Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Actine is het belangrijkste bestanddeel van cytoskelet en reguleert kritisch verschillende aspecten van cellulaire morfologie en fysiologie, waaronder in neuronen. Actine komt voor in evenwicht tussen de twee vormen, monomere bolvormige G-actine of polymere filamenteuze F-actine. Polymerisatiestatus van actine wordt op meerdere niveaus streng gereguleerd, zowel door actinebindende eiwitten als door zijn eigen post-translationele regulatie.

Bij de interne synaptische contacten zijn dynamische veranderingen in F-actineniveaus een belangrijke regulerende gebeurtenis, waarbij signalering en plasticiteit op zowel pre- als postsyn synaptische terminals worden gecontroleerd. Het is niet verrassend dat actinedisfunctie is gekoppeld aan verschillende neuropathologische toestanden. Recente vooruitgang heeft geleid tot een schat aan kennis van actine in neuronale fysiologie en pathofysiologie.

Hoeveel er echter nog onbekend is en waar we ons op moeten concentreren. In dit opzicht hebben fluorescerende analogen van falloïdine bewezen een belangrijk hulpmiddel te zijn in actineonderzoek. Dit phallotoxine bindt zich specifiek aan filamenteuze actine en kan daarom worden gebruikt als een directe maat voor de hoeveelheden F-actine en de wijziging ervan in pathofysiologische toestanden.

Deze studie presenteert een snelle en efficiënte fluormetrische test voor de evaluatie van de actinepolymerisatiestatus in ex-vivo biologische monsters, zoals groothandelshomogenaten en biochemisch geïsoleerde synaptische terminals uit hersenweefsels. Opmerkelijk is dat de test kan worden toegepast op andere cel- en weefseltypen en hun bijbehorende fysiologische fenomeen. Voor de recepten van de buffers die in dit onderzoek worden gebruikt, verwijzen wij u naar de gedetailleerde tekst.

Hersenweefselmonsters van ratten of menselijke proefpersonen werden gehomogeniseerd in een Potter-Elvehjem glazen buis en stamper op ijs in 10 volumes homogenisatiebuffer. Voor synaptosomale bereiding werd het homogenaat eerst met een lage snelheid gesponnen en vervolgens met een hogere snelheid om ruwe synaptosomale mitochondriale fractie te verkrijgen. Verrijkte synasptosomen uit deze ruwe fractie werden verkregen na een discontinue sucrosegradiënt.

Voor het synaptoneurosomale preparaat werden homogenaten achtereenvolgens door twee 100 micron en één 5 micron filter gepasseerd. Eiwitschatting werd uitgevoerd met behulp van Bradford reagens en monsters werden verdund in Krebs buffer bij een concentratie van twee tot drie milligram per ml eiwit in een eindvolume van 50 microliter. Stimulatie van geïsoleerde synaptische terminals, ofwel synaptosomen of synaptoneurosomen, werd uitgevoerd door een korte toename van 30 seconden in extracellulair kalium bij 37 graden.

Hiervoor werd één molair kaliumchloride aan de monsters toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 15 millimollar. Homogenaten zijn ongestimuleerde en gedepolariseerde synaptische fragmenten werden gefixeerd met 2,5% glutaraldehyde, door de toevoeging van het vereiste volume van 25% glutaraldehyde-stamoplossing. De monsters werden twee, drie minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.

Fixatief werd verwijderd door centrifugeren bij 20.000 G gedurende vijf minuten. De monsters werden vervolgens voortgezet voor permeabilisatie door resuspensie in Krebs buffer met 0,1%Triton X-100 en 1 mg per ml natrium borohydride gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Permeabilisatiebuffer werd opnieuw verwijderd door centrifugeren en de pellet werd oppervlakkig gewassen met Krebs-buffer en geresuspendeerd in Krebs-buffer met 1X Alexa Fluor 647-falloïdine, wat overeenkomt met 500 micro-eenheden phalloïdine.

Binding mocht 10 minuten doorgaan bij kamertemperatuur in het donker. Overtollige ongebonden falloïdine werd gedurende vijf minuten uit de monsters verwijderd door centrifugeren bij 20.000 G, en de pellets werden oppervlakkig gewassen met Krebs-buffer en opnieuw geresuspendeerd in Krebs-buffer met 0,32 molaire sucrose om het drijfvermogen van synasptosomen of synaptoneurosomen te behouden. Fluorescerende falloïdengebonden monsters werden afgegeven in een 96 putzwarte plaat voor fluormetrische aflezing in een plaatlezer.

De excitatie- en emissiegolflengtes werden ingesteld op respectievelijk 645 nanometer en 670 nanometer. Voor elke reeks experimenten hebben we verschillende hoeveelheden Alexa Fluor 647 falloidine opgenomen in Krebs-buffer met 0,32 molaire sucrose. Om eventuele verliezen van monsters tijdens de wasstappen te verantwoorden, werden de monsters overgebracht van de zwarte naar de transparante 96 putplaat.

Het vangen van de monsters werd vervolgens onderzocht op 440 nanometer. Het vasthouden van fluorescerende phalloïdine is direct evenredig met de hoeveelheid actinefilamenten of F-actineniveaus in de monsters. Lineariteit van de phalloïdinebinding werd waargenomen in het bereik van 50 tot 200 microgram eiwitten.

Als principieel bewijs hebben we ook de werkzaamheid van onze test getest in modellen voor F-actinedepolymerisatie met behulp van farmacologische verstoring van actinefilamenten door Latrunculin A, evenals stimulatie van F-actinevorming door KCl-gemedieerde stimulatie van geïsoleerde synaptische terminals. Fluorescentie-emissie van gebonden falloïdine kan worden uitgedrukt als eenheden gebonden falloïdine die worden gegenereerd uit de standaard lineaire curve en zijn relatief ten opzichte van de controlemonsters. Voor figuur 4 worden de F-actinespiegels uitgedrukt in micro-eenheden gebonden falloïdine.

Voor figuur 5 daarentegen worden de F-actinespiegels in de gedepolariseerde synaptische fragmenten uitgedrukt ten opzichte van de niet-gedepolariseerde controlemonsters. We beschrijven een robuuste, tijdsefficiënte en hoge doorvoertest voor analyse van actinefilamenten, of F-actine, en de veranderingen in fysiologische en pathofysiologische toestanden die geschikt zijn voor een 96-putplaatformaat. De test is veel sneller dan bestaande alternatieve protocollen en kan dienen als een essentieel hulpmiddel in actine-gerelateerde studies, alleen of in combinatie met bestaande immunohistochchemie en westerse blotting gebaseerde assays.