Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Deze protocollen kunnen worden gebruikt om interne multiplex ddPCR-assays te ontwikkelen voor detectie van SARS-CoV-2 met behulp van een tweekleurig ddPCR-systeem. Dit is handig voor mensen die hun eigen kits willen ontwikkelen voor de detectie van SARS-CoV-2 en andere ziekteverwekkers. Vergeleken met de gouden standaard RT-qPCR kan RT-ddPCR worden gebruikt om meerdere SARS-CoV-2-genen te kwantificeren zonder dat er een standaardcurve nodig is.

Aangezien ddPCR een opkomende techniek is, is visuele demonstratie belangrijk om huidige en toekomstige gebruikers te helpen multiplex-assays voor SARS-CoV-2-detectie en andere pathogenen te begrijpen en gemakkelijk te ontwikkelen. Voeg voor cDNA-synthese twee microliters 5X reverse transcriptie mastermix, vijf microliter van het RNA-monster van belang en drie microliter RNase-vrij dubbel gedestilleerd water toe aan een PCR-buis van 100 of 200 microliter tot een eindvolume van 10 microliter als oplossing en plaats de buis op ijs. Wanneer de reagentia zijn toegevoegd, laadt u het monster in een thermische cycler en stelt u het instrument in om gedurende 15 minuten een omgekeerde transcriptie uit te voeren bij 37 graden Celsius, een warmte-inactivatie van de omgekeerde transcriptie gedurende 5 seconden bij 85 graden Celsius en een laatste oneindige hold bij vier graden Celsius.

Voordat u druppel digitale PCR uitvoert, voegt u 19,8 microliter vers bereide mastermix toe aan het juiste aantal putjes van een nucleasevrije 96-well druppel digitale PCR-plaat. Voeg 2,2 microliter cDNA toe aan elke put van het mastermengsel tot een eindvolume van 22 microliter reactiemengsel per put en sluit de plaat af met een wegwerp-PCR-plaatafdichting. Draai de plaat vervolgens gedurende 15 tot 30 seconden in centrifuge gedurende 10 tot 15 seconden om de putinhoud aan de onderkant van de plaat te verzamelen.

Voor geautomatiseerde druppelgeneratie op het touchscreen van de geautomatiseerde druppelgenerator klikt u op monsterplaat configureren en selecteert u de kolommen waarin de monsters zich op de monsterplaat bevinden. Klik op OK en open de deur van de automatische druppelgenerator. Laad de monster- en druppelgeneratieplaten en de andere materialen die nodig zijn voor het experiment op de respectieve locaties in het instrument en sluit de deur.

Wanneer het touchscreen groen wordt, wat aangeeft dat alle materialen in de juiste positie zijn geladen, selecteert u olie voor sondes en start u met het genereren van druppels. Wacht tot de druppelgeneratie is voltooid volgens de tijd die op het scherm wordt aangegeven. Wanneer het scherm Droplets ready zegt, opent u de deur om de plaat met de druppels te verwijderen en gebruikt u een plaatsealer gedurende vijf seconden bij 180 graden Celsius om de plaat af te sluiten met een doorboorbare folieafdichting.

Binnen 30 minuten na het genereren van de druppel, plaatst u de verzegelde druppelplaat in een 96 diepe put thermische cycler. Stel het monstervolume in op 40 microliter en de temperatuur van het deksel op 105 graden Celsius. Vervolgens versterkt PCR de druppels.

Voor druppellezing, na de versterking, brengt u de thermisch gefietste 96-well-plaat over in een druppellezer en opent u de bijbehorende software op een computer die is aangesloten op de druppellezer. Selecteer in de instellingsmodus Nieuw en dubbelklik op een put om het dialoogvenster van de broneditor te openen. Selecteer de te lezen putjes en stel het experiment in op absolute kwantificering, supermix op druppel digitale PCR supermix voor sondes.

Target één type op kanaal 1 onbekend en target twee type op kanaal 2 onbekend. Wijs de voorbeeldnamen toe op basis van de plaatindeling en klik op Toepassen en OK. Nadat u de sjabloon hebt opgeslagen, klikt u op Uitvoeren.

Wanneer de software daarom vraagt, selecteert u de FAM/HEX-kleur. Verwijder aan het einde van de gegevensverzameling de plaat uit de lezer. Voordat u de gegevens analyseert, controleert u de gegevens van alle putten om het totale aantal druppels te verkrijgen.

En stel een cutoff in om een minimum aantal druppels te accepteren dat als positieve of negatieve resultaten moet worden geteld. Voor simplex- en duplex-assayanalyse dubbelklikt u op het QLP-bestand dat u wilt analyseren en selecteert u Analyseren. Gebruik de 1D-amplitude- en 2D-amplitudedrempelgereedschappen om onderscheid te maken tussen de positieve en negatieve druppels voor elke put in het juiste kanaal, met behulp van de knooppuntsjabloonbesturing en positieve controlemonsters als leidraad.

Exporteer de resultaten vervolgens als een CSV-bestand voor aanvullende analyse. Voor een triplex probe mix assay opent u het QLP-bestand en selecteert u de putten die moeten worden geanalyseerd op het tabblad plaateditor. Stel het experimenttype in op directe kwantificering en de test op het testen van mix triplex en voer de doelnaam in.

Klik vervolgens op Toepassen. Gebruik de grafiekgereedschappen om specifieke kleuren toe te wijzen aan verschillende doelclusters, zoals aangegeven door de pop-upsuggesties voor het selecteren om clustervenster toe te wijzen. Wanneer alle doelkleuren zijn toegewezen, worden de kwantificeringsgegevens weergegeven in het venster met putgegevens.

Exporteer de gegevens als een CSV-bestand voor downstream-analyse. Stel voor een quadruplex-test het experimenttype in op directe kwantificering en de test op amplitudemultiplex. Voer de doelnaam in en klik op Toepassen.

Gebruik de grafiekgereedschappen om specifieke kleuren toe te wijzen aan verschillende doelclusters, zoals aangegeven door de pop-upsuggesties voor het selecteren om clustervenster toe te wijzen. Wanneer alle doelkleuren zijn toegewezen, worden de kwantificeringsgegevens weergegeven in het venster met putgegevens. Exporteer de gegevens als een CSV-bestand voor aanvullende analyse.

Zoals waargenomen in deze representatieve temperatuurgradiëntanalyse, konden hogere knielende temperaturen positieve druppels niet duidelijk onderscheiden van negatieve druppels wanneer een duplextest werd uitgevoerd. Met een afname van een knielende temperatuur werd echter een optimale scheiding tussen positieve en negatieve druppels bereikt. Met behulp van een tweekleurig RT-druppel digitaal PCR-detectiesysteem is het mogelijk om één, twee, drie en vier SARS-CoV-2-doelen binnen één monster te detecteren.

Een no template control sample kan worden gebruikt om negatieve druppels te lokaliseren om de negatieve drempel in simplex assays te helpen instellen. In duplex assays kan de analyse worden uitgevoerd in individuele kanalen of in de 2D-amplitude. Hoewel data-analyse van multiplextests van hogere orde niet eenvoudig is, zijn deze assays nuttig, omdat ze het mogelijk maken om tot acht druppelclusters te beoordelen in triplex probe mix assays en tot 16 druppelclusters voor quadruplex amplitude-gebaseerde assays.

Afhankelijk van de te ontwikkelen test, moet u ervoor zorgen dat de juiste doelprimer- en sondeconcentraties aan de mastermix worden toegevoegd. Met behulp van deze procedure kan men de doelen afwisselen om nieuwe RT-ddPCR-assays te ontwikkelen. Deze testen kunnen worden gebruikt voor verschillende onderzoeksdoeleinden of voor de diagnose van opkomende infectieziekten.

Sinds de ontwikkeling is deze techniek gebruikt voor de nauwkeurige bepaling van virale nucleïnezuurkopieën in verschillende normen, het menselijk lichaam en omgevingsmonsters.