Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen

In combinatie met live cell calcium imaging maakt de acute pancreas tissue slice techniek de studie mogelijk van intercellulaire golven en meercellige functionele connectiviteit met een hoge resolutie over lange tijdsperioden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het snel is, de weefselarchitectuur behoudt en beperkte enzymatische en mechanische stress vermindert met behoud van een hoge opbrengst van weefsel. Door functionele en morfologische veranderingen tijdens ziekteprogressie te detecteren, helpt deze techniek ons begrip van de pancreasgerelateerde ziekten, zoals diabetes.

Deze weefselsegmenttechniek kan worden toegepast op hersen-, hypofyse- en bijnierweefsels met de nadruk op het behoud van intercellulair contact, paracriene interacties en weefselarchitectuur. Om zich voor te bereiden op de injectie van agarose in de alvleesklier van de muis, vult u een spuit van vijf milliliter met 40 graden Celsius vloeibare agarose en rust u de spuit uit met een naald van 30 gauge. Nadat u de naald zorgvuldig met een dop hebt bedekt, plaatst u het uiteinde van de spuitnaald naar beneden, met het volledige volume agarose onder het wateroppervlak, in een waterbad van 40 graden Celsius.

Bel een fles extracellulaire oplossing met carbogen, continu op ijs, met 1,5 milliliter per minuut bij barometrische druk en kamertemperatuur om oxygenatie en een pH van 7,4 te garanderen. Om de agarose-injectie uit te voeren, plaatst u een geëuthanaseerde volwassen muis onder een stereomicroscoop en krijgt u toegang tot de buik van de muis via laparotomie. Beweeg de darm voorzichtig naar de linkerkant om het gemeenschappelijke galkanaal bloot te leggen en gebruik een tang om het duodenale uiteinde van het kanaal iets op te tillen om de papilla van Vater te lokaliseren.

Gebruik een hemostat om het galkanaal bij de twaalfvingerige darmpapillen te klemmen om lekkage van de agarose uit het kanaal in de twaalfvingerige darm te voorkomen en gebruik een kleine scherpe tang om onder het gemeenschappelijke galkanaal te reiken om het membraan te breken dat het kanaal aan het pancreasweefsel hecht. Nadat u zoveel mogelijk vet en bindweefsel uit het kanaal hebt verwijderd, plaatst u het kanaal loodrecht op de uiteinden van een grotere tang en drukt u stevig op de zuiger van de spuit, injecteert u de viskeuze vloeistof die gedurende 20 tot 30 seconden in het proximale uiteinde van het gemeenschappelijke galkanaal is ontstaan. Wanneer het weefsel witachtig en licht opgezwollen wordt, verwijder dan de spuit en giet langzaam 20 milliliter van de gebubbelde ijskoude extracellulaire oplossing op de alvleesklier om het weefsel af te koelen en de agarose te verharden.

Om plakjes pancreasweefsel te verkrijgen, gebruikt u een tang en een fijne taai gesneden schaar om de agarose geïnjecteerde pancreas voorzichtig over te brengen in een petrischaaltje van 100 millimeter met 40 milliliter ijskoude extracellulaire oplossing. Draai de schaal om het weefsel te spoelen en breng de alvleesklier over in een tweede schaal met ijskoude extracellulaire oplossing. Gebruik de tang en de schaar om het witachtige, goed geïnjecteerde pancreasgedeelte in maximaal zes stukjes van 0,1 tot 0,2 kubieke centimeter te knippen en verwijder eventueel achtergebleven bind- en vetweefsel uit de weefselstukken.

Plaats de gereinigde blokken in een 35 millimeter niet-kleverige bodem petrischaal met ongeveer vijf milliliter van 40 graden Celsius vloeibare agarose en plaats de petrischaal onmiddellijk op ijs. Wanneer de agarose is uitgehard, houdt u de petrischaal ondersteboven boven het deksel van een petrischaaltje van 100 millimeter en gebruikt u de helft van een scheermesje om voorzichtig in de marge tussen de zijwand van de petrischaal en de agarose te snijden om de agarose uit de schaal te verwijderen. Gebruik het scheermesje om individuele blokjes, elk met één weefselblok agarose, uit de vrijgekomen agarose te snijden en gebruik cyanoacrylaatlijm om de blokken aan de monsterplaat van een vibratoom te bevestigen.

Vul de snijkamer van het vibratoom met 150 milliliter ijskoude extracellulaire oplossing die continu bubbelt met carbogen. Schroef bevestig de monsterplaat op het vibratoom en monteer een nieuw scheermesje. Omring de kamer met ijs en voeg twee ijsblokjes met een volume van 10 milliliter toe, gemaakt met een extracellulaire oplossing aangevuld met zes millimolglucose.

Stel de snijmachine in op 0,05 tot 1 millimeter per seconde en 70 hertz en begin dan met snijden om 140 micron dikke agarose-plakjes te verkrijgen met een oppervlak van 20 tot 100 vierkante millimeter. Gebruik een fijne verfkwast om elk plakje voorzichtig over te brengen in een petrischaaltje van 100 millimeter gevuld met 40 millimeter HEPES-buffer aangevuld met zes millimolglucose. Los voor calciumkleurstofpreparaat 50 microgram celdoorlatende calciumindicatorkleurstof, 7,5 microliter DMSO en 2,5 microliter poloxameer en 6,667 milliliter HBS op in een 15 milliliter schroefdopbuis.

Gebruik een pipet om de oplossing gedurende 20 seconden grondig te mengen voordat u de buis onderdompelt in een ultrasone badkamer en vortexing, elk gedurende 30 seconden. Vervolgens aliquot 3,333 milliliter van de resulterende calciumindicatorkleurstofoplossing in één petrischaaltje van 5 milliliter per 10 plakjes weefsel die moeten worden geëtiketteerd. Gebruik voor het laden van kleurstoffen een dunne zachte verfkwast om tot 10 weefselplakken over te brengen naar elke schaal met kleurstofoplossing en plaats de schotels op een orbitale shaker gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur en 40 omwentelingen per minuut beschermd tegen licht.

Breng aan het einde van de incubatie tot 20 gekleurde plakjes over in afzonderlijke petrischalen van 60 milliliter gevuld met kleurstofvrije HBS. Selecteer voor calciumbeeldvorming door confocale microscopie een vergroting van 20 of 25 keer en stel de acquisitiemodus in op time-lapse-beeldvorming, het gaatje op 100 tot 200 micron en de excitatie en emissie voor de fluorofoor die in het experiment wordt gebruikt. Monteer de opnamekamer en het perfusiesysteem op de temperatuurgecontroleerde fase van de microscoop en plaats de in- en uitlaat op de uiterste randen van de opnamekamer.

Stel de in- en uitstroomsnelheden in op één tot twee milliliter per minuut. Stel de temperatuur van het profusiesysteem in op 37 graden Celsius en start de profusie met de niet-stimulerende oplossing. Om de calciumdynamiek van het weefsel vast te leggen, plaatst u een enkel weefselsegment in de opnamekamer en immobiliseert u het weefsel met een U-vormig platinagewicht met een strak nylon gaas.

Gebruik de optie Bright-Field om de structuur van belang te lokaliseren en gebruik live imaging om de bestudeerde structuren in het gezichtsveld te plaatsen. Om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren, past u het laservermogen, de detectorversterking en het lijngemiddelde binning aan terwijl het laservermogen minimaal blijft. Pas het brandpuntsvlak aan tot 15 micron onder het snijoppervlak om opname van mogelijk beschadigde cellen te voorkomen en de beelden te verkrijgen.

Stel de bemonsteringsfrequentie in op één tot twee hertz om de eerste detectie van individuele oscillaties mogelijk te maken en een afbeelding met een hoge resolutie op te nemen. Gebruik, indien beschikbaar, een online grafiek om direct feedback te krijgen over de voorbereidingsreactie, oververlichting, fotobleaching en mechanische drift. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, slaat u de gegevens op voor latere analyse.

Hier kan een voorbeeld worden waargenomen van een optimaal weefselsegment waarin de celdoorlatende calciumindicatorkleurstof met succes in het pancreasweefselsegment werd geladen. Daarentegen zijn deze weefselplakken niet optimaal voor beeldvorming vanwege een mislukte kleurstofpenetratie, een gebrek aan eilandjescellen of een overvloed aan necrotisch weefsel op het oppervlak van de monsters. Hoge resolutie beelden van een pancreasweefselschijf kunnen worden gebruikt om verschillende regio's van het pancreasweefsel af te bakenen, zoals de eilandjes langerhans, acinair weefsel of het pancreaskanaal.

Stimuli kunnen worden gebruikt om functioneel onderscheid te maken tussen verschillende eilandjescellen of tussen eilandjes en niet-eilandjescellen. Bètacellen reageren bijvoorbeeld meestal op een glucosestimulatie met een vierkante puls door een voorbijgaande toename van intracellulair calcium te vertonen, gevolgd door een snelle calciumoscillaties op een aanhoudend plateau. Niet-bètacellen reageren daarentegen met snellere en onregelmatigere oscillaties.

Een vertraging in het begin van intracellulaire calciumtoename na stimulatie, evenals de heterogeniteit en vertragingen tussen individuele cellen kunnen ook worden gemeten. Dezelfde parameters kunnen worden gebruikt om de deactiveringsfase te beschrijven. Hier kan een schematische presentatie van de intracellulaire calciumoscillatieduur, frequentie en percentage actieve tijd worden waargenomen.

Bij beeldvorming met acquisitiesnelheden van meer dan 10 hertz kunnen calciumgolven die zich herhaaldelijk over het eilandje verspreiden duidelijk worden herkend. Klem het gemeenschappelijke galkanaal zo dicht mogelijk bij de twaalfvingerige darm om te voorkomen dat per ongeluk de tak die de alvleesklier binnendringt, wordt afgesloten. Stop ook niet met het indrukken van de zuiger tijdens de injectie, omdat de agarose onmiddellijk in de naald zal uitharden.

De acute muis pancreasweefsel slice techniek kan ook worden gebruikt met de patch clamp methode om ionkanaalstromen te bestuderen en toegang te krijgen tot cytosis, evenals immunohistochemische studies en secretaresse studies.