Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Mijn naam is Wang Yangdong en ik ben van dr. Kiryl Piatkevich moleculair bio-engineering lab aan de Westlake Universiteit. Vandaag laat ik je de procedure zien voor het in beeld brengen van neuronale activiteiten van hippocampus bij muizen, in vivo. Schakel het lasapparaat in en verwarm het tot de gewenste temperatuur.

Pas de positie van de beeldvormende canule en de injectiekanule aan met behulp van helpende handen zoals weergegeven in de afbeelding. Breng met behulp van de spuit met de naald gedurende vijf seconden een kleine hoeveelheid geschikte flux aan op de verbindingsplekken tussen beeldvorming en het injecteren van canule en verwijder vervolgens de druppel. Monteer het soldeerblik en breng het aan op de verbindingsplek die met de flux is behandeld.

Vermijd overtollig soldeerblik omdat het onnodige grotere schedel nodig heeft om tijdens de operatie te maken. Wacht tot het soldeerblik is afgekoeld. Meestal duurt het enkele seconden.

Controleer of de injectiekanule niet wordt geblokkeerd door de dummy canule uit beide richtingen in te brengen. Breng UV-uithardende optische lijm aan de onderkant van de beeldvormende canule aan met behulp van een tandenstoker of 26-gauge spuitnaald. Gebruik een fijn pincet om voorzichtig een afdekglas van de overeenkomstige grootte aan de beeldvormende canule te plaatsen.

Hard de lijm minstens een uur uit door UV-verlichting van een standaard handheld UV-lamp. Verdoof de muis met isofluraan volgens de door de IACUC goedgekeurde procedure. Plaats de muis in een stereotaxisch frame over een operatiekussen.

Zet het hoofd vast met oorstangen. Duw het hoofd lichtjes in alle richtingen om ervoor te zorgen dat het hoofd stevig is vastgezet. Breng oogzalf aan om te voorkomen dat de ogen van het dier uitdrogen tijdens de operatie.

Gebruik een trimmer of ontharingscrème om de vacht van de achterkant van de nek tot aan de ogen te verwijderen. Steriliseer de chirurgische site met betadine gevolgd door 70% ethanol drie keer voordat u een incisie maakt. Verwijder de huid over de bovenkant van de schedel, te beginnen met de horizontale snede rondom de basis van het hoofd, gevolgd door twee sneden in de rostrale richting, die bijna de oogleden bereiken.

Dan twee schuine sneden die samenkomen in de middellijn. Trek met twee steriele wattenstaafjes het verbindingsweefsel en het spierstelsel van de achterkant van de nek naar de randen van de schedel. Breng gedurende twee minuten een druppel lidocaïne-oplossing aan op het oppervlak van het periosteum om overmatige pijn te voorkomen.

Schraap voorzichtig het hele blootgestelde deel van de schedel met een scalpel om een droog en ruw oppervlak te creëren. Plaats de punt van de naald op de Lambda om te zien of de AP-coördinaat nul is om te bevestigen dat de hoofdpositie verticaal is en of de ML-coördinaat nul is, om te bevestigen dat de kop horizontaal is geplaatst. Zo niet, stel dan de correspondentknoppen op het stereotaxic-station in totdat de AP- en ML-coördinaten beide binnen 0,1 millimeter liggen.

Beweeg de punt van de naald om de overeenkomstige punten voor craniotomie te vinden en markeer hun posities op de schedel met behulp van een fijne marker. Teken een cirkel op basis van vier gemarkeerde punten, evenals de omtrek van het injectiekanulegebied aan de canulezijde van de cirkel. Gebruik een pneumatische boor met een snelheid van 10.000 kogels per minuut om voorzichtig langs de omtrek op de schedel te boren.

Boor de schedel totdat er een zeer dunne laag bot overblijft, die meestal begint te wiebelen onder zachte aanraking in het midden. Breng een druppel steriel PBS aan op het midden van de craniotomie. Til de botflap van de schedel met een zeer dunne tang of twee 26-gauge naalden die het van de andere kant naderen.

Breng PBS aan, gevolgd door zachte aspiraties, meerdere keren door een stompe naald van 26 gauge om het oppervlak van de dura te reinigen. Breng zachte zuigkracht aan om de cortex en het Corpus Callosum boven de hippocampus te ablaten. Cortex is vaak geeler dan het Corpus Callosum.

En het Corpus Callosum is meestal breder dan de hippocampus. Bovendien is het Corpus Callosum heel gemakkelijk te onderscheiden door neuronale vezels die in verticale en horizontale richtingen gaan wanneer ze van bovenaf worden waargenomen. Bloedingen op dit punt zullen de zichtbaarheid van het hersenweefsel in de craniotomie beïnvloeden.

Breng PBS aan, gevolgd door zachte zuigkracht, terwijl je de cortex aspireert om van het bloed af te komen, is Corpus Callosum te herkennen aan de richting van de witte vezels zoals schematisch weergegeven in het diagram. Verwijder Corpus Callosum vezels laag voor laag door zachte zuiging aan te brengen in een cirkelvormige beweging. PBS wordt voortdurend toegepast om zich te ontdoen van bloed dat zich ophoopt boven blootgesteld hersenweefsel.

Plaats het implantaat voorzichtig in de craniotomie. Druk stevig op het implantaat met de L-vormige naald om het optische venster van het implantaat zo dicht mogelijk bij het blootgestelde oppervlak van de hippocampus te plaatsen. Breng pbs herhaaldelijk aan op het litteken rond het implantaat, gevolgd door afzuiging om bloed zoveel mogelijk te verwijderen tijdens het inbrengen van het implantaat.

Breng een dunne laag snelle afdichting aan tussen het implantaat en de schedel om te voorkomen dat tandcement onder de schedel doordringt. Zodra de snelle afdichting is uitgehard, breng je superbinding gelijkmatig aan op het oppervlak van de schedel, het oppervlak van de snelle afdichting en het oppervlak van het implantaat. Zodra de superbinding is genezen, breng je kunstgebitbasishars boven superbinding aan, evenals de huid rond de incisie die aan het begin van de operatie is gemaakt.

Nadat de basishars van het kunstgebit is uitgehard, plaatst u de hoofdplaat op de hars rond het implantaat en laat u deze concentreren met de beeldvormende canule. Breng meer kunstgebitbasishars rond en boven de hoofdplaat aan om de positie te bevestigen. Laat het enkele minuten uitharden.

Vermijd het opbouwen van een dikke laag cement rond de canule om een betere toegang tot het beeldvenster te garanderen is de objectieve lens. Verdun de basishars van het kunstgebit om de viscositeit te verminderen, waardoor het de holtes kan vullen die moeilijk te bereiken zijn met een applicator. Plaats voorzichtig een geïsoleerde rubberen tape boven het raam om het raam te beschermen tegen mogelijke verontreiniging door dierbanden.

Voeg Fast Green kleurstofvoorraadoplossing toe aan virusoplossing verdun het tot de gewenste titer in de verhouding van één tot negen, in een PCR-buis. Trek 600 nano liter van de virusoplossing terug, verwijder de dummy canule en plaats de interne canule die op de injectiespuit in de geleidekanule zit. Infuseer het virus met een snelheid van 15 nano liter per minuut, in totaal 10 minuten.

Houd de interne canule 10 minuten verbonden zodat het virus zich onder het venster kan verspreiden. Verwijder voorzichtig de interne canule van de geleidekanule en vat deze samen met de dummy canule. Induceer de muis met 4%isofluraan gedurende een paar minuten.

Bevestig de kopplaat aan de kopvork en bevestig vervolgens de kopvork aan de loopband. Gebruik een lens met een lage vergrotingsdoelstelling om de beste filterweergave te vinden voor functionele beeldvorming. Schakel vervolgens over naar een lens met een hogere doelstelling om de neuronale activiteiten bij een enkele celresolutie op te nemen.

Voor calciumbeeldvorming werd groene fluorescerende opgewekt door een in de handel verkrijgbare LED van 470 nanometer met behulp van een standaard GFP-filterzin. Om fluorescerende sporen te verkrijgen, werden de interessegebieden, die overeenkomen met neuronale celmassa, handmatig gesegmenteerd en geanalyseerd door ImageJ-software. Voor spanningsbeeldvorming met behulp van een 40 X lens werden optische spanningsopnamen uitgevoerd in het nabije infraroodkanaal met 830 Hertz-acquisitiesnelheden.

Spontane neurale activiteitsopname duurde continu tot 25.000 frames. Hier beschrijven we een methode voor langetermijnbeeldvorming van de hippocampus als een A1-gebied bij zich gedragende muizen. De methode is gebaseerd op de chronische implantatie.

Nu het op maat gemaakte beeldvormingsvenster, dat ook de gerichte toediening van virussen of geneesmiddelen rechtstreeks aan de betrokken neuronen mogelijk maakt. We geloven dat het beschreven protocol de studies zal vergemakkelijken die gericht zijn op het onderzoeken van neuronale activiteit met een hoge ruimtelijke temporele resolutie in de hippocampus van zich gedragende muizen met behulp van eenvoudige en betaalbare 1-foton beeldvorming opstellingen.