Name: Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Leer een snelle fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels. Deze methode gebruikt gefluorecenteerd phalloidine voor directe kwantificering van F-actine in hersenhomogenaat en synaptische terminale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), de New Zealand Health Research Council (#16-597) en het Department of Anatomy, University of Otago, Nieuw-Zeeland. We zijn de Neurologische Weefselbank van HCB-IDIBAPS BioBank (Spanje) voor menselijke hersenweefsels te schulden. We danken Jiaxian Zhang voor haar hulp bij het opnemen en bewerken van de video.

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Commissie ethiek van de Universiteit van Otago voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (ethisch protocol nr. AUP95/18 en AUP80/17) en Nieuw-Zeelandse wetgevende macht. Menselijke hersenweefsels werden verkregen van de Neurologische Weefselbank van ziekenhuis Clínic-IDIBAPS BioBank in Barcelona, Spanje. Alle protocollen voor weefselverzameling werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van Hospital Clínic, Barcelona, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de families.
1. Bereiding van buffers en reagentia
<ol><li>Bereid de volgende buffers voor op de homogenisatie van hersenweefsel en de bereiding van verrijkte fractie synaptische terminals: Homogenisatiebuffer: 5 mM HEPES, pH 7,4 aangevuld met 0,32 M sucrose Resuspensiebuffer: 5 mM Tris, pH 7,4 aangevuld met 0,32 M sucrose Wasbuffer: 5 mM Tris, pH 8,1 1.2 M sucrose 1.0 M sucrose 0.85 M sucrose</li>
	<li>Voeg zelfgemaakte of commerciële mix van protease en fosfataseremmers toe. OPMERKING: We hebben een EDTA-vrije versie van Complete Protease Inhibitor mix (1 tablet per 10 ml buffer) en fosfataseremmer cocktail IV (1:100; volume: volume) gebruikt.</li>
	<li>Bereid de volgende buffers en reagentia voor op de fixatie, permeabilisatie en binding van phalloïdine: Krebs buffer: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4 1 M KCl 25% glutaraldehyde (stamoplossing) Krebs buffer met 0,1 % Triton X-100 en 1 mg/ml NaBH4 400x Alexa Fluor 647 Phalloidin in DMSO Krebs buffer met 0,32 M sacharose 50 μM latrunculine A in DMSO (stamoplossing) 1 M KCl (voorraadoplossing) LET OP: Phalloidine is giftig (LD50 = 2 mg/kg) en moet met zorg worden behandeld. Inademing van glutaraldehyde is giftig en moet worden behandeld in een zuurkast.</li>
	<li>Bewaar de buffers bij 4 °C en falloïdine en latrunculine A bij -20 °C voor langdurige opslag. OPMERKING: Langdurige opslag van buffers wordt niet aanbevolen. Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
</ol>2. Homogenisatie van hersenweefsel
<ol><li>Homogeniseer het cryopreserved of vers ontleed rattenhersenweefsel in 10 volumes homogenisatiebuffer in eenPotter-Elvehjem glazen buis en stamper op ijs. OPMERKING: Optimale homogenisatie wordt bereikt door 15-20 slagen van de stamper met de hand voor hersenweefsels. Succesvolle homogenisatie kan worden bevestigd door een soepele stroom van de suspensie door de glazen buis. Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
	<li>Bepaal de eiwitconcentratie in het homogenaat met behulp van een Bradford-test31. OPMERKING: Alternatieve zelfgemaakte of commerciële tests voor eiwitschatting kunnen ook worden gebruikt.</li>
	<li>Verdun homogenaatmonsters in Krebs-buffer bij een concentratie van 2-3 mg eiwit/ml in een volume van 50 μL. OPMERKING: In sommige van onze experimenten incuberen we homogenaten met 2 μM latrunculine A of DMSO (controles) bij 37 °C gedurende 1 uur. Hiervoor worden homogenaten geresuspendeerd in 48 μL Krebs-buffer en wordt 2 μL van 50 μM latrunculine A of 2 μL DMSO toegevoegd. Verder voor immunoblotting wordt een kleine hoeveelheid monster (10 μg) verzameld na de incubatie.</li>
	<li>Bevestig de homogenaatmonsters (rubriek 5).</li>
</ol>3. Voorbereiding van geïsoleerde zenuwterminals
<ol><li>Bereiding van synasptosomen OPMERKING: Alternatieve protocollen32,33 voor synaptosomen kunnen ook worden gebruikt.<ol>
<li>Centrifugeer hersenhomogenaat bij 1.200 x g gedurende 10 min bij 4 °C.</li>
		<li>Gooi de pellet weg, de ruwe kernfractie.</li>
		<li>Centrifugeer het supernatant (S1) dat in stap 3.1.1 bij 12.000 x g wordt verkregen gedurende 15 min bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant (S2), de oplosbare cytosolische fractie.</li>
		<li>Resuspend de pellet (P2) verkregen in stap 3.1.3, de ruwe synaptosomale fractie in resuspensiebuffer. OPMERKING: Het volume van de resuspensiebuffer is afhankelijk van de hoeveelheid startweefsel en de hoeveelheid verkregen pellet. Bijvoorbeeld, wanneer beginnend met 150-300 mg hersenweefsels, kan de verkregen pellet worden geresuspendeerd in 200 μL resuspensiebuffer.</li>
		<li>Laad de geresuspendeerde ruwe synasptosomen op een discontinue sacharosegradiënt van gelijke volumes van 0,85-1,0-1,2 M sucrose. OPMERKING: We gebruiken meestal 1 ml per sucrose-oplossing (voor 150-300 mg weefsel). Dit kan worden veranderd volgens grotere weefselhoeveelheden. Discontinue gradiënten kunnen worden gemaakt met behulp van een 25G-spuit die tegen de binnenwand van de ultracentrifugebuis wordt gedrukt en zachte gelaagdheid van de sacharoselagen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 85.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C. OPMERKING: Vanwege de hoge centrifugesnelheid is een ultracentrifuge nodig die een vacuüm kan creëren om de verwarming te verminderen.</li>
		<li>Verzamel de synaptosomale fractie op het raakvlak tussen 1,0 en 1,2 M sucrose met behulp van een pipetpunt van 200 μL.</li>
		<li>Was de synaptosomale fractie met ijskoude wasbuffer door centrifugeren op 18.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. OPMERKING: Voor het wassen wordt de synaptosomale fractie verkregen op het raakvlak van 1,0 en 1,2 M sacharose verzameld in een verse buis van 1,5 ml en wordt een gelijk volume wasbuffer toegevoegd, waardoor hoge sacharose uit het medium wordt verwijderd.</li>
		<li>Was de synaptosomale pellet opnieuw met een ijskoude homogenisatiebuffer op 12.000 g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Resuspend de synasptosomen in homogenisatie buffer op ijs. OPMERKING: Het protocol kan hier kort worden gepauzeerd.</li>
		<li>Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test.</li>
		<li>Resuspendeer de synasptosomen in krebsbuffer bij een concentratie van 2-3 mg eiwit/ml in een volume van 50 μL (47,5 μL als synafosomen door KCl moeten worden gedepolariseerd; zie rubriek 4). OPMERKING: Voor resuspensie wordt de synaptosomale fractie eerst gesponnen op 12.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C en wordt het supernatant (buffer) verwijderd. De synaptosomale pellet wordt vervolgens in Krebs buffer geresuspendeerd door zachte pipetten met behulp van een pipetpunt van 200 μL.</li>
		<li>Ga verder met depolarisatie (sectie 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van synaptoneurosomen OPMERKING: Alternatieve protocollen34,35 voor synaptoneurosomen kunnen ook worden gebruikt.<ol>
<li>Breng het homogenaat van de hersenen door een voorge bevochtigd netfilter van 100 μm poriegrootte in een filterhouder met behulp van een spuit van 1 ml. OPMERKING: Het vooraf bevochtigen van alle filters is belangrijk om verlies van monster te voorkomen en moet worden gedaan met behulp van homogenisatiebuffer. Hiervoor wordt de homogenisatiebuffer met behulp van een spuit van 1 ml door de filters in de filterhouder gepasseerd totdat de buffer uitstroomt.</li>
		<li>Verzamel het filtraat (F1) in een voorgekoelde buis van 1,5 ml op ijs.</li>
		<li>Herhaal het proces (stappen 3.2.1 en 3.2.2) voor F1-fractie om het tweede filtraat (F2) te verkrijgen.</li>
		<li>Passeer F2 filtraat door een nettofilter van 5 μm poriegrootte.</li>
		<li>Verzamel het filtraat (F3) in een voorgekoelde buis van 1,5 ml op ijs.</li>
		<li>Centrifugeer filtraat F3 bij 1.500 x g gedurende 10 min bij 4 °C.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet (synaptoneurosomen) in Krebs buffer op ijs bij een concentratie van 2-3 mg eiwit/ml in een volume van 50 μL (47,5 μL als synaptosomen door KCl moeten worden gedepolariseerd; zie rubriek 4). OPMERKING: Het protocol kan hier kort worden gepauzeerd.</li>
		<li>Schat de eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test.</li>
		<li>Ga verder met depolarisatie (sectie 4).</li>
	</ol></li>
</ol>4. KCl-gemedieerde depolarisatie van geïsoleerde synaptische terminals
<ol><li>Equilibreren synasptosomen/synaptonurosomen bij 37 °C gedurende 5-10 min.</li>
	<li>Stimuleer synasptosomen/synaptoneurosomen door KCl toe te voegen om extracellulaire K+ tot 50 mM te verhogen gedurende 30 s bij 37 °C en voeg een gelijk volume Krebs-buffer toe aan de respectieve ongestimuleerde controleset. OPMERKING: Voeg bijvoorbeeld 2,5 μL 1 M KCl toe aan synasptosomen die zijn geresuspendeerd in 47,5 μL Krebs-buffer; en voeg 2,5 μL Krebs-buffer toe aan het respectieve ongestimuleerde controlesysptosom. Voor experimenten waarbij een groot aantal monsters betrokken is, mag niet meer dan 2 monsters tegelijk worden gebruikt, zodat de depolarisatietijd niet langer is dan 30 s.</li>
	<li>Beëindig de stimulatie door glutaraldehyde toe te voegen (rubriek 5).</li>
</ol>5. Fixatie en falloïdinekleuring van monsters
<ol><li>Voeg glutaraldehyde toe aan homogenaat/synaptosomale/synaptoneurosomale monsters tot een eindconcentratie van 2,5% gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: We hebben 6 μL 25% glutaraldehydeoplossing toegevoegd, zodat de uiteindelijke concentratie glutaraldehyde in de 50 μL-monsters (homogenaten/synaptosomen/synaptoneurosomen) ca. 2,5% bedroeg. Fixatie is van cruciaal belang en moet snel zijn en daarom onmiddellijk na toevoeging van glutaraldehyde moet het monster krachtig worden geko vortexed.</li>
	<li>Sediment de monsters op 20.000 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant. OPMERKING: Gooi het supernatant weg in een zuurkast omdat glutaraldehyde giftig is.</li>
	<li>Permeabiliseer de pellet door resuspensie in 100 μL Krebs buffer met 0,1% Triton X-100 en 1 mg/ml NaHB4 gedurende 2-3 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Sediment de monsters op 20.000 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder de permeabilisatiebuffer.</li>
	<li>Was de pellet met 200 μL Krebs buffer door centrifugeren op 20.000 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspend en beits de pellet met 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (overeenkomend met 500 μU) in 100 μL Krebs buffer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. OPMERKING: Andere variëteiten van fluorescerende falloïden analogen zijn in de handel verkrijgbaar en kunnen worden vervangen voor de test. De concentratie van falloïdine en het totale incubatievolume van het monster moeten mogelijk worden aangepast aan de hoeveelheid en het type weefsel/monster dat wordt getest en de optimale omstandigheden moeten dienovereenkomstig worden gestandaardiseerd.</li>
	<li>Centrifugeer de bevlekte monsters gedurende 5 minuten op 20.000 x g.</li>
	<li>Verwijder de ongebonden falloidine (supernatant).</li>
	<li>Was het monster met 200 μL Krebs buffer door centrifugeren op 20.000 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspend in 200 μL Krebs buffer met 0,32 M sacharose. OPMERKING: Het protocol kan hier kort worden gepauzeerd.</li>
</ol>6. Fluormetrische analyse en lichtverstrooiing
<ol><li>Doseer Alexa Fluor 647 Phalloidin-bevlekte monsters in een zwarte 96-put plaat.</li>
	<li>Meet de fluorescentie-intensiteit bij een excitatiegolflengte van 645 nm en een emissiegolflengte van 670 nm in een plaatlezer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng de monsters van de zwarte 96-putplaat over op de transparante 96-putplaat met behulp van 200 μL pipetpunten.</li>
	<li>Meet de lichtverstrooiing bij 540 nm om eventuele verliezen te corrigeren die zich tijdens de vorige stappen van fixatie, permeabilisatie en kleuring hebben voorgedaan. OPMERKING: Variaties in biologisch materiaal die in de bevlekte monsters worden vastgehouden, kunnen prominenter zijn voor kleinere hoeveelheden uitgangsmateriaal (zie Discussie).</li>
	<li>Neem een set Alexa Fluor 647 Phalloidin in Krebs buffer op bij verschillende concentraties (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x en 1x overeenkomend met 25, 50, 125, 175, 250, 375 en 500 μU). OPMERKING: Dit is een optionele stap en heeft geen invloed op de resultaten van de test, met name wanneer de F-actinespiegels relatief worden uitgedrukt (artikel 7). Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
</ol>7. Gegevensanalyse
<ol><li>De hoeveelheid F-actine in de monsters is direct evenredig met de fluorescentie-intensiteit van gebonden falloïdine. Express in absolute termen van eenheden van falloïdine gebonden berekend op basis van de lineaire curve van de gelabelde falloïdinestandaard. OPMERKING: Zie bijvoorbeeld de figuren 2A-B, 3A, 4A-B en aanvullende figuur 2.</li>
	<li>Express F-actine niveaus als een fractie van de controle monsters. OPMERKING: Zie bijvoorbeeld de figuren 5A-B.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

De hier beschreven test, in wezen aangepast aan een eerdere studie30 met modificaties, maakt gebruik van een phallotoxine, falloïdine gelabeld met een fluorescerend label. Fluorescerende falloïdenanalogen worden beschouwd als de gouden standaard voor het kleuren van actinefilamenten in vaste weefsels47,48,49. In feite zijn ze de oudste instrumenten om actinefilamenten50 specifiek t...

Cytoskelet eiwit actine is betrokken bij meerdere cellulaire functies, met inbegrip van structurele ondersteuning, cellulair transport, celmotiliteit en deling. Actine komt in evenwicht in twee vormen voor: monomere bolvormige actine (G-actine) en gepolymeriseerde filamenteuze actine (F-actine). Snelle veranderingen in de polymerisatiestatus van actine (interconversie tussen de G- en F-vormen) resulteren in snelle filamentassemblage en demontage en liggen ten grondslag aan de regulerende rol in de cellulaire fysiologie. Actine vormt het belangrijkste bestanddeel van de neuronale cytoskeletstructuur en beïnvloedt een breed scala aan neuronale functies1,2. Opmerkelijk is dat het actinecytoskelet een integraal onderdeel vormt van het structurele platform van de synaptische terminals. Als zodanig is het een belangrijke determinant van synaptische morfogenese en fysiologie en speelt het een fundamentele rol bij de controle van de grootte, het aantal en de morfologie van synapsen3,4,5. In het bijzonder is dynamische actinepolymerisatie-depolymerisatie een belangrijke determinant van de synaptische remodellering geassocieerd met synaptische plasticiteit die ten grondslag ligt aan het geheugen en leerprocessen. Zowel presynaptische (zoals neurotransmitter release6,7,8,9,10) als postsynaptische functies (plasticiteit gerelateerde dynamische remodellering11,12,13,14) vertrouwen kritisch op dynamische veranderingen in de polymerisatiestatus van het actinecytoskelet.
Onder fysiologische omstandigheden worden de F-actinespiegels dynamisch en strak gereguleerd via een multimodaal traject met posttranslationele modificatie4,15,16 en actinebindende eiwitten (ACP 's)4,17. ABPs kunnen de actinedynamiek op meerdere niveaus beïnvloeden (zoals het initiëren of remmen van polymerisatie, het induceren van filamentvertakking, het afsnijden van filamenten tot kleinere stukken, het bevorderen van depolymerisatie en het beschermen tegen depolymerisatie), en staan op hun beurt onder een strikte modulerende controle die gevoelig is voor verschillende extra- en intracellulaire signalen18,19,20. Dergelijke regelgevende controles op meerdere niveaus dicteren een strikte regulering van de actinedynamiek in het synaptische cytoskelet, waarbij pre- en postsynaptische aspecten van neuronale fysiologie worden verfijnd, zowel in de basale als activiteitsgeïnduceerde toestanden.
Gezien de belangrijke rol van actine in de neuronale fysiologie, is het niet verwonderlijk dat verschillende studies bewijs hebben geleverd voor veranderingen in de actinedynamiek als kritieke pathogene gebeurtenissen die verband houden met een breed scala aan neurologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratie, psychologische ziekten en neuroontwikkelingsaandoeningen3,21,22,23,24,25,26,27. Ondanks de schat aan onderzoeksgegevens die wijzen op belangrijke rollen van actine in neuronale fysiologie en pathofysiologie, blijven er echter nog steeds aanzienlijke hiaten in het begrip van actinedynamiek, met name bij het synaptische cytoskelet. Meer onderzoeken zijn nodig om een beter begrip van neuronale actine en de veranderingen ervan onder pathologische omstandigheden te hebben. Een belangrijk aandachtsgebied in deze context is de beoordeling van de actinepolymerisatiestatus. Er zijn westerse blotting-gebaseerde commerciële kits (G-Actin / F-Actin in vivo assay biochemische kit; Cytoskelet SKU BK03728,29) en zelfgemaakte assays voor de beoordeling van F-actineniveaus6. Omdat deze echter biochemische isolatie van F-actine en G-actine vereisen en omdat hun daaropvolgende kwantificering is gebaseerd op immunoblottingprotocollen, kunnen ze tijdrovend zijn. We rapporteren hierin een fluorescentiespectroscopie-gebaseerde assay aangepast aan een eerdere studie30 met wijzigingen die kunnen worden gebruikt om zowel basale niveaus van F-actine te evalueren, als dynamische veranderingen in de assemblage-demontage. Met name hebben we het oorspronkelijke protocol dat monsters vereist die geschikt zijn voor een cuvette van 1 ml efficiënt aangepast aan het huidige 96-put plaatformaat. Het gewijzigde protocol heeft daarom de hoeveelheid weefsel/monster die nodig is voor de test aanzienlijk verminderd. Verder leveren we bewijs dat het protocol niet alleen geschikt is voor homogenaten van hersenweefsel, maar ook voor subcellulaire fracties zoals geïsoleerde synaptische terminals (synafosomen en synaptoneurosomen). Ten slotte kan de test worden gebruikt voor vers ontleed hersenweefsel van knaagdieren en langdurige opgeslagen postmortale menselijke hersenmonsters. Van belang, terwijl de test wordt gepresenteerd in een neuronale context, kan het op passende wijze worden uitgebreid tot andere celtypen en fysiologische processen die ermee verband houden.

<table><tbody><tr><td>3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Voor gradiëntcentrifugatie (synaptosome prep)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>F-actin specifiek ligand</td></tr><tr><td>Antibody against &nbsp;b-actin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47778</td><td>Voor evaluatie van totale actin niveaus door immunoblotting</td></tr><tr><td>Antibody against GAPDH</td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>Voor evaluatie van GAPDH niveaus door immunoblotting</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Bradford gebaseerde eiwitschatting</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&middot;2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Krebs buffer component</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td>Voor remming van endogene protease activiteit tijdens monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Voor lichtverstrooiingsmetingen</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Krebs buffer component</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Solvent voor phalloidin en latrunculin A</td></tr><tr><td>Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Voor detectie van immunoreactieve signalen op immunoblots</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Fixeermiddel</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Buffer ingredient voor monstervoorbereiding en Krebs buffer component</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>Depolymerisator van actin filamenten</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&middot;6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Krebs buffer component</td></tr><tr><td>Microplates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitex membrane filter 5 mm</td><td>Millipore</td><td>LSWP01300</td><td>Bereiding van synaptoneurosomes</td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Black Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>237105</td><td>Voor fluorometrische metingen</td></tr><tr><td>Nylon net filter 100 mm</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td>Bereiding van synaptoneurosomes</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>Voor remming van endogene fosfatase activiteit tijdens monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Krebs buffer component en voor depolarisatie van synaptische terminalen</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Krebs buffer component</td></tr><tr><td>Sodium borohydride (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>Component van Permeabilisatie buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL944</td><td>Krebs buffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL900</td><td>Krebs buffer component</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Voor fluorometrische metingen</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/8600/60</td><td>Buffer ingredient voor monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Swimnex Filter Holder</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>Bereiding van synaptoneurosomes</td></tr><tr><td>Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>358034</td><td>Voor weefsel homogenisatie</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Component van Permeabilisatie buffer</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>Buffer ingredient voor monstervoorbereiding</td></tr></tbody></table>

een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actine, de belangrijkste component van cytoskelet, speelt een cruciale rol bij het behoud van neuronale structuur en functie. Onder fysiologische toestanden komt actine in evenwicht in zijn twee vormen voor: monomere bolvormige (G-actine) en gepolymeriseerde filamenteuze (F-actine). Op de synaptische terminals vormt actinecytoskelet de basis voor kritische pre- en postsynaptische functies. Bovendien zijn dynamische veranderingen in de actinepolymerisatiestatus (interconversie tussen bolvormige en filamenteuze vormen van actine) nauw verbonden met plasticiteitsgerelateerde veranderingen in synaptische structuur en functie. We rapporteren hier een aangepaste fluorescentiegebaseerde methodologie om de polymerisatiestatus van actine in ex vivo omstandigheden te beoordelen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde falloïdine, een phallotoxine dat zich specifiek bindt aan actinefilamenten (F-actine), wat een directe meting van gepolymeriseerde filamenteuze actine biedt. Als principieel bewijs leveren we bewijs voor de geschiktheid van de test, zowel bij knaagdier- als postmortale homogenaten van menselijk hersenweefsel. Met behulp van latrunculine A (een medicijn dat actinefilamenten depolymeriseert), bevestigen we het nut van de test bij het monitoren van veranderingen in F-actineniveaus. Verder breiden we de test uit naar biochemische fracties van geïsoleerde synaptische terminals waarin we een verhoogde actinepolymerisatie bevestigen bij stimulatie door depolarisatie met hoge extracellulaire K+.

Lineariteit van de test voor de evaluatie van F-actineniveaus Ten eerste werd een standaardcurve voor de lineaire toename van fluorescentie van Alexa Fluor 647 Phalloidin vastgesteld en herhaald voor elke reeks experimenten (figuur 1). Om het lineaire bereik van de test te onderzoeken, werden verschillende hoeveelheden hersenhomogenaten van knaagdieren (figuren 2A en 2B) en postmortale menselijke proefpersonen (figuur...

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Actine is het belangrijkste bestanddeel van cytoskelet en reguleert kritisch verschillende aspecten van cellulaire morfologie en fysiologie, waaronder in neuronen. Actine komt voor in evenwicht tussen de twee vormen, monomere bolvormige G-actine of polymere filamenteuze F-actine. Polymerisatiestatus van actine wordt op meerdere niveaus streng gereguleerd, zowel door actinebindende eiwitten als door zijn eigen post-translationele regulatie.Bij de interne synaptische contacten zijn dynamische veranderingen in F-actineniveaus een belangrijke regulerende gebeurtenis, waarbij signalering en plasticiteit op zowel pre- als postsyn synaptische terminals worden gecontroleerd. Het is niet verrassend dat actinedisfunctie is gekoppeld aan verschillende neuropathologische toestanden. Recente vooruitgang heeft geleid tot een schat aan kennis van actine in neuronale fysiologie en pathofysiologie.Hoeveel er echter nog onbekend is en waar we ons op moeten concentreren. In dit opzicht hebben fluorescerende analogen van falloïdine bewezen een belangrijk hulpmiddel te zijn in actineonderzoek. Dit phallotoxine bindt zich specifiek aan filamenteuze actine en kan daarom worden gebruikt als een directe maat voor de hoeveelheden F-actine en de wijziging ervan in pathofysiologische toestanden.Deze studie presenteert een snelle en efficiënte fluormetrische test voor de evaluatie van de actinepolymerisatiestatus in ex-vivo biologische monsters, zoals groothandelshomogenaten en biochemisch geïsoleerde synaptische terminals uit hersenweefsels. Opmerkelijk is dat de test kan worden toegepast op andere cel- en weefseltypen en hun bijbehorende fysiologische fenomeen. Voor de recepten van de buffers die in dit onderzoek worden gebruikt, verwijzen wij u naar de gedetailleerde tekst.Hersenweefselmonsters van ratten of menselijke proefpersonen werden gehomogeniseerd in een Potter-Elvehjem glazen buis en stamper op ijs in 10 volumes homogenisatiebuffer. Voor synaptosomale bereiding werd het homogenaat eerst met een lage snelheid gesponnen en vervolgens met een hogere snelheid om ruwe synaptosomale mitochondriale fractie te verkrijgen. Verrijkte synasptosomen uit deze ruwe fractie werden verkregen na een discontinue sucrosegradiënt.Voor het synaptoneurosomale preparaat werden homogenaten achtereenvolgens door twee 100 micron en één 5 micron filter gepasseerd. Eiwitschatting werd uitgevoerd met behulp van Bradford reagens en monsters werden verdund in Krebs buffer bij een concentratie van twee tot drie milligram per ml eiwit in een eindvolume van 50 microliter. Stimulatie van geïsoleerde synaptische terminals, ofwel synaptosomen of synaptoneurosomen, werd uitgevoerd door een korte toename van 30 seconden in extracellulair kalium bij 37 graden.Hiervoor werd één molair kaliumchloride aan de monsters toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 15 millimollar. Homogenaten zijn ongestimuleerde en gedepolariseerde synaptische fragmenten werden gefixeerd met 2,5% glutaraldehyde, door de toevoeging van het vereiste volume van 25% glutaraldehyde-stamoplossing. De monsters werden twee, drie minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.Fixatief werd verwijderd door centrifugeren bij 20.000 G gedurende vijf minuten. De monsters werden vervolgens voortgezet voor permeabilisatie door resuspensie in Krebs buffer met 0,1%Triton X-100 en 1 mg per ml natrium borohydride gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Permeabilisatiebuffer werd opnieuw verwijderd door centrifugeren en de pellet werd oppervlakkig gewassen met Krebs-buffer en geresuspendeerd in Krebs-buffer met 1X Alexa Fluor 647-falloïdine, wat overeenkomt met 500 micro-eenheden phalloïdine.Binding mocht 10 minuten doorgaan bij kamertemperatuur in het donker. Overtollige ongebonden falloïdine werd gedurende vijf minuten uit de monsters verwijderd door centrifugeren bij 20.000 G, en de pellets werden oppervlakkig gewassen met Krebs-buffer en opnieuw geresuspendeerd in Krebs-buffer met 0,32 molaire sucrose om het drijfvermogen van synasptosomen of synaptoneurosomen te behouden. Fluorescerende falloïdengebonden monsters werden afgegeven in een 96 putzwarte plaat voor fluormetrische aflezing in een plaatlezer.De excitatie- en emissiegolflengtes werden ingesteld op respectievelijk 645 nanometer en 670 nanometer. Voor elke reeks experimenten hebben we verschillende hoeveelheden Alexa Fluor 647 falloidine opgenomen in Krebs-buffer met 0,32 molaire sucrose. Om eventuele verliezen van monsters tijdens de wasstappen te verantwoorden, werden de monsters overgebracht van de zwarte naar de transparante 96 putplaat.Het vangen van de monsters werd vervolgens onderzocht op 440 nanometer. Het vasthouden van fluorescerende phalloïdine is direct evenredig met de hoeveelheid actinefilamenten of F-actineniveaus in de monsters. Lineariteit van de phalloïdinebinding werd waargenomen in het bereik van 50 tot 200 microgram eiwitten.Als principieel bewijs hebben we ook de werkzaamheid van onze test getest in modellen voor F-actinedepolymerisatie met behulp van farmacologische verstoring van actinefilamenten door Latrunculin A, evenals stimulatie van F-actinevorming door KCl-gemedieerde stimulatie van geïsoleerde synaptische terminals. Fluorescentie-emissie van gebonden falloïdine kan worden uitgedrukt als eenheden gebonden falloïdine die worden gegenereerd uit de standaard lineaire curve en zijn relatief ten opzichte van de controlemonsters. Voor figuur 4 worden de F-actinespiegels uitgedrukt in micro-eenheden gebonden falloïdine.Voor figuur 5 daarentegen worden de F-actinespiegels in de gedepolariseerde synaptische fragmenten uitgedrukt ten opzichte van de niet-gedepolariseerde controlemonsters. We beschrijven een robuuste, tijdsefficiënte en hoge doorvoertest voor analyse van actinefilamenten, of F-actine, en de veranderingen in fysiologische en pathofysiologische toestanden die geschikt zijn voor een 96-putplaatformaat. De test is veel sneller dan bestaande alternatieve protocollen en kan dienen als een essentieel hulpmiddel in actine-gerelateerde studies, alleen of in combinatie met bestaande immunohistochchemie en westerse blotting gebaseerde assays.

a-time-efficient-fluorescence-spectroscopy-based-assay-for-evaluating

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the procedure for fluorescently staining rat cortical neurons for microscopy. It targets F-actin and dendritic proteins to analyze structural integrity and calculate F-actin density, which is crucial for studying neuronal function and health.

Quantification of Filamentous Actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filameuze actin (F-actin) speelt een belangrijke rol bij spinogenese, synaptische plasticiteit en synaptische stabiliteit. Kwantificering van F-actin punten is daarom een nuttig hulpmiddel om de integriteit van synaptische structuren te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren van F-actin punten gelabeld met Phalloidin in primaire corticale neuronale culturen met lage dichtheid.

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.

Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Een procedure wordt gepresenteerd om te visualiseren van proteïne kinase een activiteiten in hoofd-vaste, gedragen muizen. Een verbeterde A-kinase activiteit Reporter, tAKARα, wordt uitgedrukt in corticale neuronen en toegankelijk gemaakt voorbeeld vorming door middel van een craniaal venster. Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie wordt gebruikt om PKA-activiteiten in vivo te visualiseren tijdens gedwongen motoriek.

Visualisering van proteïne kinase een activiteit in hoofd-vaste muizen die in vivo twee-fotonen fluorescentie levensduur beeld microscopie gebruiken

Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Leer een snelle fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels. Deze methode gebruikt gefluorecenteerd phalloidine voor directe kwantificering van F-actine in hersenhomogenaat en synaptische terminale.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels (Video) | JoVE Journal

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Meer video's verkennen