Whole-Brain 3D-activering en functionele connectiviteit mapping bij muizen met behulp van transcraniële functionele echografie beeldvorming

Functionele echografie is een nieuwe neuroimaging-modaliteit die het mogelijk maakt om het cerebrale bloedvolume in het levende knaagdierbrein in kaart te brengen. Met behulp van ultrasnelle vliegtuiggolfbeeldvorming kunnen we hemodynamische reacties van de hele hersenen meten met een ongeëvenaarde speciale tijdelijke resolutie en gevoeligheid. Dit protocol legt uit hoe transcraniële functionele echografie bij muizen kan worden uitgevoerd, zowel voor verdoofde als wakkere dierproeven.

In vergelijking met andere functionele beeldvormingstechnieken voor de hele hersenen, zoals FMRI, biedt functionele echografie een hoge draagbaarheid, gebruiksgemak en maakt het experimenten mogelijk bij wakkere en vrij bewegende proefpersonen, waardoor anesthesiebias wordt vermeden en gedragsstudies mogelijk worden. Tot voor kort werd FUS-beeldvorming alleen gebruikt in samenwerking met echografie-expert. Nu is deze technologie beschikbaar voor de brede neurowetenschappelijke gemeenschap, dankzij commercieel verkrijgbare scanners en speciale software voor preklinische beeldvorming van de hersenen, waardoor FUS vrij eenvoudig te gebruiken is zonder enige achtergrond in echografie.

Breng voor een verdoofde beeldvormingssessie oogzalf aan op de ogen van de muis om schade aan het hoornvlies te voorkomen en scheer de muiskop met behulp van een tremor. Breng wat ontharingscrème aan en spoel na een paar minuten af. Herhaal dit totdat het haar volledig is verwijderd.

Plaats subcutane pinnen in de ledematen voor opname van elektrocardiogrammen en plaats gecentrifugeerde ultrasone gel op het hoofd. Voor wakkere muizenexperimenten is een voorbereidende operatie vereist voor hoofdfixatie. Plaats de verdoofde muis en een stereotactisch frame op een verwarmingskussen van 37 graden Celsius.

Breng beschermende gel aan voor de ogen en dien subcutaan lidocaïne toe onder de hoofdhuid met behulp van een naald van 26 gauge en wacht vervolgens een paar minuten. Maak een incisie na de sagittale hechting van achter het achterhoofdsbeen naar het begin van het neusbeen en gebruik vervolgens een chirurgische schaar om de huid over beide hemisferen weg te snijden. Reinig de schedel met één procent jodiumoplossing en verwijder het resterende botvlies.

Gebruik de kopplaat als sjabloon en markeer twee gaten in de schedel om de verankeringsschroeven te positioneren. Plaats de kopplaat met de schroeven en gebruik tandcement om de schroeven te bevestigen en de kopplaat aan de voor- en achterkant van het frame om een goede grip op het implantaat te behouden. Verwijder het dier uit het stereotactische frame nadat het cement droog is en draai de anesthesie om via subcutane injectie van één milligram per kilogram atipamezol.

Toedien profylactische meloxicam voor postoperatieve pijn. Plaats een magnetische 3D-geprinte dop over de hoofdplaat ter bescherming en laat de muis vier tot zes dagen herstellen voordat de gewenning aan de kooi van de stacaravan begint. Plaats het dier een paar uur in een herstelkooi op een verwarmingskussen en breng de muis vervolgens terug naar zijn thuiskooi met nestgenoten.

Op dag vier en vijf na het herstel klemt u de muis herhaaldelijk vast aan de kooi van de stacaravan en verhoogt u geleidelijk de vaste tijd van het hoofd, beginnend bij vijf minuten en maximaal 30 minuten. Breng wat zoutoplossing en ultrasone gel aan op het beeldvormingsvenster om de muis te laten wennen. Herhaal dit proces op dag zes na herstel.

Start de software en maak een experimenteersessie. Ga naar het menu van de bewegingssonde om de positie van de ultrasone sonde aan te passen met behulp van het navigatietoetsenbord. Start de live view acquisitie en pas indien nodig de positie van de sonde aan via real-time beeldvorming van het cerebrale bloedvolume van het dier, of CBV.

Lijn de hersenen uit in het midden van het beeld en optimaliseer vervolgens de beeldparameters om de hoogste signaal-ruisverhouding vast te leggen. Open de Angio 3D-optie van de acquisitiesoftware. Pas op het vooraf ingestelde paneel de scanparameters van het eerste segment, het laatste segment en de stapgrootte aan om de hele hersenen te scannen en de acquisitie te starten.

Laat de acquisitiesoftware open en start de software voor data-analyse en visualisatie en laad vervolgens de Angio 3D-scan. Navigeer door het acquisitievolume met behulp van het paneel met drie weergaven en selecteer de coronale scanrichting, anteroposterior of posturaal anterieur. Ga naar het hersenregistratiepaneel en laad de muisreferentiesjabloon voor het registratieproces.

Registreer de scan op het Allen Mouse Common Coordinates Framework met behulp van de volautomatische of handmatige registratiemodi. Controleer het resultaat door te kijken naar de superpositie van de Angio 3D-scan en de referentiesjabloon, of door te kijken naar de superpositie van de scan en de Allen Reference Atlas met behulp van het Atlas-beheerpaneel. Sla de registratie op als een BPS-bestand.

Zorg er in de ICO-studiosoftware voor dat de angiografische scan en het BPS-bestand zijn geladen. Ga naar het hersennavigatiepaneel. Navigeer in het deelvenster Atlas Manager door de allen brain atlas van de muis met de bovenliggende onderliggende boomnavigator.

Zoek de anatomische doelgebieden en selecteer ze om ze in de drie weergaven op de scan te richten. Visualiseer de doelgebieden in het deelvenster met drie weergaven en kies een beeldvlak dat de doelgebieden voor het experiment overlapt door handmatig twee markeringen in te stellen op de coronale positie die het betreffende gebied omvat. Klik op Brain Positioning System, of BPS, om de resulterende motorcoördinaten te extraheren die overeenkomen met de sondepositie om het beoogde vlak in beeld te brengen.

Controleer het voorbeeld van de afbeelding die is berekend op basis van de angio-scan. Ga in de ICO-scansoftware naar het sondepositioneringspaneel en klik op BPS-coördinaten invoeren en pas vervolgens de geëxtraheerde coördinaten toe, waardoor de sonde beweegt en uitlijnt op het beoogde beeldvormingsvlak. Voer een live view acquisitie uit en controleer of het huidige beeldvlak overeenkomt met de voorspelling.

Definieer de stimulatievolgorde, inclusief de tijd van stimulatie, interessestimulatietijd en het aantal herhalingen. Voer een 3D FUS-reeks uit door de totale tijd van acquisitie, het aantal posities en de dode tijd tussen posities te definiëren. Voor automatische stimulatie gesynchroniseerd met het acquisitiesysteem via TTL-ingang, selecteert u de trig in-optie voordat u de acquisitie start.

Open de acquisitie in ICO studio-software en ga naar het activeringskaartmenu, vul vervolgens het activeringspatroonveld in met een begin- en eindtijd en bereken de activeringskaart. Pas de weergaveparameters voor visualisatie aan en exporteer de activeringskaart als een H5-bestand voor offline analyse. Voer een 3D FUS-reeks uit door de totale tijd van acquisitie, het aantal posities van het beeldvlak en de dode tijd tussen posities te definiëren.

Sla de acquisitie op en laad deze in de ICO-studiosoftware. Laad indien nodig het BPS-bestand en het Allen Mouse Brain Coordination Framework. Selecteer in Atlas Manager regio's van de Atlas als interessante regio's.

Ga naar het menu functionele geleidbaarheid en selecteer de gewenste regio's en de ROI-manager. Visualiseer de resultaten als connectiviteitsmatrix of op seed gebaseerde correlatiekaart, selecteer en pas vervolgens de bandbreedtefilters naar wens aan en exporteer correlatieresultaten voor statistische analyse. Dit protocol werd gebruikt voor 3D-kwantificering van cerebrale hemodynamische variaties transraniaal in het muizenbrein.

Whisker stimulatie werd geselecteerd als een voorbeeld van sensorische stimulatie opgeroepen respons. Significante activering werd bepaald met een resolutie van een algemeen lineair model, of GLM, met behulp van de standaard muis hemodynamische responsfunctie. De totale proeftijd was 760 seconden, met een basislijn van 60 seconden, een stimulatie van 80 seconden en een hersteltijd van 60 seconden die vijf keer werd herhaald.

Met behulp van een voxelgewijs tijdsverloop van de contralaterale primaire somatosensorische cortex, onthulde het barrel field-gebied, of S1BF, een toename van 15 tot 20% van de CBV in vergelijking met baseline. Hetzelfde paradigma werd toegepast in een hoofd vast gedragende muis in de kooi van de stacaravan met behulp van de wakkere preset van ICO-scan. De activeringskaart na een meervoudig snorharenstimulatie-experiment wordt hier weergegeven.

Significante activering werd bepaald met de resolutie van een GLM met behulp van een standaard muis hemodynamische responsfunctie. De temporele correlaties hebben laagfrequente spontane CBV-fluctuaties tussen 3D-hersengebieden in een ketamine xylazine-verdoofde muis genormaliseerd. Zaadgebaseerde analyse en de dorsale hippocampus onthulden de significante interhemisferische geleidbaarheid tussen de rechter- en linker hippocampus, evenals diepere retro hippocampale regio's en piriforme beleefdheden.

Een zaadgebied geselecteerd in de S1BF resulteerde ook in een symmetrisch correlatiepatroon. Het kritieke punt voor succesvolle experimenten is de diervoorbereiding, met name het niveau van anesthesie voor experimenten met verdoofde dieren en de bescherming van een schedel bij experimenten bij wakkere dieren. Als de VS ons in staat stelde om belangrijke hersenfuncties te bestuderen bij wakkere dieren die te maken hebben met fundamentele vragen over slaap, leren of gedrag, maar ook de farmacologische modulatie van functionele connectiviteit voor het ontdekken van geneesmiddelen.