Name: Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Leer calciumdynamiek bestuderen in acute pancreasweefselplakken van muizen met confocale laserscanningmicroscopie. Deze methode behoudt de native weefselarchitectuur en intercellulaire communicatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk dat in deze studie werd gepresenteerd, werd financieel ondersteund door het Sloveense onderzoeksbureau (onderzoekskernfinanciering nos. P3-0396 en I0-0029, evenals onderzoeksprojecten nos. J3-9289, N3-0048 en N3-0133) en door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterale subsidies I3562--B27 en I4319--B30). Wij danken Maruša Rošer, Maša Čater en Rudi Mlakar voor de uitstekende technische assistentie.

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enig commercieel of financieel belang.

De alvleesklier van zoogdieren is een grote exocriene en endocriene klier. Het exocriene deel vormt 96-99% van het totale pancreasvolume en bestaat uit acini en kanalen. Het endocriene deel bestaat uit een groot aantal eilandjes van Langerhans die goed zijn voor de resterende 1-4% van het totale pancreasvolume1. Het exocriene deel scheidt belangrijke spijsverteringsenzymen af die energierijke polymeren in voedsel afbreken, evenals een bicarbonaatrijke vloeistof, die combineert met andere gastro-intestinale afscheidingen om een omgeving te bieden die geschikt is voor de werking van enzymen. Het endocriene deel scheidt hormonen af die de postprandiale distributie, opslag en interprandiale afgifte van energierijke voedingsstoffen reguleren. Hoewel het exocriene weefsel relatief onderontwikkeld is en het endocriene relatief goed ontwikkeld bij de geboorte, overgroeit het eerste snel het laatste bij het spenenvan 2,3,4. Vroege studies van de pancreasfunctie markeerden de geboorte van de moderne fysiologie, en belangrijke methodologische vooruitgang in het veld is gevolgd door grote wetenschappelijke onderbrekingen5. Werken met de alvleesklier is technisch uitdagend vanwege de ingewikkelde structuur van de klier, maar is ook een grote motivatie vanwege ziekten zoals alvleesklierkanker, pancreatitis en diabetes die grote bedreigingen voor de volksgezondheid vormen en waarvoor nieuwe therapeutische benaderingen nodig zijn.
Geïsoleerde eilandjes6, acini 7,8 en ductale fragmenten werden al tientallen jaren ontwikkeld en gebruikt als gouden standaardmethoden vanwege hun voordelen in vergelijking met cellijnen en primaire gedispergeerde endocriene, acinaire en ductale cellen 9,10. Ondanks de duidelijk verbeterde functie van geïsoleerde celcollectieven, brengen deze methoden nog steeds aanzienlijke mechanische en enzymatische stress met zich mee, isoleren cellen uit het omliggende weefsel en missen dus paracriene interacties en mechanische ondersteuning, en vooral, gaan gepaard met significante veranderingen in de normale fysiologie 11,12,13 . De acute pancreasweefselschijf bij muizen werd in 2001 ontwikkeld vanuit een waargenomen behoefte om een experimenteel platform te ontwikkelen dat vergelijkbaar is met hersen-, hypofyse- en bijniersegmenten met bewaarde intercellulaire contacten, paracriene interacties, mesenchym en weefselarchitectuur, evenals zonder enkele van de belangrijkste tekortkomingen van de gouden standaardmethode in eilandjesonderzoek van die tijd - de geïsoleerde eilandjes12, 14. Onder deze tekortkomingen zijn schade aan de buitenste lagen, gebrek aan toegankelijkheid van kerneilandjesgebieden en de behoefte aan cultivatie met mogelijk belangrijke effecten op de celidentiteit en fysiologie12,15. Bovendien maakt de tissue slice-methode studies mogelijk op diermodellen met een sterk gestoorde eilandjesarchitectuur waarbij het onmogelijk is om eilandjes te isoleren, of wanneer de opbrengst van eilandjes extreem laag is door traditionele isolatie 16,17,18,19,20,21.
Bovendien is de plak meer geschikt voor het bestuderen van morfologische veranderingen tijdens de ontwikkeling van diabetes en pancreatitis, bijvoorbeeld, omdat het een beter overzicht van het hele weefsel mogelijk maakt en ook compatibel is met het bestuderen van regionale verschillen. Belangrijk is dat, ondanks de vroege focus op het endocriene deel, de tissue slice-methode inherent de studie van de exocriene componentenmogelijk maakt 9,22,23. Tijdens het eerste decennium na de introductie werd de methode gebruikt voor elektrofysiologische studies van bèta 14,24,25,26,27,28,29 en alfa 30,31 cellen en voor het onderzoeken van de morfologische en functionele rijping van de alvleesklier 2,3 . Een decennium later, in 2013, werd de methode met succes aangepast voor live-cell calcium beeldvorming van eilandjescellen met behulp van CLSM om hun reacties op glucose32, hun functionele connectiviteitspatronen33 en de relatie tussen membraanpotentiaal en intracellulair calcium te karakteriseren door een fluorescerende calciumkleurstof te combineren met een membraanpotentiaalkleurstof34. Later in hetzelfde jaar werd de methode ook gebruikt om de calciumdynamiek in acinaire cellente beoordelen 22,35. In de daaropvolgende jaren zijn pancreasweefselplakken gebruikt in een aantal verschillende onderzoeken en met succes aangepast aan varkens- en menselijk weefsel 9,36,37,38,39,40,41. Echter, alles bij elkaar genomen, wordt calciumbeeldvorming - in pancreasweefselplakken van muizen in het algemeen en in eilandjes in het bijzonder - nog steeds meestal door deze groep uitgevoerd. Een van de belangrijkste redenen hiervoor kan liggen in de combinatie van een technisch uitdagende weefselsegmentbereiding, de behoefte aan een confocale microscoop en vrij complexe gegevensanalyse. Het belangrijkste doel van dit artikel is om deze krachtige methode toegankelijker te maken voor andere potentiële gebruikers.
Er zijn al enkele uitstekende methodologische artikelen die in detail ingaan op de bereiding van weefselplakjes en het gebruik van plakjes voor structurele en secretiestudies, maar niet voor confocale calciumbeeldvorming 9,42,43. Daarom richt dit artikel zich op enkele aanvullende tips en trucs tijdens de bereiding van plakjes, op stappen die cruciaal zijn voor het succesvol laden van kleurstoffen, beeldacquisitie en op de belangrijkste stappen van elementaire calciumgegevensanalyse. Daarom moet deze bijdrage worden beschouwd als een aanvulling op de bovengenoemde methode in plaats van als een alternatief voor de bovengenoemde methode. Evenzo moet calciumbeeldvorming in pancreasweefselplakken van muizen worden beschouwd als een experimentele benadering die moet worden gebruikt om specifieke vragen te beantwoorden en dus eerder een aanvulling vormt op dan een absoluut alternatief voor andere calciumbeeldvormingsbenaderingen in de pancreasfysiologie, zoals geïsoleerde kanalen of acini, geïsoleerde eilandjes, organoïden, eilandjes die in de voorste oogkamer zijn getransplanteerd; en opnames in vivo 11,44,45,46,47,48. De belofte van calciumbeeldvorming in pancreasweefselplakken van muizen wordt waarschijnlijk het best geïllustreerd door recente succesvolle opnames van calciumdynamica in mesenchymale cellen zoals pericyten49 en macrofagen50, evenals in ductale cellen23.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td><td>KERN &amp; SOHN GmbH</td><td>ALJ 160-4A</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td><td>Leica</td><td>5100001578</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;15 mL centrifuge tubes</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>CLS430790</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td><td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td><td>432124</td><td></td></tr><tr><td>Double edge razor blade</td><td>Personna, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Fine Forceps</td><td>FST, Germany</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.023</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask 200 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>027.01.100</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - ToughCut</td><td>FST, Germany</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Flat orbital shaker&nbsp; IKA KS 260 basic</td><td>IKA</td><td>Ident. No.: 0002980200</td><td></td></tr><tr><td>Glass lab bottle 1000 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>091.01.901</td><td></td></tr><tr><td>Hartman Hemostat, curved</td><td>FST, Germany</td><td>13003-10</td><td></td></tr><tr><td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td><td>Leica</td><td>15507701</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinder 25 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>015.01.025</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>&nbsp;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td><td></td></tr><tr><td>Microwave owen</td><td>Gorenje, Slovenia</td><td>MO20MW</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer Gonotec 010</td><td>Gonotec, Berlin, Germany</td><td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td>Faber-Castell, No.2</td><td></td><td>Elke dunne zachte ronde penseel No.2, bij voorkeur zwart</td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perifusion pumps</td><td>Ismatec</td><td>ISM 827</td><td>Reglo Analog MS - 4/8</td></tr><tr><td>Petri dish 100/20 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35/10 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>153066</td><td>NIET-PLAKKEN voor agarose blokken</td></tr><tr><td>pH meter inoLab pH Level 1</td><td>WTW, Weilheim, Germany</td><td>E163694</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 1000 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3121 000.120</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3121 000.066</td><td></td></tr><tr><td>Push pins 23 mm</td><td>Deli, Ningbo, China</td><td>E0021</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap tube, 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Semken Forceps</td><td>FST, Germany</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td><td>IsoLab, Germany</td><td>027.11.048</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td><td>Nikon, Melville, NY USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2")</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td><td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td></tr><tr><td>Tubings for perifusion system</td><td>Ismatec</td><td>SC0310</td><td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td><td>Globaltronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>14047235613</td><td></td></tr><tr><td>Volumetric flask 1000 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>013.01.910</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td><td>Neolab</td><td>&nbsp;7-2020</td><td></td></tr><tr><td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z527912</td><td></td></tr><tr><td>Material/Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DL-lactic acid</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>L1250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td><td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td><td>WK 110-020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>A9,290-2</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td><td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td><td>O6807</td><td>celpermeabie Ca2+<

confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

De acute pancreasweefselschijf van de muis is een uniek in situ preparaat met geconserveerde intercellulaire communicatie en weefselarchitectuur die aanzienlijk minder door voorbereiding geïnduceerde veranderingen met zich meebrengt dan geïsoleerde eilandjes, acini, kanalen of gedispergeerde cellen beschreven in typische in vitro studies. Door de acute pancreasweefselschijf te combineren met live-cell calcium beeldvorming in confocale laserscanmicroscopie (CLSM), kunnen calciumsignalen tegelijkertijd worden bestudeerd in een groot aantal endocriene en exocriene cellen, met een eencellige of zelfs subcellulaire resolutie. De gevoeligheid maakt de detectie van veranderingen mogelijk en maakt de studie van intercellulaire golven en functionele connectiviteit mogelijk, evenals de studie van de afhankelijkheid van fysiologische reacties van cellen op hun lokalisatie binnen het eilandje en paracriene relatie met andere cellen. Ten slotte verlaagt het registreren van signalen van een groot aantal cellen tegelijk vanuit het oogpunt van dierenwelzijn het aantal dieren dat nodig is voor experimenten, wat bijdraagt aan het 3R-vervangings-, reductie- en verfijningsprincipe.

De injectie van de agarose-oplossing in het pancreaskanaal is de meest kritieke stap in de voorbereiding van pancreasweefselsneden. Een succesvolle injectie kan worden herkend aan een bleken van het pancreasweefsel, zoals te zien aan de linkerkant van figuur 3A, terwijl een onvolledig geïnjecteerd deel van de pancreas aan de rechterkant van figuur 3A wordt weergegeven. De eilandjes van Langerhans zijn te herkennen met het blote oog of onder een stereomicroscoop, en dit helpt bij het snijden van de juiste delen van de alvleesklier voor latere inbedding in agarose-blokken (figuur 3B). In een vers gesneden pancreasweefselschijf van muizen kunnen eilandjes Langerhans gemakkelijk worden onderscheiden van het omliggende exocriene weefsel en mesenchym als witte vlekken onder de stereomicroscoop (figuur 3C) of als bruinachtige structuren onder de lichtmicroscoop (figuur 3D). De plakjes pancreasweefsel kunnen worden gebruikt voor verschillende soorten experimenten gedurende ten minste 12 uur na het snijden. Naast de grove morfologische beoordeling onder de stereomicroscoop, de lichtmicroscoop en de functionele reacties van cellen tijdens calciumbeeldvorming, kan de levensvatbaarheid van de pancreasweefselschijfjes worden beoordeeld (figuur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Figuur 4: Levensvatbaarheid van cellen in het weefselsegment. De levensvatbaarheid van cellen werd bepaald met de Live/Dead-test. Levende cellen worden gekleurd door Calcein AM (weergegeven in groen), terwijl dode cellen worden gekleurd met ethidium homodimeer-1 (weergegeven in rood). Gele lijnen geven de positie aan van de X-Y-doorsnede van de Z-stack die onderaan en rechts wordt weergegeven. De volledige diepte van de Z-stack is 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Voor calciumbeeldvormingsexperimenten moet de fluorescerende calciumindicator door een paar lagen cellen dringen. Figuur 5A toont een succesvolle belasting van de celdoorlatende Ca2+ indicatorkleurstof in de pancreasweefselschijf waarin individuele eilandjes en acinaire cellen kunnen worden herkend. Daarentegen zijn plakjes in figuur 5B-D niet optimaal vanwege mislukte penetratie van de kleurstof (figuur 5B), gebrek aan eilandjescellen (figuur 5C) en veel necrotisch weefsel op het oppervlak (figuur 5D). Dergelijke plakjes kunnen worden weggegooid, gecontroleerd op de aanwezigheid van extra eilandjes die beter zijn gesneden of gekleurd (zie tabel 1 voor probleemoplossing), of worden gebruikt voor het registreren van de reacties van exocriene cellen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Figuur 5: Voorbeelden van bruikbare en onbruikbare preparaten. (A) Een voorbeeld van een succesvolle bereiding van het pancreasweefsel met goed gekleurde cellen in de eilandjes van Langerhans, evenals ductale cellen en het omliggende acinaire weefsel. (B) Een voorbeeld van een slecht gekleurd plakje weefsel. (C) Voorbeeld van een eilandje Langerhans met structurele stopzettingen. (D) Een voorbeeld van een eilandje Langerhans met veel dode cellen en veel puin. De opzoektabel "glow-over, glow-under" aan de rechterkant geeft 0 intensiteit in groen en verzadiging in blauw weer. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Representatieve resultaten van calciumbeeldvorming met behulp van de celdoorlatende Ca2+ indicatorkleurstof zijn weergegeven in figuur 6. In figuur 6A wordt een afbeelding met hoge resolutie van een plakje pancreasweefsel gepresenteerd, met een eilandje Langerhans, acinair weefsel en een pancreaskanaal. Voor een beter onderscheid zijn het endocriene, exocriene en ductale deel van het pancreasweefselsegment in figuur 6A gekleurd in figuur 6B. Het gebruik van geschikte stimuli kan functioneel onderscheid maken tussen verschillende eilandjescellen, of eilandjes- en niet-eilandjescellen51. Bètacellen reageren meestal op een stimulatie van de vierkante puls door glucose met een voorbijgaande toename van [Ca2+]IC gevolgd door snelle calciumoscillaties op een aanhoudend plateau (figuur 6C, bovenpaneel).
Omdat alle bètacellen zijn gekoppeld aan een enkel, groot, functioneel syncytium, worden deze oscillaties ook zeer goed gesynchroniseerd tussen verschillende cellen door middel van het verspreiden van [Ca2+]IC-golven 32,34,52,53,54 (figuur 7C). Langzamere [Ca2+]IC-oscillaties met een periode van 5-15 minuten kunnen ten grondslag liggen aan de snelle oscillaties of zelfs het overheersende type reactiezijn 55,56. Hetzelfde eenvoudige protocol kan andere soorten reacties onthullen, vooral aan de rand van eilandjes (figuur 6C, onderste paneel). Omdat deze cellen niet gesynchroniseerd zijn met bètacellen en reageren met snellere en onregelmatigere oscillaties die al aanwezig zijn in lage glucosecondities of met een afname van de activiteit, zijn dergelijke reacties zeer suggestief voor niet-bètacellen 21,32,57,58. Hun definitieve functionele karakterisering vereist echter complexere protocollen met extra stimulatiestappen of alternatieve benaderingen, die hieronder worden besproken. Typische reacties van acinaire en ductale cellen worden weergegeven in respectievelijk figuur 6D en figuur 6E. Raadpleeg de literatuur voor meer informatie over acinaire en ductale cellen 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Figuur 6: Representatieve resultaten van calciumdynamiek in verschillende soorten pancreascellen. (A) Een hoge resolutie afbeelding van een eilandje Langerhans met omringend weefsel. Schaalbalk = 100 μm. (B) Afbakening van verschillende delen van pancreasweefsel met acinair weefsel in geel, een eilandje Langerhans in rood en een segment van de ductale boom in blauw. Schaalbalk = 100 μm. (C) Typische sporen van calciumdynamiek in bèta- en vermeende niet-bètacellen tijdens stimulatie met 12 mM glucose; 3 mM glucose werd gebruikt voor niet-stimulerende aandoeningen. Protocollen die kunnen worden gebruikt voor meer specifieke discriminatie van niet-bètacellen worden beschreven in de discussiesectie. (D) Een typisch spoor van calciumdynamica van acinaire cellen gestimuleerd door 25 nM acetylcholine. (E) Een typisch spoor van calciumdynamica van ductale cellen gestimuleerd door 1 mM chenodeoxycholzuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Na succesvolle calciumbeeldvorming worden de gegevens eerst geëxporteerd en gecorrigeerd voor bleken door een combinatie van een exponentiële en lineaire fit, zoals beschreven in de protocolsectie. Een tijdreeks voor en na bleekcorrectie is weergegeven in figuur 7A. Daarna kunnen verschillende parameters in de activerings- en deactiveringsfase van de respons en de plateaufase worden geanalyseerd. Een vertraging in het begin van [Ca2+]IC-toename na stimulatie kan worden gemeten zoals weergegeven door vertragingA in figuur 7B en de heterogeniteit in vertragingen tussen individuele cellen (vertragingA1). Dezelfde parameters (vertragingD en vertragingD1) kunnen worden gebruikt om de deactiveringsfase te beschrijven. Na de initiële voorbijgaande [Ca2+]IC-toename , wordt de plateaufase in de meeste bètacellen van de pancreas op een eilandje gekenmerkt door relatief regelmatige hoogfrequente [Ca2+]IC-oscillaties . De plateaufase kan worden beschreven door de klassieke functionele parameters te analyseren. De schematische presentatie van [Ca2+]IC-oscillaties duur, frequentie en percentage van de actieve tijd worden weergegeven in figuur 7C. In calciumbeeldvorming met acquisitiesnelheden hoger dan 10 Hz zijn calciumgolven die zich herhaaldelijk over het eilandje verspreiden ook duidelijk te herkennen (figuur 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Figuur 7: Analyse van tijdreeksgegevens. (A) Correctie van tijdreeksgegevens voor fotobleaching. (B) Analyse van vertragingen bij activering na stimulatie en bij deactivering na stopzetting van de stimulatie met 12 mM glucose. De duur van de stimulatie wordt aangegeven door de lichtgrijze, gearceerde balk in de afbeelding. (C) Analyse van verschillende parameters van de plateaufase: I) Duur van de oscillatie bepaald op halve hoogte, II) frequentie van oscillaties bepaald door inter-oscillatie-intervallen. III) actieve tijd als product van frequentie en duur van oscillaties. I-IV) Vertragingen tussen oscillaties in een bepaalde golf van oscillaties die zich over het eilandje Langerhans verspreiden, bepaald door de vertragingen (Δt) in de tijd waarop een enkele cel de halve hoogte van de oscillatie bereikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

We presenteren de bereiding van acute pancreasweefselplakken en hun gebruik in confocale laserscanmicroscopie om calciumdynamica gelijktijdig te bestuderen in een groot aantal levende cellen, gedurende lange tijdsperioden en met een hoge spatiotemporale resolutie.

Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

In combinatie met live cell calcium imaging maakt de acute pancreas tissue slice techniek de studie mogelijk van intercellulaire golven en meercellige functionele connectiviteit met een hoge resolutie over lange tijdsperioden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het snel is, de weefselarchitectuur behoudt en beperkte enzymatische en mechanische stress vermindert met behoud van een hoge opbrengst van weefsel. Door functionele en morfologische veranderingen tijdens ziekteprogressie te detecteren, helpt deze techniek ons begrip van de pancreasgerelateerde ziekten, zoals diabetes.Deze weefselsegmenttechniek kan worden toegepast op hersen-, hypofyse- en bijnierweefsels met de nadruk op het behoud van intercellulair contact, paracriene interacties en weefselarchitectuur. Om zich voor te bereiden op de injectie van agarose in de alvleesklier van de muis, vult u een spuit van vijf milliliter met 40 graden Celsius vloeibare agarose en rust u de spuit uit met een naald van 30 gauge. Nadat u de naald zorgvuldig met een dop hebt bedekt, plaatst u het uiteinde van de spuitnaald naar beneden, met het volledige volume agarose onder het wateroppervlak, in een waterbad van 40 graden Celsius.Bel een fles extracellulaire oplossing met carbogen, continu op ijs, met 1,5 milliliter per minuut bij barometrische druk en kamertemperatuur om oxygenatie en een pH van 7,4 te garanderen. Om de agarose-injectie uit te voeren, plaatst u een geëuthanaseerde volwassen muis onder een stereomicroscoop en krijgt u toegang tot de buik van de muis via laparotomie. Beweeg de darm voorzichtig naar de linkerkant om het gemeenschappelijke galkanaal bloot te leggen en gebruik een tang om het duodenale uiteinde van het kanaal iets op te tillen om de papilla van Vater te lokaliseren.Gebruik een hemostat om het galkanaal bij de twaalfvingerige darmpapillen te klemmen om lekkage van de agarose uit het kanaal in de twaalfvingerige darm te voorkomen en gebruik een kleine scherpe tang om onder het gemeenschappelijke galkanaal te reiken om het membraan te breken dat het kanaal aan het pancreasweefsel hecht. Nadat u zoveel mogelijk vet en bindweefsel uit het kanaal hebt verwijderd, plaatst u het kanaal loodrecht op de uiteinden van een grotere tang en drukt u stevig op de zuiger van de spuit, injecteert u de viskeuze vloeistof die gedurende 20 tot 30 seconden in het proximale uiteinde van het gemeenschappelijke galkanaal is ontstaan. Wanneer het weefsel witachtig en licht opgezwollen wordt, verwijder dan de spuit en giet langzaam 20 milliliter van de gebubbelde ijskoude extracellulaire oplossing op de alvleesklier om het weefsel af te koelen en de agarose te verharden.Om plakjes pancreasweefsel te verkrijgen, gebruikt u een tang en een fijne taai gesneden schaar om de agarose geïnjecteerde pancreas voorzichtig over te brengen in een petrischaaltje van 100 millimeter met 40 milliliter ijskoude extracellulaire oplossing. Draai de schaal om het weefsel te spoelen en breng de alvleesklier over in een tweede schaal met ijskoude extracellulaire oplossing. Gebruik de tang en de schaar om het witachtige, goed geïnjecteerde pancreasgedeelte in maximaal zes stukjes van 0,1 tot 0,2 kubieke centimeter te knippen en verwijder eventueel achtergebleven bind- en vetweefsel uit de weefselstukken.Plaats de gereinigde blokken in een 35 millimeter niet-kleverige bodem petrischaal met ongeveer vijf milliliter van 40 graden Celsius vloeibare agarose en plaats de petrischaal onmiddellijk op ijs. Wanneer de agarose is uitgehard, houdt u de petrischaal ondersteboven boven het deksel van een petrischaaltje van 100 millimeter en gebruikt u de helft van een scheermesje om voorzichtig in de marge tussen de zijwand van de petrischaal en de agarose te snijden om de agarose uit de schaal te verwijderen. Gebruik het scheermesje om individuele blokjes, elk met één weefselblok agarose, uit de vrijgekomen agarose te snijden en gebruik cyanoacrylaatlijm om de blokken aan de monsterplaat van een vibratoom te bevestigen.Vul de snijkamer van het vibratoom met 150 milliliter ijskoude extracellulaire oplossing die continu bubbelt met carbogen. Schroef bevestig de monsterplaat op het vibratoom en monteer een nieuw scheermesje. Omring de kamer met ijs en voeg twee ijsblokjes met een volume van 10 milliliter toe, gemaakt met een extracellulaire oplossing aangevuld met zes millimolglucose.Stel de snijmachine in op 0,05 tot 1 millimeter per seconde en 70 hertz en begin dan met snijden om 140 micron dikke agarose-plakjes te verkrijgen met een oppervlak van 20 tot 100 vierkante millimeter. Gebruik een fijne verfkwast om elk plakje voorzichtig over te brengen in een petrischaaltje van 100 millimeter gevuld met 40 millimeter HEPES-buffer aangevuld met zes millimolglucose. Los voor calciumkleurstofpreparaat 50 microgram celdoorlatende calciumindicatorkleurstof, 7,5 microliter DMSO en 2,5 microliter poloxameer en 6,667 milliliter HBS op in een 15 milliliter schroefdopbuis.Gebruik een pipet om de oplossing gedurende 20 seconden grondig te mengen voordat u de buis onderdompelt in een ultrasone badkamer en vortexing, elk gedurende 30 seconden. Vervolgens aliquot 3,333 milliliter van de resulterende calciumindicatorkleurstofoplossing in één petrischaaltje van 5 milliliter per 10 plakjes weefsel die moeten worden geëtiketteerd. Gebruik voor het laden van kleurstoffen een dunne zachte verfkwast om tot 10 weefselplakken over te brengen naar elke schaal met kleurstofoplossing en plaats de schotels op een orbitale shaker gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur en 40 omwentelingen per minuut beschermd tegen licht.Breng aan het einde van de incubatie tot 20 gekleurde plakjes over in afzonderlijke petrischalen van 60 milliliter gevuld met kleurstofvrije HBS. Selecteer voor calciumbeeldvorming door confocale microscopie een vergroting van 20 of 25 keer en stel de acquisitiemodus in op time-lapse-beeldvorming, het gaatje op 100 tot 200 micron en de excitatie en emissie voor de fluorofoor die in het experiment wordt gebruikt. Monteer de opnamekamer en het perfusiesysteem op de temperatuurgecontroleerde fase van de microscoop en plaats de in- en uitlaat op de uiterste randen van de opnamekamer.Stel de in- en uitstroomsnelheden in op één tot twee milliliter per minuut. Stel de temperatuur van het profusiesysteem in op 37 graden Celsius en start de profusie met de niet-stimulerende oplossing. Om de calciumdynamiek van het weefsel vast te leggen, plaatst u een enkel weefselsegment in de opnamekamer en immobiliseert u het weefsel met een U-vormig platinagewicht met een strak nylon gaas.Gebruik de optie Bright-Field om de structuur van belang te lokaliseren en gebruik live imaging om de bestudeerde structuren in het gezichtsveld te plaatsen. Om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren, past u het laservermogen, de detectorversterking en het lijngemiddelde binning aan terwijl het laservermogen minimaal blijft. Pas het brandpuntsvlak aan tot 15 micron onder het snijoppervlak om opname van mogelijk beschadigde cellen te voorkomen en de beelden te verkrijgen.Stel de bemonsteringsfrequentie in op één tot twee hertz om de eerste detectie van individuele oscillaties mogelijk te maken en een afbeelding met een hoge resolutie op te nemen. Gebruik, indien beschikbaar, een online grafiek om direct feedback te krijgen over de voorbereidingsreactie, oververlichting, fotobleaching en mechanische drift. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, slaat u de gegevens op voor latere analyse.Hier kan een voorbeeld worden waargenomen van een optimaal weefselsegment waarin de celdoorlatende calciumindicatorkleurstof met succes in het pancreasweefselsegment werd geladen. Daarentegen zijn deze weefselplakken niet optimaal voor beeldvorming vanwege een mislukte kleurstofpenetratie, een gebrek aan eilandjescellen of een overvloed aan necrotisch weefsel op het oppervlak van de monsters. Hoge resolutie beelden van een pancreasweefselschijf kunnen worden gebruikt om verschillende regio's van het pancreasweefsel af te bakenen, zoals de eilandjes langerhans, acinair weefsel of het pancreaskanaal.Stimuli kunnen worden gebruikt om functioneel onderscheid te maken tussen verschillende eilandjescellen of tussen eilandjes en niet-eilandjescellen. Bètacellen reageren bijvoorbeeld meestal op een glucosestimulatie met een vierkante puls door een voorbijgaande toename van intracellulair calcium te vertonen, gevolgd door een snelle calciumoscillaties op een aanhoudend plateau. Niet-bètacellen reageren daarentegen met snellere en onregelmatigere oscillaties.Een vertraging in het begin van intracellulaire calciumtoename na stimulatie, evenals de heterogeniteit en vertragingen tussen individuele cellen kunnen ook worden gemeten. Dezelfde parameters kunnen worden gebruikt om de deactiveringsfase te beschrijven. Hier kan een schematische presentatie van de intracellulaire calciumoscillatieduur, frequentie en percentage actieve tijd worden waargenomen.Bij beeldvorming met acquisitiesnelheden van meer dan 10 hertz kunnen calciumgolven die zich herhaaldelijk over het eilandje verspreiden duidelijk worden herkend. Klem het gemeenschappelijke galkanaal zo dicht mogelijk bij de twaalfvingerige darm om te voorkomen dat per ongeluk de tak die de alvleesklier binnendringt, wordt afgesloten. Stop ook niet met het indrukken van de zuiger tijdens de injectie, omdat de agarose onmiddellijk in de naald zal uitharden.De acute muis pancreasweefsel slice techniek kan ook worden gebruikt met de patch clamp methode om ionkanaalstromen te bestuderen en toegang te krijgen tot cytosis, evenals immunohistochemische studies en secretaresse studies.

confocal-laser-scanning-microscopy-calcium-dynamics-acute-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the technique of imaging islet cells in real-time, to study the changes in cytosolic calcium concentration in the minor subpopulations of the pancreatic islet cells. Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells. This can provide an insight into the cross talk between the blood glucose and the islet secretory output.

Imaging Calcium Dynamics in Pancreatic Cells: A Technique to Study Real-time Changes in Cytosolic Calcium Concentration in Pancreatic Islet

In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

We beschrijven een reproduceerbare werkwijze voor het bereiden muizen acinaire cellen van een muis voor het onderzoek van acinaire cel calcium signalen en celbeschadiging met fysiologisch en pathologisch relevant stimuli. Werkwijze voor adenovirale infectie van deze cellen is ook voorzien.

Bereiding van acinaire cellen ten behoeve van Calcium Imaging, Cell Injury Metingen en adenovirale infectie

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.

Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken

In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.

Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster

We presenteren een protocol voor de chirurgische implantatie van een gestabiliseerd inwonend optisch venster voor subcellulaire beeldvorming van de alvleesklier van muizen, waardoor seriële en longitudinale studies van de gezonde en zieke alvleesklier mogelijk zijn.

Gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier van muizen

Dit protocol beschrijft hoe menselijke alvleesklierplakjes van overleden orgaandonoren kunnen worden gegenereerd om de celfunctie onder bijna-fysiologische omstandigheden te bestuderen. Deze innovatieve aanpak maakt het mogelijk om normale en structureel beschadigde eilandjes te onderzoeken en de ingewikkelde wisselwerking tussen endocriene en exocriene compartimenten.

Het genereren van plakjes menselijk pancreasweefsel om endocriene en exocriene pancreasfysiologie te bestuderen

Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Leer calciumdynamiek bestuderen in acute pancreasweefselplakken van muizen met confocale laserscanningmicroscopie. Deze methode behoudt de native weefselarchitectuur en intercellulaire communicatie.

Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen

Meer video's verkennen