Een eenvoudige en flexibele inentingsmethode voor het nauwkeurig beoordelen van echte meeldauw-infectie fenotypen van Arabidopsis en andere planten
9 maart 2021
We presenteren een protocol voor het bouwen van een eenvoudig sporenverdelingssysteem bestaande uit een inentingsdoos met een gaas van ~ 50 μm en een transparante plastic kamer. Dit kan worden gebruikt om planten gelijkmatig in te enten met echte meeldauwsporen, waardoor een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van ziektefenotypen van bestudeerde planten mogelijk wordt.
Echte meeldauw is een belangrijke plantenziekte. Nauwkeurige bepaling van het fenotype van de ziekte vereist zelfs inenting van de ziekteverwekker. Omdat bestaande methoden inefficiënt zijn, hebben we dit protocol ontwikkeld.
Onze sporeninentingsmethode kan gemakkelijk zelfs inenting bereiken en is eenvoudig en schaalbaar. Vandaar dat elk laboratorium dat met echte meeldauw werkt, deze methode gemakkelijk kan gebruiken. De onderzoekers kunnen ook gaas over een kartonnen doos monteren en gebruiken voor sporeninenting.
Hoe sporen los te maken en door gaas te borstelen, is een cruciale stap. Dus dit op video demonstreren kan erg nuttig zijn. Voor dit protocol krijgt u een rol van 50 micrometer nylon membraangaas of 48 micrometer roestvrijstalen gaas.
Snijd groot formaat multiplex met gemiddelde dichtheid in stukken van 24,5X10 inch en 12X10 inch voor het maken van een inentingsdoos. Om een afneembaar bovendeksel met een gaas te maken, snijdt u de lange houten vierkante deuvel in twee sets van 26 inch en 12,75 inch. Lijm en spijker de vier stukken om rond de doos te passen.
Neem acrylplaten en monteer alle acrylplaten in een doos, met behulp van acht hoekklemmen. Knip een 7X2 inch openingsvenster aan de voorkant van de acrylplaat van de doos. Om verse echte meeldauwsporen als ent te bereiden, kweek je schone Arabidopsis immuungecompromitteerde pad4-1 mutante planten in een groeikamer bij 22 graden Celsius en 65% relatieve vochtigheid gedurende zes tot acht weken.
Kweek de planten om infectiefenotypen in standaard flats te bepalen. Ent een of de helft van pad4-1 planten om voldoende verse echte meeldauwsporen te bouwen. Wanneer verse sporen van geïnfecteerde planten beschikbaar zijn, verplaats dan een platte plant in de inentingsdoos in de inentingskamer voor een infectietest.
Snijd 15 tot 20 zwaar geïnfecteerde Arabidopsis-bladeren en laat ze drogen als er gecondenseerd water is. Houd één tot twee bladeren ondersteboven in één hand met een lange tang. Steek vervolgens beide handen door de opening van de kamer en sla zachtjes op de arm van de tang met een schaar, terwijl je langzaam de bladeren boven het gaas beweegt dat op de inentingsdoos is gemonteerd.
Borstel de sporen met fijne waaierblenderborstels door het hele gaasoppervlak in verschillende richtingen om de gelijkmatige verdeling van sporen op de planten te maximaliseren. Dep het gaas een paar keer voorzichtig met de borstels om de sporen die in het gaas vastzitten af te schudden. Zodra de sporen zijn bezinkt, verplaatst u de flat met de geënte planten uit de inentingsdoos.
Bedek de flat met een plastic koepel en plaats deze in een groeikamer bij 22 graden Celsius en 65% relatieve vochtigheid. Ziektefenotypering kan worden uitgevoerd op 5 of 8 tot 12 dagen na inenting. Converteer kartonnen dozen naar een inentingsdoos door de boven- en onderkant van de doos te verwijderen, de hoek vast te plakken om deze stevig te maken en een 50 micrometer gaas aan de bovenkant met lijm te monteren.
Verplaats de flat met de planten in de inentingskamer en plaats de kleinere inentingsdoos bovenop de flat om de planten te bedekken. Maak vervolgens de sporen los en borstel ze. Maak een mini-inentingsdoosje iets groter dan een petrischaaltje.
Bewaar de borden op vier graden Celsius in een koelkast tot gebruik. Snijd een of twee volledig uitgezette bladeren van de basis van de bladsteel voor elke te testen plant. Steek de bladsteel van de losgemaakte bladeren in het agarmedium onder een hoek van 30 graden.
Ent de bladeren in de inentingskamer en verplaats de plaat met het deksel naar een groeikamer. Voor het beoordelen van infectiefenotypen, breng de bladeren over naar een verse aseptische MS-agarplaat vier of vijf dagen na inenting. Snijd de basis van de bladsteel voordat u de bladeren in het verse agarmedium steekt.
Beoordeel de fenotypen van de ziekte acht of negen dagen na de inenting. De microscopische analyse toonde een gelijkmatige verdeling van sporen op de microscopische dia's op de bodem van de flat. De berekende dichtheid van sporen, verdeeld over zes verschillende locaties na lichte inentingen, vertoonde geen significante verschillen.
Vergelijkbare resultaten werden bereikt na zware inentingen met sporen. De inentingsgelijkheid werd onderzocht tussen verschillende plantengenotypes op 12 dagen na zware inenting. De pad4-1-planten vertoonden een verhoogde ziektegevoeligheid in vergelijking met Columbia 0, de wilde type planten.
Het gebruik van voldoende verse sporen, geproduceerd ongeveer 10 dagen na inenting, op gevoelige planten, is belangrijk, omdat verse sporen gemakkelijker te verjagen zijn en meer kans hebben om kolonisatie te vestigen. Echte meeldauw koloniseert alleen epidermale cellen van planten. Isolatie van met echte meeldauw geïnfecteerde cellen door het pellen van de epidermis, of lasermicrodissectie, zou een meer gerichte transcriptomische en proteomische studie van gastheerresponsen mogelijk maken.
Deze methode zal onderzoekers helpen om de fenotypen van echte meeldauwinfectie efficiënter te bepalen en zou daarom effectievere functionele studies naar interacties tussen echte meeldauw van planten moeten vergemakkelijken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een veilig, efficiënt en reproduceerbaar systeem voor het fenotyperen van ziekten bij Arabidopsis-planten die zijn geïnfecteerd met echte meeldauw, een biotroof schimmelpathogeen. Het protocol pakt uitdagingen aan bij het bereiken van een gelijkmatige inoculatie en een nauwkeurige beoordeling van ziektefenotypes, en biedt gedetailleerde stappen voor het construeren en gebruiken van gespecialiseerde inoculatieapparatuur om de resultaten van onderzoek naar plant-pathogeeninteracties te verbeteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantpathologie
- Interacties tussen planten en microben
- Experimentele plantbiologie
Achtergrond
- Echte meeldauw is een belangrijke schimmelziekte die planten treft, waaronder Arabidopsis.
- Nauwkeurige fenotypering van de ziekte is essentieel voor het begrijpen van plantimmuniteit en schimmelpathogenese.
- Bestaande inoculatiemethoden leiden vaak tot een ongelijkmatige verdeling van sporen, wat de reproduceerbaarheid beperkt.
- Biotrofe pathogenen zoals echte meeldauw zijn moeilijk te kweken, wat de inspanningen voor fenotypering bemoeilijkt.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudig, schaalbaar en kosteneffectief systeem voor een gelijkmatige inoculatie van Arabidopsis met meeldauwsporen.
- Het verbeteren van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van ziektefenotypering in studies naar plant-schimmelinteracties.
- Het bieden van gedetailleerde protocollen en demonstraties voor het construeren en gebruiken van het inoculatiesysteem.
Gebruikte methoden
- Constructie van een houten inoculatiebox met een afneembaar gaasdeksel (50 μm nylon of 48 μm roestvrijstalen gaas).
- Gebruik van een transparante acryl inoculatiekamer met een kleine opening aan de voorzijde om het ontsnappen van sporen te minimaliseren.
- Voorbereiding van verse meeldauwsporen van geïnfecteerde pad4-1 Arabidopsis planten.
- Gelijkmatige verdeling van sporen door sporen via het gaas op planten of losgekoppelde bladeren te borstelen en te kloppen.
- Beoordeling van infectie-fenotypes op meerdere tijdstippen na inoculatie.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt een gelijkmatige en reproduceerbare verspreiding van meeldauwsporen over plantenbakken en losse bladeren mogelijk.
- Microscopische analyse bevestigde een uniforme sporendichtheid op meerdere locaties na zowel lichte als zware inoculaties.
- pad4-1 mutantplanten vertoonden een verhoogde vatbaarheid voor ziekten in vergelijking met wild-type controles.
- Verse sporen (geproduceerd ~10 dagen na inoculatie) waren effectiever voor kolonisatie en fenotypering.
Conclusies
- Dit systeem biedt een betrouwbare en toegankelijke methode voor een gelijkmatige inoculatie en nauwkeurige fenotypering van ziekten in studies naar Arabidopsis-meeldauw.
- De aanpak is aanpasbaar, kosteneffectief en geschikt voor een breed scala aan laboratoria.
- Verbeterde fenotypering zal functionele studies naar plantimmuniteit en pathogeeninteracties faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Nauwkeurige en reproduceerbare fenotypering van ziekten is een kritiek knelpunt in onderzoek naar plant-pathogenen, wat een directe impact heeft op de voorspellende betrouwbaarheid van target-validatie en functionele studies. Dit flexibele inoculatiesysteem maakt een gestandaardiseerde, gelijkmatige toediening van sporen mogelijk voor infectie met meeldauw, wat robuuste hypothesetoetsing en mechanistische risicoreductie ondersteunt in vroege discovery-pipelines. De aanpasbaarheid en schaalbaarheid maken het tot een herbruikbare capaciteit voor translationeel onderzoek naar plantimmuniteit en R&D voor gewasbescherming.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt een grondige analyse van immuunroutes in planten mogelijk door een uniforme blootstelling aan pathogenen te waarborgen.
- Ondersteunt de functionele validatie van genetische targets via reproduceerbare fenotypering van infecties.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door variabiliteit in ziekte-uitkomsten te minimaliseren.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor downstream beslissingen bij de triage van portfolio's.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde plant-pathogeensystemen voor voor screening-workflows met een hoge betrouwbaarheid.
- Standaardiseert inoculatiecondities om de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van assays te verbeteren.
- Levert kwantitatieve, ruimtelijk uniforme infectieresultaten voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Maakt schaalbare en kosteneffectieve implementatie van assays mogelijk voor verschillende onderzoeksteams.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt fenotypische resultaten af met ziekterelelevante plantmodellen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaatgenen of behandelingen op basis van robuuste infectiegegevens.
- Biedt een platform voor gerichte transcriptomische en proteomische studies naar gastheer-pathogeeninteracties.
- Vermindert het biologische risico in een late fase door de kwaliteit van gegevens in een vroege fase te verbeteren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze inoculatiemethode kan naadloos worden geïntegreerd, van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinische validatie, in onderzoekspijplijnen voor plantenziekten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurde toetsing van mechanismen van plantimmuniteit en pathogenen virulentie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve infectie-fenotypes voor assay-gereedheid en compound-screening.
- Analytics: Biedt uniforme read-outs die robuuste statistische vergelijking tussen genotypen en behandelingen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft continuïteit tussen discovery-fenotypering en preklinische validatie in ziekterelevante systemen.
- Enterprise Reuse: Biedt een kosteneffectief, aanpasbaar platform voor herhaaldelijk gebruik in diverse plant-pathogeenstudies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar plant-pathogeeninteracties.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van infectie-assays.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie mogelijk door de kwaliteit van gegevens in de beginfase te verbeteren.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van genetische of chemische leads.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in plantpathologie en fenotyperingsanalyse.
- Vereist een basislaboratoriuminfrastructuur voor de assemblage van dozen en kamers en gecontroleerde groeiomstandigheden.
- Vereist cross-team standaardisatie van inoculatie- en fenotyperingsprotocollen.
- Aanpasbaar aan diverse plantensoorten en pathogeensystemen door middel van aanpassingen aan het gaas en de kamer.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van verse, levensvatbare sporen voor een optimale consistentie van de infectie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Making a Standard Inoculation Box with a Removable Top Lid Mounted with a Mesh
1:17
Making an Inoculation Chamber and Inoculating Plants in Flats
3:13
Inoculate Plants with Smaller Inoculation Boxes
3:42
Inoculate Detached Leaves in Petri Dishes
4:37
Results: Assessment of Inoculation Evenness
5:19
Conclusion
