Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen

Het karakteriseren van 3D in vitro model op cellulaire en subcellulaire resolutie is cruciaal voor de volledige exploitatie, maar kan een uitdaging zijn. Daarom hebben we een aanvullend protocol verstrekt voor de kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste 3D in vitro modellen variërend van 100 micrometer tot enkele millimeters. 3D-structuren zijn radiaal en moeten zorgvuldig worden gemanipuleerd.

Controleer voordat u pipettert de locatie van uw 3D-structuren in de buis om elke aspiratie te voorkomen. Omdat we klassieke technieken hebben aangepast voor het inbedden van kleine structuren zoals organoïden of sferoïden, kunnen gevisualiseerde instructies gebruikers helpen de taak gemakkelijker uit te voeren. Laura Francols demonstreert de procedure met mij, een labtechnoloog van het Pathology Research Platform.

Om monsters voor te bereiden op 3D-kleuring van de hele montage, gebruikt u een pipetpunt van één milliliter die vooraf is gecodeerd met BSA om een 3D-structuursuspensie van één milliliter toe te voegen aan een buis van PBS van 500 microliter. Wanneer de 3D-structuren zich op de bodem van de buis hebben gevestigd, vervangt u de PBS zorgvuldig door 500 microliter permeabilisatieblokkeringsoplossing gedurende een incubatie van een uur bij kamertemperatuur met zachte horizontale agitatie bij 30 tot 50 omwentelingen per minuut. Laat aan het einde van de incubatie de 3D-structuren opnieuw bezinken voordat u de 3D-structuren twee keer zorgvuldig wast in één milliliter van 0,1% PBS aangevuld met BSA gedurende drie minuten per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt labelt u de 3D-structuren met 250 microliter primair antilichaam in PBS gedurende twee tot drie dagen met zachte horizontale agitatie bij vier graden Celsius. Was het monster aan het einde van de incubatie met vijf wasbeurten van drie minuten en twee wasbeurten van 15 minuten in één milliliter van 0,1% PBS BSA per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt labelt u de 3D-structuren met 250 microliter van het juiste secundaire antilichaam in PBS gedurende 24 uur bij vier graden Celsius met zachte horizontale agitatie beschermd tegen licht.

Label de volgende dag de 3D-structuren met 250 microliter van de juiste concentratie Hoechst 3342 gedurende een incubatie van twee uur bij vier graden Celsius met zachte horizontale agitatie. Was aan het einde van de incubatie de 3D-structuren vijf keer gedurende drie minuten en twee keer gedurende 15 minuten in één milliliter PBS per wasbeurt, zoals gedemonstreerd. Breng na de laatste wasbeurt de 3D-structuren over op een 96-goed zwarte polystyreenmicroplaat en voeg voorzichtig 200 microliter opruimoplossing toe aan de structuren, waardoor bubbels worden vermeden.

Plaats vervolgens de plaat bedekt met aluminiumfolie op vier graden Celsius gedurende ten minste 48 uur. Om grote 3D-celkweekmodellen in te bedden, gebruikt u een BSA-gecoate pipetpunt van één milliliter om de 3D-structuren zorgvuldig over te brengen naar een glazen buis met vlakke bodem met een PTFE-gevoerde flesdop. Nadat de structuren zijn bezonken, vervangt u de PBS zorgvuldig door 70% ethanol gedurende een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur.

Vervang aan het einde van de incubatie de 70% ethanol door één milliliter gebruiksklare eosine Y-oplossing. Veeg met de buis en bevlek de structuren gedurende ten minste 30 minuten. Aan het einde van de incubatie droogt u de structuren uit met drie opeenvolgende wasbeurten van 30 minuten in één milliliter van 100% ethanol per wasbeurt.

Na de laatste uitdroging, verwijder de 3D-structuren met drie opeenvolgende wasbeurten van 30 minuten in één milliliter xyleen per wasbeurt onder een chemische kap. Na de laatste xyleen onderdompeling, plaats een stuk xyleen gedrenkt biopsie pad in een compartiment van een witte microtwin weefselcassette, en gebruik een BSA gecoate twee milliliter plastic Pasteur pipet om de 3D-structuren op de pad over te brengen. Bedek de 3D-structuren met een ander met xyleen doordrenkt biopsiepad om de 3D-structuren op hun plaats te houden en sluit de cassette.

Wanneer alle monsters zijn overgebracht, plaatst u de cassettes gedurende 30 minuten in een paraffinebad van 65 graden Celsius voordat u de cassettes 's nachts in een vers paraffinebad van 65 graden Celsius plaatst. Voeg de volgende ochtend vloeibare paraffine toe aan een 65 graden Celsius verwarmde ingesloten ingesloten schimmel per monster en plaats een paraffine ingebed monster in elke mal. Roer de mallen voorzichtig totdat alle 3D-structuren naar de bodem vallen en gebruik 65 graden Celsius verwarmde fijne tangen om de 3D-structuren in het midden van elke mal te plaatsen.

Koel de schimmel totdat de paraffine een dunne stevige laag vormt, waardoor de 3D-structuur op zijn plaats wordt vastgezet. Plaats een tissuecassette en voeg hete paraffine toe aan de vorm. Verwijder de schimmel wanneer de paraffine volledig is gestold.

Om kleine 3D-celkweekmodellen in te bedden, wast u de 3D-structuren voorzichtig drie keer in één milliliter TBS per wasbeurt. Verwijder na de laatste wasbeurt zoveel mogelijk TBS zonder de structuren aan te raken en voeg twee druppels reagens twee toe uit een commerciële paraffine-inbeddingskit. Meng zachtjes door te tikken en voeg twee druppels reagens één toe met tikken totdat de gel stolt.

Gebruik een fijne tang om de gel over te brengen uit de put van de voorgemonteerde cassette uit de kit en droog het gel ingebedde monster uit met 30 minuten oplopende ethanol- en xyleenincubaties in een zuurkast zoals aangegeven. Na de laatste xyleen-onderdompeling plaatst u de cassette 's nachts in een paraffinebad van 65 graden Celsius voordat u een fijne tang gebruikt om het in de paraffine ingebedde monster over te brengen naar het midden van een vloeibare paraffine geladen 65 graden Celsius verwarmde inbeddingsvorm. Beveilig vervolgens de 3D-structuur met nog een laag paraffine zoals gedemonstreerd voor de grote 3D-celkweekmodellen.

Driedimensionale kleuring van de hele montering en confocale microscopie bieden visuele informatie over de cellulaire samenstelling en ruimtelijke positie van de 3D-cultuurmodellen tot een gebied van diepte van maximaal 200 micron. De hoge resolutie die kan worden verkregen voor 3D-structuren met behulp van dit protocol maakt de toepassing van cellulaire en subcellulaire segmentatiealgoritmen mogelijk voor kwantificering van het celnummer en de detectie van verschillende celmarkers binnen verschillende celsubtypen. 3D whole mounts-analyse kan worden toegepast op gevisualiseerde cellen tot 200 micron diep, ongeacht de hele structuur.

Integendeel, 2D-sectieanalyse kan inzicht geven in cellen van elke grootte.