beeldvorming van de lengtegraad na 14 dagen na de injectie. Om neuronale activiteit vast te leggen, gebruikten we een 10x NA 0.3 lucht objectieflens en Hamamatsu OrcaFusion sCMOS camera die beeldvorming mogelijk maakte bij ~1,5x1,5 mm FOV bij een frequentie tot 100 Hz. Groene fluorescentie werd opgewekt door een in de handel verkrijgde 470 nm LED met behulp van een standaard GFP-filterset. De gemiddelde diepte van beeldvorming bereikt in groen kanaal is ongeveer 50-120 μm, waardoor opname van neuronale activiteit voornamelijk in stratum oriens en stratum pyramidale mogelijk is. Beelddiepte in bijna-infraroodkanalen kan tot 200 μm zijn en de diepere lagen hippocampusbereiken 8. De gemiddelde opnametijd per FOV was 6-12 min, hoewel veel langere beeldvormingssessies mogelijk zijn omdat NCaMP7 wordt gekenmerkt door extreem hoge fotostabiliteit en er geen detecteerbare fototoxiciteit werd waargenomen (Figuur 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg"> Figuur 6: Registratie van de neuronale activiteit in de hippocampale neuronen met behulp van een groene fluorescentie genetisch gecodeerde calciumindicator. (A) Een geselecteerde FOV afgebeeld onder een breedveldfluorescentiemicroscoop in groen kanaal. (B) De 15 URI's die overeenkomen met de afzonderlijke neuronen die in A worden weergegeven en geselecteerd met behulp van de standaarddeviatieprojectie van de gehele opname. (C) Representatieve fluorescentie single-trial sporen van de 15 geselecteerde neuronen in B. (D) Een representatieve inzoomweergave van 2 calciumsporen weergegeven in overeenkomstige kleurvakken weergegeven in C. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">te bekijken.</a>
Om fluorescentiesporen te verkrijgen, werden de regio's van belang (ROIs) die overeenkomen met neuronale soma's handmatig gesegmenteerd en geanalyseerd door ImageJ-software. Voorafgaand aan de bewegingscorrectie van de beeldanalyse waren veel voorkomende procedures na opname bij wakkere dieren niet vereist, omdat de verworven datasets geen bewegingsartefacten vertoonden vanwege de hoge stabiliteit van beeldimplantaten. Een representatieve optische opname in één proef van neuronale activiteiten van de hippocampus in een wakkere scheermuis wordt gepresenteerd in figuur 6. 15 ROIs die overeenkomen met neuronale soma 's werden handmatig geselecteerd uit dezelfde FOV in figuur 6B, en de fluorescentiesporen in één studie binnen elke ROI zijn weergegeven in figuur 6C. Figuur 6D toont twee representatieve delen van fluorescentiesporen van twee verschillende ROV's. We voerden 4 opeenvolgende beeldvormingssessies uit voor dezelfde FOV met intervallen van 3 dagen. Het was mogelijk om dezelfde neuronen in bepaalde FOV's gedurende ten minste twee weken te identificeren en in beeld te brengen (de langere beeldvormingssessies werden niet uitgevoerd voor deze studie, maar hetzelfde preparaat is gebruikt voor maximaal 6 maanden durende beeldvormingsstudie bij muizen voorheen7; Figuur 7). In deze studie gebruikten we AAV/ DJ-CAG-vector, die zelfs 21 dagen na de levering van het virus een sterke expressie van het interesse gen aandreef (Aanvullende figuur 1). De continue expressie gecompliceerde langetermijnidentificatie van dezelfde neuronen als gevolg van verhoogde fluorescentieachtergrond en uiterlijk van nieuwe neuronen die de calciumindicator uitdrukken. Daarom moet de selectie van het AAV-serotype en de promotor om de expressie van doelgen te stimuleren een van de belangrijke overwegingen zijn bij het experimentele ontwerp, met name als longitudinale beeldvorming van dezelfde subset van neuronen vereist is. De beeldvormingskwaliteit maakte het mogelijk om proximale dendrieten op te lossen en bloedvaten te visualiseren.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg"> Figuur 7: Beeldsequentie van vier verschillende FOV's uit het hippocampale gebied die gedurende 12 dagen worden gevolgd. Het dier werd op dag 0 met het raam geïmplanteerd en op dag 7 geïnjecteerd met het rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-virus. Pijlpunten geven het neuron aan dat binnen de FOV wordt gevolgd. Schaalbalken: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
In vivo beeldvorming van neuronale activiteit met behulp van een genetisch gecodeerde spanningssensor. In deze studie gebruikten we ook een nieuwe genetisch gecodeerde spanningssensor, genaamd SomArchon7, die spanningsbeeldvorming met eencellige single-spike resolutie mogelijk maakt bij het gedragen van dieren7,8. Om SomArchon uit te drukken, injecteerden we het rAAV/DJ-CAG-SomArchon-virus met behulp van een infuuskanule en voerden we enkele dagen na de injectie spanningsbeeldvorming uit in een hoofd-vaste scheermuis. Om neuronale activiteit vast te leggen, gebruikten we een 40x NA 0.8 objectieve lens en Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-camera waarmee we 150x40 μm FOV konden afbeelden met een acquisitiesnelheid tot 830 Hz. Het GFP-eiwit, dat een deel van SomArchon construeert om visualisatie van expressie in het zichtbare bereik van het spectrum te vergemakkelijken, kan gemakkelijk worden afgebeeld in het groene kanaal (LED-excitatie bij 470/20 nm, emissie 525/50 nm) om cellen te lokaliseren die van belang zijn voor spanningsbeeldvorming. Optische spanningsopnamen werden uitgevoerd in het bijna-infraroodkanaal (laser excitatie 637 nm bij 3,4 W/mm2, emissie 665 nm lange pas) met 4 x 4 binning bij 830 Hz acquisitiesnelheid. We registreerden de spontane activiteit van een hippocampaal neuron in een wakkere muis met een gemiddelde SNR van 7 per actiepotentiaal (Figuur 8). 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg"> Figuur 8: Registratie van de neuronale activiteit in de hippocampale neuronen met behulp van een bijna-infrarood fluorescentie genetisch gecodeerde spanningsindicator SomArchon. (A) Een geselecteerde FOV afgebeeld onder breedveldfluorescentiemicroscoop in het bijna-infraroodkanaal. (B) Single-trial fluorescentiespoor van het neuron in A. (C) Een representatief inzoombeeld van het spanningsspoor in het overeenkomstige vak weergegeven in B. Schaalbalk: 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">te bekijken.</a>
histologie Nadat functionele beeldvormingsstudie is uitgevoerd, wordt postmortale analyse gebruikt om de juiste plaatsing van het implantaat, het gebied van virusexpressie en lokalisatie van een eiwit dat van belang is in afgebeelde neuronen te bevestigen. Voor histologische verificatie van virusexpressie en plaatsing van het implantaat werden coronale delen van de PFA-vaste hersenen onderzocht onder een fluorescentie-grootveldmicroscoop (figuur 9A, C). Een confocale microscoop werd gebruikt om beelden in hoge resolutie te verkrijgen van individuele neuronen die de calciumindicator uitdrukken, evenals de spanningsindicator (figuur 9B, D). DAPI-kleuring werd gebruikt om de algehele morfologie van de hersenschijf te visualiseren. Bovendien kunnen de hersensegmenten worden beoordeeld met behulp van immunohistochmie om astrogliose of gliose veroorzaakt door raamimplantatie en virale expressie te verifiëren. Onze eerdere studies toonden aan dat de procedure geen merkbare gliosisinduceerde 7.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg"> Figuur 9: Histologische verificatie van de optische vensterpositie en virusexpressie. (A) Een representatief fluorescerend beeld van de hersenschijf van de coronale sectie met de plaatsing van het optische venster van een NCaMP-uitdrukkende muis. Schaalbalk: 1 mm. (B) Een representatief confocaal beeld van neuronen die de NCaMP7-indicatoren uitdrukken. Schaalbalk: 25 μm. (C) Een representatief fluorescentiebeeld van de hersenschijf van de coronale sectie met de plaatsing van het optische venster van een SomArchon-uitdrukkende muis. Schaalbalk: 1 mm. (D) Een representatief confocaal beeld van neuronen die de SomArchon-indicatoren uitdrukken. Schaalbalk: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Aanvullend figuur 1: Kwantitatieve analyse van de relatieve fluorescentie-intensiteit samen met de expressietijd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit artikel demonstreert de voorbereiding van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster aangevuld met infusiekanule en de implantatie ervan op het CA1-gebied van de hippocampus bij muizen.

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Mijn naam is Wang Yangdong en ik ben van dr. Kiryl Piatkevich moleculair bio-engineering lab aan de Westlake Universiteit. Vandaag laat ik je de procedure zien voor het in beeld brengen van neuronale activiteiten van hippocampus bij muizen, in vivo. Schakel het lasapparaat in en verwarm het tot de gewenste temperatuur.Pas de positie van de beeldvormende canule en de injectiekanule aan met behulp van helpende handen zoals weergegeven in de afbeelding. Breng met behulp van de spuit met de naald gedurende vijf seconden een kleine hoeveelheid geschikte flux aan op de verbindingsplekken tussen beeldvorming en het injecteren van canule en verwijder vervolgens de druppel. Monteer het soldeerblik en breng het aan op de verbindingsplek die met de flux is behandeld.Vermijd overtollig soldeerblik omdat het onnodige grotere schedel nodig heeft om tijdens de operatie te maken. Wacht tot het soldeerblik is afgekoeld. Meestal duurt het enkele seconden.Controleer of de injectiekanule niet wordt geblokkeerd door de dummy canule uit beide richtingen in te brengen. Breng UV-uithardende optische lijm aan de onderkant van de beeldvormende canule aan met behulp van een tandenstoker of 26-gauge spuitnaald. Gebruik een fijn pincet om voorzichtig een afdekglas van de overeenkomstige grootte aan de beeldvormende canule te plaatsen.Hard de lijm minstens een uur uit door UV-verlichting van een standaard handheld UV-lamp. Verdoof de muis met isofluraan volgens de door de IACUC goedgekeurde procedure. Plaats de muis in een stereotaxisch frame over een operatiekussen.Zet het hoofd vast met oorstangen. Duw het hoofd lichtjes in alle richtingen om ervoor te zorgen dat het hoofd stevig is vastgezet. Breng oogzalf aan om te voorkomen dat de ogen van het dier uitdrogen tijdens de operatie.Gebruik een trimmer of ontharingscrème om de vacht van de achterkant van de nek tot aan de ogen te verwijderen. Steriliseer de chirurgische site met betadine gevolgd door 70% ethanol drie keer voordat u een incisie maakt. Verwijder de huid over de bovenkant van de schedel, te beginnen met de horizontale snede rondom de basis van het hoofd, gevolgd door twee sneden in de rostrale richting, die bijna de oogleden bereiken.Dan twee schuine sneden die samenkomen in de middellijn. Trek met twee steriele wattenstaafjes het verbindingsweefsel en het spierstelsel van de achterkant van de nek naar de randen van de schedel. Breng gedurende twee minuten een druppel lidocaïne-oplossing aan op het oppervlak van het periosteum om overmatige pijn te voorkomen.Schraap voorzichtig het hele blootgestelde deel van de schedel met een scalpel om een droog en ruw oppervlak te creëren. Plaats de punt van de naald op de Lambda om te zien of de AP-coördinaat nul is om te bevestigen dat de hoofdpositie verticaal is en of de ML-coördinaat nul is, om te bevestigen dat de kop horizontaal is geplaatst. Zo niet, stel dan de correspondentknoppen op het stereotaxic-station in totdat de AP- en ML-coördinaten beide binnen 0,1 millimeter liggen.Beweeg de punt van de naald om de overeenkomstige punten voor craniotomie te vinden en markeer hun posities op de schedel met behulp van een fijne marker. Teken een cirkel op basis van vier gemarkeerde punten, evenals de omtrek van het injectiekanulegebied aan de canulezijde van de cirkel. Gebruik een pneumatische boor met een snelheid van 10.000 kogels per minuut om voorzichtig langs de omtrek op de schedel te boren.Boor de schedel totdat er een zeer dunne laag bot overblijft, die meestal begint te wiebelen onder zachte aanraking in het midden. Breng een druppel steriel PBS aan op het midden van de craniotomie. Til de botflap van de schedel met een zeer dunne tang of twee 26-gauge naalden die het van de andere kant naderen.Breng PBS aan, gevolgd door zachte aspiraties, meerdere keren door een stompe naald van 26 gauge om het oppervlak van de dura te reinigen. Breng zachte zuigkracht aan om de cortex en het Corpus Callosum boven de hippocampus te ablaten. Cortex is vaak geeler dan het Corpus Callosum.En het Corpus Callosum is meestal breder dan de hippocampus. Bovendien is het Corpus Callosum heel gemakkelijk te onderscheiden door neuronale vezels die in verticale en horizontale richtingen gaan wanneer ze van bovenaf worden waargenomen. Bloedingen op dit punt zullen de zichtbaarheid van het hersenweefsel in de craniotomie beïnvloeden.Breng PBS aan, gevolgd door zachte zuigkracht, terwijl je de cortex aspireert om van het bloed af te komen, is Corpus Callosum te herkennen aan de richting van de witte vezels zoals schematisch weergegeven in het diagram. Verwijder Corpus Callosum vezels laag voor laag door zachte zuiging aan te brengen in een cirkelvormige beweging. PBS wordt voortdurend toegepast om zich te ontdoen van bloed dat zich ophoopt boven blootgesteld hersenweefsel.Plaats het implantaat voorzichtig in de craniotomie. Druk stevig op het implantaat met de L-vormige naald om het optische venster van het implantaat zo dicht mogelijk bij het blootgestelde oppervlak van de hippocampus te plaatsen. Breng pbs herhaaldelijk aan op het litteken rond het implantaat, gevolgd door afzuiging om bloed zoveel mogelijk te verwijderen tijdens het inbrengen van het implantaat.Breng een dunne laag snelle afdichting aan tussen het implantaat en de schedel om te voorkomen dat tandcement onder de schedel doordringt. Zodra de snelle afdichting is uitgehard, breng je superbinding gelijkmatig aan op het oppervlak van de schedel, het oppervlak van de snelle afdichting en het oppervlak van het implantaat. Zodra de superbinding is genezen, breng je kunstgebitbasishars boven superbinding aan, evenals de huid rond de incisie die aan het begin van de operatie is gemaakt.Nadat de basishars van het kunstgebit is uitgehard, plaatst u de hoofdplaat op de hars rond het implantaat en laat u deze concentreren met de beeldvormende canule. Breng meer kunstgebitbasishars rond en boven de hoofdplaat aan om de positie te bevestigen. Laat het enkele minuten uitharden.Vermijd het opbouwen van een dikke laag cement rond de canule om een betere toegang tot het beeldvenster te garanderen is de objectieve lens. Verdun de basishars van het kunstgebit om de viscositeit te verminderen, waardoor het de holtes kan vullen die moeilijk te bereiken zijn met een applicator. Plaats voorzichtig een geïsoleerde rubberen tape boven het raam om het raam te beschermen tegen mogelijke verontreiniging door dierbanden.Voeg Fast Green kleurstofvoorraadoplossing toe aan virusoplossing verdun het tot de gewenste titer in de verhouding van één tot negen, in een PCR-buis. Trek 600 nano liter van de virusoplossing terug, verwijder de dummy canule en plaats de interne canule die op de injectiespuit in de geleidekanule zit. Infuseer het virus met een snelheid van 15 nano liter per minuut, in totaal 10 minuten.Houd de interne canule 10 minuten verbonden zodat het virus zich onder het venster kan verspreiden. Verwijder voorzichtig de interne canule van de geleidekanule en vat deze samen met de dummy canule. Induceer de muis met 4%isofluraan gedurende een paar minuten.Bevestig de kopplaat aan de kopvork en bevestig vervolgens de kopvork aan de loopband. Gebruik een lens met een lage vergrotingsdoelstelling om de beste filterweergave te vinden voor functionele beeldvorming. Schakel vervolgens over naar een lens met een hogere doelstelling om de neuronale activiteiten bij een enkele celresolutie op te nemen.Voor calciumbeeldvorming werd groene fluorescerende opgewekt door een in de handel verkrijgbare LED van 470 nanometer met behulp van een standaard GFP-filterzin. Om fluorescerende sporen te verkrijgen, werden de interessegebieden, die overeenkomen met neuronale celmassa, handmatig gesegmenteerd en geanalyseerd door ImageJ-software. Voor spanningsbeeldvorming met behulp van een 40 X lens werden optische spanningsopnamen uitgevoerd in het nabije infraroodkanaal met 830 Hertz-acquisitiesnelheden.Spontane neurale activiteitsopname duurde continu tot 25.000 frames. Hier beschrijven we een methode voor langetermijnbeeldvorming van de hippocampus als een A1-gebied bij zich gedragende muizen. De methode is gebaseerd op de chronische implantatie.Nu het op maat gemaakte beeldvormingsvenster, dat ook de gerichte toediening van virussen of geneesmiddelen rechtstreeks aan de betrokken neuronen mogelijk maakt. We geloven dat het beschreven protocol de studies zal vergemakkelijken die gericht zijn op het onderzoeken van neuronale activiteit met een hoge ruimtelijke temporele resolutie in de hippocampus van zich gedragende muizen met behulp van eenvoudige en betaalbare 1-foton beeldvorming opstellingen.

craniotomy-procedure-for-visualizing-neuronal-activities-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video en protocol laten zien hoe je een met glas overdekt craniale venster in knaagdieren implantaat. Deze preparaten kunnen worden gebruikt voor chronische in vivo twee-foton beeldvorming van de neocortex loop van de tijd schalen van maanden. Het kan ook worden gebruikt voor andere vormen van beeldvorming, met inbegrip van optische intrinsieke signaal beeldvorming.

Een craniotomie chirurgische ingreep voor chronische Brain Imaging

We hebben een in vitro ongevouwen hippocampus die CA1-CA3 reeks van neuronen behoudt ontwikkeld. Gecombineerd met de penetrerende micro elektrode-array, kunnen neurale activiteit worden gevolgd in zowel de longitudinale als transversale richtingen. Deze werkwijze verschaft voordelen boven hippocampus slice preparaat als voortplanting in de gehele hippocampus gelijktijdig kunnen worden opgenomen.

Neurale activiteit Voortplanting in een Uitgeklapt hippocampus Voorbereiding met een doordringende micro elektrode-array

Dit protocol geeft een methode waarbij een grote unilaterale craniotomie via temporale en pariëtale gebieden van het muizen cerebrale cortex. Dit is vooral handig voor real-time beeldvorming over een uitgestrekt gebied van een corticale halfrond.

Een grote laterale kraniotomie procedure voor mesoscale breedbeeld optische beeldvorming van hersenactiviteit

Terwijl multifotonenbeeldvorming alleen effectief is op beperkte diepten van het weefseloppervlak, is het mogelijk om via pCLE op elke diepte beeldvorming met een resolutie van 3 μm te bereiken. Hier presenteren we een protocol om pCLE-beeldvorming uit te voeren om de microvasculaire dynamiek in de hippocampus van ictale en wildtype muizen te meten.

In vivo vezelgekoppelde preklinische confocale laserscanning-endomicroscopie (pCLE) van hippocampuscapillairen bij wakkere muizen

Dit protocol beschrijft de opname van het lokale veld potentieel met multi schacht lineaire silicon sondes. Conversie van de signalen met behulp van de huidige Bronanalyse dichtheid kan de wederopbouw van lokale elektrische activiteit in de hippocampus muis. Met deze techniek, kunnen ruimtelijk beperkte hersenen oscillaties in vrij bewegende muizen bestudeerd worden.

Opname ruimtelijk beperkte schommelingen in de Hippocampus gedragen muizen

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

We gebruikten opname-en stimulatie elektroden in longitudinale hippocampal hersen schijfjes en longitudinaal geplaatste opname-en stimulatie elektroden in de rugzijde Hippocampus in vivo om extracellulaire postsynaptische potentialen aan te roepen en te demonstreren op lange termijn synaptische plasticiteit langs de longitudinale interlamellar CA1.

Onderzoek op lange termijn synaptische plasticiteit in Interlamellar Hippocampus CA1 door elektrofysiologische veld opname

Het huidige protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het traceren van ventrale tegmentale gebied (VTA) glutamaatprojecties naar de hippocampus. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen werd gecombineerd met CA1-opname om aan te tonen hoe VTA-glutamaatterminals ca1-putatieve piramidale vuursnelheid in vivo moduleren.

Gecombineerde In Vivo anatomische en functionele tracing van Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in de Hippocampus

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Hier presenteren we twee protocollen voor de registratie van micro-elektrocorticografie met hoge dichtheid (μEcoG) bij ratten en muizen, inclusief chirurgische, implantatie- en registratiemethoden. μECoG-opnames worden uitgevoerd in combinatie met laminaire polytrode-opname in de auditieve cortex van de rat of met optogenetische manipulatie van neurale activiteit in de somatosensorische cortex van de muis.

Multischaalonderzoek van corticale verwerking door integratie van laminaire polytrodes en optogenetica met micro-elektrocorticografie bij knaagdieren

Leer een craniotomieprocedure voor chronische in vivo beeldvorming van neuronale activiteit in de dorsale hippocampus van zich gedragende muizen. Deze methode maakt langdurige optische toegang en gerichte toediening van virale vectoren mogelijk.

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Meer video's verkennen