Name: Generatie en cultuur van linguale organoïden afgeleid van volwassen muizensmaak stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Leer een gestandaardiseerd protocol voor het genereren van linguale organoïden uit volwassen muizen smaakstamcellen. Deze methode biedt een reproduceerbare, hoogdoorvoetsbare alternatief voor in vivo-studies naar smaakcelontwikkeling en regeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Dr. Peter Dempsey en Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) bedanken voor het verstrekken van WNR-geconditioneerde media en waardevolle discussies. We bedanken ook de University of Colorado Cancer Center Cell Technologies en Flow Cytometry Shared Resources, met name Dmitry Baturin, voor expertise op het gebied van celsortering. Dit werk werd gefinancierd door: NIH / NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, en NIH / NCI R21 CA236480 naar LAB, en R21DC016131 en R21DC016131-02S1 naar DG, en F32 DC015958 naar EJG.

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in een AAALAC-geaccrediteerde faciliteit in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, de Animal Welfare Act en het beleid voor de volksgezondheid, en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de University of Colorado Anschutz Medical Campus. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 muizen die in dit protocol worden gebruikt, zijn afkomstig van The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden voltooid voordat u begint om een soepele en tijdige progressie van het protocol te garanderen: stel het waterbad in op 37 °C, stel de centrifuge in op 4 °C, maak injectie- en dissociatie-enzymoplossingen van de 10 mg / ml Dispase-, Collagenase- en Elastase-voorraadoplossingen (zie Materialentabel),verwijder matrixgel uit de vriezer van -20 °C (~ 750 μL die nodig is voor een plaat met 48 putten) en ontdooi door de injectieflacon onder te dompelen in ijs voor bij ten minste 3-4 uur, voorcoat microcentrifugebuizen in onverdunde FBS door zachtjes te schommelen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten (twee buizen van 2 ml voor weefselverzameling, twee buizen van 1,5 ml voor gedissocieerde cellen en één buis van 1,5 ml voor het verzamelen van afzonderlijke cellen uit de celsorteerder; verwijder overtollige FBS vóór gebruik).
1. Isolatie van CVP-epitheel
OPMERKING: Om voldoende LGR5+ cellen te verkrijgen voor een volledige 48-well plaat, verzamelt u drie Lgr5-EGFP CVP's in dezelfde buis en verwerkt u deze tegelijkertijd. Belangrijk is dat u de CVP van ten minste één wild type nestgenoot parallel in een aparte buis oogst en verwerkt en deze gebruikt als een gating-controle om FACS-parameters in te stellen (zie representatieve resultaten).
<ol><li>Euthanaseer de muizen met CO 2-verstikking volgens de IACUC-voorschriften, gevolgd door een goedgekeurde secundaire methode zoals bilaterale thoracotomie, cervicale dislocatie, onthoofding of exsanguinatie.</li>
	<li>Gebruik een grote steriele dissectieschaar om de wangen door te knippen en de kaak te breken. Til de tong op en snijd het linguale frenulum om de tong van de vloer van de mondholte te scheiden. Snijd de tong uit en verzamel deze in steriele ijskoude Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (dPBS) met Ca2+ en Mg2+.</li>
	<li>Verwijder en gooi de voorste tong weg door met een scheermesje net vooraan van de intermolar eminence te snijden(figuur 1A,stippellijn). Gebruik een delicaat taakdoekje om haar en overtollige vloeistof van de achterste tong te verwijderen.</li>
	<li>Vul 1 ml spuit met 200-300 μl injectie-enzymoplossing (eindconcentratie: 2 mg/ml type-I Collagenase en 5 mg/ml Dispase II in Ca2+/Mg2+-bevattende dPBS, verdund uit 10 mg/ml stamoplossingen) en plaats een 30 G x 1/2 naald net boven de intermolaire eminentie (figuur 1B, zwarte pijl) tot net voor de CVP ( Figuur1B, zwarte doos). Injecteer de enzymoplossing onder en aan de laterale randen van de CVP tussen het epitheel en de onderliggende weefsels (lamina propria, spier). Trek de spuit langzaam en continu uit de tong terwijl de injectie wordt uitgevoerd.</li>
	<li>Incubeer de tong in steriel Ca2+/Mg2+-vrij dPBS bij kamertemperatuur gedurende precies 33 min.</li>
	<li>Maak kleine sneden in het epitheel bilateraal en net voor de CVP met behulp van een extra fijne dissectieschaar en pel het epitheel voorzichtig af door het op te tillen met een fijne tang. Zodra het loopnepitheel vrij is van het onderliggende bindweefsel, plaatst u het in een lege microcentrifugebuis van 2 ml die is voorgecoat met FBS. Doe het epitheliale trimmen voor of na het losmaken van het CVP-epitheel (Figuur 1C, D).</li>
</ol>2. Dissociatie van CVP-epitheel
OPMERKING: Dissociatie van het CVP-epitheel en de beplating zijn grafisch weergegeven in figuur 2.
<ol><li>Voeg de dissociatie-enzymcocktail (eindconcentratie: 2 mg/ml type-I Collagenase, 2 mg/ml Elastase en 5 mg/ml Dispase II in Ca2+/Mg2+-bevattende dPBS, verdund uit 10 mg/ml stamoplossingen) toe aan buisjes met geschilde CVP-epithelia (200 μL per CVP). Incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende 45 minuten. Vortex kort om de 15 min. OPMERKING: Voorwarm 0,25% Trypsine-EDTA in een waterbad van 37 °C tijdens de laatste 15 minuten incubatie van de enzymcocktail.</li>
	<li>Na incubatie tritureren vortex (drie pulsen) vervolgens met een glazen Pasteur pipet gedurende 1 min. Nadat weefselstukken zijn bezonken, pipetteert u het supernatant met de eerste verzameling gedissocieerde cellen in nieuwe FBS-gecoate 1,5 ml microcentrifugebuizen die overeenkomen met het genotype. Verwerk de resterende weefselstukken verder zoals beschreven in stap 2.3. onder.<ol>
<li>Draai het supernatant gedurende 5 minuten bij 370 x g en 4 °C tot pelletcellen.</li>
		<li>Verwijder het resulterende supernatant en resuspend de celkorrel in fluorescentie-geactiveerde celsorteringsbuffer (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7,0) en 1% FBS in Ca2+/Mg2+-vrije PBS (50 μL per CVP)). Bewaren op ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissociëer tijdens het uitvoeren van stap 2.2.1 en 2.2.2 de resterende weefselstukken van stap 2.2 door voorverwarmde 0,25% trypsine-EDTA (200 μL per CVP) toe te voegen aan de oorspronkelijke microcentrifugebuizen van 2 ml en incubaeer gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C. Vortex kort om de 10 min.</li>
	<li>Na incubatie vortex de buis met weefselstukken (drie pulsen) en trituraer vervolgens met een glazen Pasteur pipet gedurende 1 min. Nadat weefselstukken zijn bezinkt, pipetteert u het supernatant in de microcentrifugebuizen van 1,5 ml die cellen uit stap 2.2.2 bevatten. Gooi de buisjes met de resterende weefselstukken weg.<ol>
<li>Draai de buisjes met gedissocieerde cellen gedurende 5 minuten bij 370 x g en 4 °C naar pelletcellen.</li>
		<li>Verwijder de supernatant- en resuspendcelkorrels in FACS Buffer (100 μL per CVP). Bewaren op ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ga de cellen door een nylon mesh-filter van 30 μm en voeg DAPI(λ-emissie = 450 nm) toe aan celmengsels voorafgaand aan FACS. Isoleer Lgr5-GFP+ cellen via FACS met behulp van het groene fluorescerende eiwitkanaal (λexcitatie = 488 nm; λemissie = 530 nm). Sorteer de cellen met behulp van een mondstuk van 100 μm in een verse FBS-gecoate microcentrifugebuis van 1,5 ml met 300 μL Ca2+/Mg2+ vrije dPBS. Plaats de cellen op ijs tot het beplating.</li>
</ol>3. Plating van Lgr5-EGFP-cellen
<ol><li>Bepaal het volume LGR5+ celsuspensie ontvangen van de flowcytometer.</li>
	<li>Bereken op basis van het aantal cellen dat uit de sorteerder wordt verkregen het aantal cellen per μL. Bepaal vervolgens het volume dat nodig is om het gewenste aantal cellen voor plating te verkrijgen (we gebruiken 200 cellen per put van een 48-well plaat) en breng dat totale volume van gesuspendeerde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis.</li>
	<li>Draai de buis gedurende 5 minuten bij 370 x g en 4 °C naar pelletcellen (pellet is mogelijk niet zichtbaar). Verwijder het bovennatuurlijk en plaats de tube op ijs.</li>
	<li>Resuspend de celkorrel voorzichtig in de juiste hoeveelheid matrixgel (15 μL per put voor 48-well platen); pipetteer zachtjes op en neer om de cellen grondig te verdelen in matrixgel. Plaats 15 μL matrixgel/celmengsel in het midden van elke put. Houd de microcentrifugebuis op ijs in een conische buis van 50 ml tijdens het platen om te voorkomen dat matrixgel gaat gossen. Blijf matrixgel / celmengsel mengen tijdens het beplaten door elke drie putten op en neer te pipetteren om een gelijkmatige verdeling van cellen over putten te garanderen.</li>
	<li>Plaats de plaat gedurende 10 minuten in de incubator (37 °C, 5% CO2,~95% vochtigheid) om matrixgelgeul mogelijk te maken. Voeg vervolgens 300 μL WENRAS + Y27632-media bij kamertemperatuur toe aan elke put en breng de plaat terug naar de incubator.</li>
</ol>4. Organoïde onderhoud
OPMERKING: Organoïden worden gekweekt in conventionele organoïde media (WENR) bestaande uit recombinant EGF en 50% geconditioneerde media die Wnt3a, Noggin en R-spondinbevatten 23. Geneesmiddelen A8301 en SB202190 worden toegevoegd voor de eerste 6 dagen van de kweekperiode om de groei te optimaliseren (WENRAS-media) (Figuur 5) en vervolgens verwijderd om differentiatie te bevorderen (WENR-media)20. Y27632 wordt toegevoegd voor de eerste 2 dagen van de cultuur om overleving te bevorderen. Mediacondities ten opzichte van de cultuurtijdlijn zijn weergegeven in figuur 4.
<ol><li>Verwijder twee dagen na het beplaten WENRAS + Y27632-media uit elke put met behulp van een pipet van 1 ml, zodat kruisbesmetting wordt voorkomen. Voeg 300 μL WENRAS-media toe aan de zijkant van de put om de matrixgel niet te verstoren. Breng de plaat terug naar de couveuse.</li>
	<li>Verander de media om de 2 dagen, met behulp van de juiste media voor de cultuurfase (figuur 4). Onderhoud organoïden tot dag 12, wanneer de organoïden klaar zijn om te oogsten.</li>
</ol>5. RNA-verwerking
<ol><li>Organoïden oogsten voor RNA<ol>
<li>Plaats 48-well plaat op ijs gedurende 30 minuten om de matrixgel te depolymeriseren.</li>
		<li>Trek met behulp van een pipet van 1 ml de organoïde media omhoog; gebruik vervolgens, terwijl het medium wordt teruggebracht naar de put, de punt van de pipet om de matrixgel te krassen en verder te breken. Breng de inhoud over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en bundel de inhoud van drie putten in één buis. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 300 x g bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder zoveel mogelijk media-supernatant zonder organoïden te verwijderen; draai vervolgens de buizen opnieuw gedurende 5 minuten bij 300 x g bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder de resterende media en resuspend de organoïden in 350 μL lysisbuffer + β-mercaptoethanol (βME) (10 μL βME per 1 ml lysisbuffer). Plaats de monsters op ijs voor onmiddellijke RNA-extractie of bewaar bij -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantitatieve RT-PCR analyse<ol>
<li>Meet de RNA-hoeveelheid via een spectrofotometer. Reverse-transcribeer RNA met behulp van een cDNA Synthesis Kit.</li>
		<li>Meng cDNA equivalent aan 5 ng RNA met 200 nM voorge gevalideerde voorwaartse en omgekeerde primers(tabel 1)en fluorescerende PCR Master Mix. Voer de qRT-PCR-reactie gedurende 40 cycli uit bij: 95 °C gedurende 15 s en vervolgens 60 °C gedurende 60 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Immunohistochemie
<ol><li>Oogsten en fixeren van de organoïden<ol>
<li>Leg 48-well plaat op ijs gedurende 30 minuten om de matrixgel los te maken.</li>
		<li>Verwijder de organoïde media en voeg 400 μL ijskoude PBS toe aan elke put. Verwijder vervolgens PBS en voeg 400 μL ijskoude Cell Recovery Solution toe aan elke put. Schommel zachtjes bij 4 °C gedurende 30 min.</li>
		<li>Bestrijk een pipetpunt van 1 ml met 1% BSA in PBS en pipetteer de inhoud van de put voorzichtig op en neer om de matrixgel te breken. Breng de organoïden over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml die op ijs is geplaatst.</li>
		<li>Spoel elke put af met 300 μL PBS + 1% BSA en breng eventuele resterende organoïden over naar de overeenkomstige buisjes. Verwijder Cell Recovery Solution/PBS + BSA uit elke buis. Voeg 400 μL ijskoude PBS toe en herhaal dit met een andere ijskoude PBS-spoeling.</li>
		<li>Verwijder PBS en fixeer organoïden met 300 μL ijskoude 4% PFA (in 0,1 M PB) gedurende 20 minuten, broedend bij kamertemperatuur. Verwijder PFA en spoel organoïden met 400 μL ijskoude PBS.</li>
		<li>PBS verwijderen; voeg vervolgens 400 μL PBS + 1% BSA toe. Bewaren bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunofluorescentiekleuring<ol>
<li>Spoel organoïden in 500 μL PBS + 1% BSA. Incubeer vervolgens organoïden in blokkerende oplossing (5% normaal geiten- of ezelserum, 1% runderserumalbumine, 0,3% Triton X 100 in 1x PBS pH 7,3) gedurende 2 uur, zacht schommelend bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg de primaire antilichaamoplossing (primaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing) toe en laat gedurende 3 nachten zachtjes schommelen bij 4 °C.</li>
		<li>Was organoïden 4x gedurende 1 uur met 500 μL PBS + 0,2% Triton, zacht schommelend bij kamertemperatuur. Voeg secundaire antilichaamoplossing (secundaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing) en steenorganoïden 's nachts, beschermd tegen licht, toe bij 4 °C.</li>
		<li>Was organoïden 3x gedurende 1 uur met 500 μL PBS + 0,2% Triton, beschermd tegen licht en zacht schommelend bij kamertemperatuur. Incubeer met DAPI verdund 1:10.000 in 0,1 M PB gedurende 20 minuten, schommelend en afgedekt bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Was de organoïden 3x gedurende 20 minuten met 0,1 M PB, schommel zachtjes en afgedekt bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diamontage van organoïden voor omgekeerde confocale microscopie. OPMERKING: Stap-voor-stap foto's van het montageproces van de dia worden weergegeven in figuur 7.<ol>
<li>Maak een ~ 1 mm dikke vierkante omtrek van 22 x 22 mm van niet-giftige modelleerklei op een microscoopglaasje.</li>
		<li>Verwijder 0,1 M PB uit de microcentrifugebuis en resuspend organoïden voorzichtig in een montagemedium van 100 μL naar keuze; breng vervolgens over naar het midden van het kleiplein.</li>
		<li>Vul het kleiplein totdat het montagemedium bijna boven is. Plaats vervolgens 22 x 22 mm vierkante coverslip over klei en druk stevig aan op de zijkanten van de coverslip om af te dichten. Laat het uitharden volgens de instructies van de fabrikant (hier kamertemperatuur gedurende 1-2 dagen) en bewaar bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+renewal+in+gustation%3A+new+insights+into+taste+bud+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li>
<li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li>
<li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFinger%2C+TE+%22The+neurobiology+of+taste+and+smell%22">The neurobiology of taste and smell</a>. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).</li>
<li>Barlow, L. A., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+and+regenerating+a+sense+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Developing and regenerating a sense of taste.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).</li>
<li>Yee, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5-EGFP+marks+taste+bud+stem%2Fprogenitor+cells+in+posterior+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue.</a> Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).</li>
<li>Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog-expressing+basal+cells+are+general+post-mitotic+precursors+of+functional+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).</li>
<li>Deshpande, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-related+alterations+of+taste+function+in+patients+with+head+and+neck+cancer%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review.</a> Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12(2018).</li>
<li>Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+changes+from+cancer+treatment+and+their+effects+on+patients%27+food+behavior%3A+A+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review.</a> Nutrients. 11 (10), 2285(2019).</li>
<li>Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+taste+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Drug-induced taste disorders.</a> Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).</li>
<li>Kumari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+taste+organs+and+sensory+function+after+severe+loss+from+Hedgehog%2FSmoothened+inhibition+with+cancer+drug+sonidegib%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).</li>
<li>Ermilov, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+taste+organs+is+strictly+dependent+on+epithelial+hedgehog%2Fgli+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling.</a> PLoS Genetics. 12 (11), 1006442(2016).</li>
<li>Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+head+and+neck+irradiation+impacts+taste+progenitors%2C+differentiated+taste+cells%2C+and+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice.</a> Scientific Reports. 9, 17934(2019).</li>
<li>Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li>
<li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+taste%3A+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li>
<li>Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of taste.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).</li>
<li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+taste+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mammalian taste perception.</a> Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).</li>
<li>Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stem%2Fprogenitor+cell+cycle+using+murine+circumvallate+papilla+taste+bud+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid.</a> Scientific Reports. 5, 17185(2015).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7, 4004(2017).</li>
<li>Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+inflammatory+cytokine+expression+in+taste+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids.</a> Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+substitutes+for+neuronal+input+for+taste+cell+regeneration+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118(2021).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStaats%2C+J+%22Immunophenotyping%3A+Methods+and+Protocols%22">Immunophenotyping: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
<li>Ekert, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommended+guidelines+for+developing%2C+qualifying%2C+and+implementing+complex+in+vitro+models+%28CIVMs%29+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%3A+Advancing+Life+Sciences+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).</li>
<li>Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVintschgau%2C+Mv+%22Archiv+f%C3%BCr+die+gesamte+Physiologie+des+Menschen+und+der+Tiere%22">Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere</a>. 14, 443-448 (1877).</li>
<li>Liu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Shh+signaling+centers+participate+in+fungiform+papilla+and+taste+bud+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance.</a> Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+kidney+organoids%3A+engineering+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier gerapporteerd is een efficiënte en gemakkelijk herhaalbare methode voor het kweken, onderhouden en verwerken van linguale organoïden afgeleid van volwassen muizensmaakstamcellen. Het bleek dat het gebruik van drie CVP's van 8 tot 20 weken oude Lgr5-EGFP-muizen voldoende is om ~ 10.000 GFP+ -cellen te verkrijgen voor experimenteel gebruik, wat resulteert in 50 putten met een dichtheid van 200 cellen per put in 48-putplaten. Verwijdering van CVP-trench epithelia wordt geoptimaliseerd door het lingu...

Bij knaagdieren zijn linguale smaakpapillen gehuisvest in fungiforme papillen die anterieur verdeeld zijn, bilateraal foliaatpapillen achteraan, evenals een enkele circumvallaatpapillen (CVP) aan de posterodorsale middellijn van de tong1. Elke smaakpapillen zijn samengesteld uit 50-100 kortlevende, snel vernieuwende smaakreceptorcellen (TRCs), waaronder type I gliale ondersteuningscellen, type II-cellen die zoete, bittere en umami detecteren, en type III-cellen diezure 2,3,4detecteren . In de muis CVP, LGR5+ stamcellen langs de basale lamina produceren alle TRC types evenals niet-smaak epitheelcellen5. Bij het vernieuwen van de smaaklijn worden LGR5-dochtercellen eerst gespecificeerd als post-mitotische smaakvoorlopercellen (type IV-cellen) die een smaakpapillen binnendringen en in staat zijn om zich te onderscheiden van een van de drie TRC-typen6. De snelle omzet van TRC's maakt het smaaksysteem gevoelig voor verstoring door medische behandelingen, waaronder bestraling en bepaalde medicamenteuze therapieën7,8,9,10,11,12,13. Het bestuderen van het smaaksysteem in de context van smaakstamcelregulatie en TRC-differentiatie is dus van vitaal belang om te begrijpen hoe smaakdisfunctie kan worden verminderd of voorkomen.
Muizen zijn een traditioneel model voor in vivo studies in de smaakwetenschap, omdat ze een smaaksysteem hebben dat op dezelfde manier is georganiseerd als mensen14,15,16. Muizen zijn echter niet ideaal voor studies met een hoge doorvoer, omdat ze duur zijn om te onderhouden en tijdrovend om mee te werken. Om dit te ondervangen zijn de afgelopen jaren in vitro organoïde kweekmethoden ontwikkeld. Smaakorganoïden kunnen worden gegenereerd uit inheems CVP-weefsel, een proces waarbij organoïden afstakken van geïsoleerd muis-CVP-epitheel gekweekt ex vivo17. Deze organoïden vertonen een meerlagig epitheel dat consistent is met het in vivo smaaksysteem. Een efficiëntere manier om organoïden te genereren die geen ex vivo CVP-cultuur vereisen, werd ontwikkeld door Ren etal. in 201418. Door methoden en kweekmedia aan te passen die voor het eerst werden ontwikkeld om darmorganoïden te laten groeien, isoleerden ze enkele Lgr5-GFP+ voorlopercellen uit muis CVP en vergulden ze in matrixgel19. Deze enkele cellen gegenereerde linguale organoïden die zich vermenigvuldigen tijdens de eerste 6 dagen van de kweek, beginnen te differentiëren rond dag 8 en tegen het einde van de kweekperiode bevatten niet-smaakepitheelcellen en alle drie de TRC-typen18,20. Tot op heden zijn meerdere studies met behulp van het linguale organoïde modelsysteem gepubliceerd17,18,20,21,22; de methoden en cultuuromstandigheden die worden gebruikt om deze organoïden te genereren, verschillen echter van publicatie tot publicatie(aanvullende tabel 1). Deze methoden zijn hier dus aangepast en geoptimaliseerd om een gedetailleerd gestandaardiseerd protocol te presenteren voor de cultuur van linguale organoïden afgeleid van LGR5+ voorlopers van volwassen muis CVP.
Linguale organoïden bieden een uniek model voor het bestuderen van de celbiologische processen die de ontwikkeling en vernieuwing van smaakcellen stimuleren. Naarmate de toepassingen van linguale organoïden zich uitbreiden en meer laboratoria zich richten op het gebruik van in vitro organoïde modellen, is het belangrijk dat het veld ernaar streeft gestandaardiseerde protocollen te ontwikkelen en aan te nemen om de reproduceerbaarheid te verbeteren. Het vaststellen van linguale organoïden als een standaardinstrument binnen de smaakwetenschap zou studies met een hoge doorvoer mogelijk maken die uit elkaar halen hoe enkele stamcellen de gedifferentieerde cellen van het volwassen smaaksysteem genereren. Bovendien kunnen linguale organoïden worden gebruikt om geneesmiddelen snel te screenen op mogelijke effecten op smaakhomeostase, die vervolgens grondiger kunnen worden onderzocht in diermodellen. Deze aanpak zal uiteindelijk de inspanningen vergroten om therapieën te bedenken die de kwaliteit van leven voor toekomstige medicijnontvangers verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A11056, RRID: AB_142628</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A11010, RRID:AB_2534077</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11075, RRID:AB_2534119</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A31573, RRID:AB_2536183</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A21247, RRID:AB_141778</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>DAPI (voor FACS)</td><td>Thermo Fischer</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (voor immunohistologie)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571, RRID:AB_2307445</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Goat anti-CAR4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF2414, RRID:AB_2070332</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Guinea pig anti-KRT13</td><td>Acris Antibodies</td><td>BP5076, RRID:AB_979608</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-395, RRID:AB_673678</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Rabbit anti-NTPDASE2</td><td>CHUQ</td><td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Rat anti-KRT8</td><td>DSHB</td><td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2D rocker</td><td>Benchmark Scientific Inc.</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>3D Rotator</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>4630</td><td></td></tr><tr><td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td><td>Fisher Scientific</td><td>S407992</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>4110</td><td>184 L, Polished Stainless Steel</td></tr><tr><td>Incucyte</td><td>Sartorius</td><td>Model: S3</td><td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td></tr><tr><td>MoFlo XDP100</td><td>Cytomation Inc</td><td>Model: S13211997</td><td>&nbsp;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E1</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Stereomicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Thermische Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>580BR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Precision</td><td>51220073</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83 01</td><td>Sigma</td><td>SML0788-5MG</td><td>Voorraadconcentratie 10 mM, uiteindelijke concentratie 500 nM</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Voorraadconcentratie 50X, uiteindelijke concentratie 1X</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>Voorraadconcentratie 1000X, uiteindelijke concentratie 1X</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Voorraadconcentratie 100X, uiteindelijke concentratie 1X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Voorraadconcentratie 100X, uiteindelijke concentratie 1X</td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1MG</td><td>Voorraadconcentratie 500 &micro;g/mL, uiteindelijke concentratie 50 ng/mL</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Voorraadconcentratie 50 &micro;g/mL, uiteindelijke concentratie 25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteïne</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Voorraadconcentratie 0.5 M, uiteindelijke concentratie 1 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100g</td><td>Voorraadconcentratie 1 M, uiteindelijke concentratie 1 mM</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Voorraadconcentratie 100X, uiteindelijke concentratie 1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>Voorraadconcentratie 500X, uiteindelijke concentratie 1X</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1264</td><td>Voorraadconcentratie 10 mM, uiteindelijke concentratie 0.4 &micro;M</td></tr><tr><td>WRN Conditioned media</td><td></td><td></td><td>Ontvangen van Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Afkomstig van L-WRN (ATCC&reg; CRL-3276&trade;) cellen</td></tr><tr><td>Y27632 dihydrochloride 10ug</td><td>APExBIO</td><td>A3008-10</td><td>Voorraadconcentratie 10 mM, uiteindelijke concentratie 10 &micro;M</td></tr><tr><td>Anders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml TB Syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>&beta;-mercaptoethanol</td></tr><tr><td>2.0 mL Microcentrifugebuizen</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2700</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 inch Pasteur Pipetten</td><td>Fisherbrand</td><td>12-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit runder serum (BSA)</td><td>Sigma Life Science</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT Lysis buffer</td><td>QIAGEN</td><td>1015750</td><td></td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase uit Clostridium his

generatie en cultuur van linguale organoïden afgeleid van volwassen muizensmaak stamcellen

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

De smaakzin wordt gemedieerd door smaakpapillen op de tong, die zijn samengesteld uit snel vernieuwende smaakreceptorcellen (TRCs). Deze voortdurende omzet wordt aangedreven door lokale voorlopercellen en maakt de smaakfunctie vatbaar voor verstoring door een groot aantal medische behandelingen, wat op zijn beurt de kwaliteit van leven ernstig beïnvloedt. Het bestuderen van dit proces in de context van medicamenteuze behandeling is dus van vitaal belang om te begrijpen of en hoe de functie van smaakvoorlopers en de TRC-productie worden beïnvloed. Gezien de ethische bezwaren en de beperkte beschikbaarheid van menselijk smaakweefsel, worden muismodellen, die een smaaksysteem hebben dat vergelijkbaar is met mensen, vaak gebruikt. Vergeleken met in vivo methoden, die tijdrovend, duur en niet vatbaar zijn voor studies met een hoge doorvoer, kunnen murine linguale organoïden het mogelijk maken om experimenten snel uit te voeren met veel replicaties en minder muizen. Hier zijn eerder gepubliceerde protocollen aangepast en wordt een gestandaardiseerde methode voor het genereren van smaakorganoïden uit smaakvoorlopercellen geïsoleerd uit de circumvallaatpapillen (CVP) van volwassen muizen gepresenteerd. Smaakvoorlopercellen in de CVP drukken LGR5 uit en kunnen worden geïsoleerd via EGFP fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van muizen die een Lgr5EGFP-IRES-CreERT2-allel dragen. Gesorteerde cellen worden op een matrixgel-gebaseerd 3D-kweeksysteem geplateerd en gedurende 12 dagen gekweekt. Organoïden breiden zich uit gedurende de eerste 6 dagen van de kweekperiode via proliferatie en komen vervolgens in een differentiatiefase, waarin ze alle drie de smaakceltypen genereren, samen met niet-smaakepitheelcellen. Organoïden kunnen worden geoogst bij rijping op dag 12 of op elk moment tijdens het groeiproces voor RNA-expressie en immunohistochemische analyse. Het standaardiseren van kweekmethoden voor de productie van linguale organoïden uit volwassen stamcellen zal de reproduceerbaarheid verbeteren en linguale organoïden bevorderen als een krachtig hulpmiddel voor het screenen van geneesmiddelen in de strijd om patiënten met smaakdisfunctie te helpen.

Muizen hebben één CVP, posterieur gelegen op de tong, waaruit LGR5+ stamcellen kunnen worden geïsoleerd(Figuur 1A,zwarte doos). Injectie van een enzymoplossing onder en rond de CVP (figuur 1B) resulteert in lichte zwelling van het epitheel en vertering van het bindweefsel. Voldoende spijsvertering wordt bereikt na een incubatie van 33 minuten, waardoor het CVP-epitheel gemakkelijk van het onderliggende weefsel kan worden gescheiden. B...

Het protocol presenteert een methode voor het kweken en verwerken van linguale organoïden afgeleid van smaakstamcellen geïsoleerd uit de achterste smaakpapillen van volwassen muizen.

Generatie en cultuur van linguale organoïden afgeleid van volwassen muizensmaak stamcellen

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Organoïden zijn krachtige in vitro technologie die wordt gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen en het begrijpen van biologische processen. Het genereren van organoïden die de tong modelleren is dus cruciaal voor het bestuderen van de ontwikkeling en regeneratie van smaakcellen. Traditionele in vivo smaakstudies kunnen duur en tijdrovend zijn.Dit organoïdeprotocol biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar alternatief dat deze uitdagingen minimaliseert en tegelijkertijd experimenten met een hogere doorvoer mogelijk maakt. Gebruik na het euthanaseren van een volwassen muis een grote steriele dissectieschaar om de wangen af te snijden en de kaak te breken. Til vervolgens de tong op en snijd het linguale frenulum om de tong van de vloer van de mondholte te scheiden.Snijd de tong uit en verzamel deze in steriel ijskoud dPBS met calcium en magnesium. Verwijder onder een ontleedmicroscoop de voorste tong en gooi deze weg door met een scheermesje net vooraan van de inter malar eminence te snijden. Gebruik vervolgens een delicaat taakdoekje om haar en overtollige vloeistof van de achterste tong te verwijderen.Vul vervolgens een spuit van één milliliter met 200 tot 300 microliter i

generation-culture-lingual-organoids-derived-from-adult-mouse-taste

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Ons doel was om een ​​reproduceerbare protocol voor het isoleren en onderhouden van lange termijn culturen van menselijke fungiform smaak papillen cellen te ontwikkelen. Cellen uit menselijk fungiform papillen, verkregen uit biopsie werden met succes gehandhaafd in cultuur voor meer dan acht passages (12 maanden) zonder verlies van levensvatbaarheid.

Isolatie en Cultuur van de Mens Fungiform Smaak papillen Cellen

In this video, we describe the isolation of epithelial cells from a murine tongue. These cells can be further cultured to give rise to cell colonies.

Isolation and Culture of Murine Tongue Epithelial Cells: A Procedure to Isolate and Culture Tongue Epithelial Cells from Mouse Model

In this video, we describe the isolation of circumvallate papillae (CVP) epithelium from a murine tongue.

Isolation of Circumvallate Papillae (CVP) Epithelium from Mouse Model: An Enzymatic Procedure to Separate CVP Epithelium from Mouse Tongue

Uit stamcellen afgeleide culturen bevatten een enorm potentieel om infectieziekten te modelleren. Hier wordt de kweek van muis en menselijke gastrische organoïden, afgeleid van volwassen stamcellen, beschreven. De organoïden worden gemicro-injecteerd met het gastrische pathogeen Helicobacter pylori.

Organoids als model voor Infectieziekten: cultuur van de mens en muizen Maag Organoids en Micro-injectie van Helicobacter pylori

Dit artikel beschrijft methoden voor weefselvoorbereiding, kleuring en analyse van hele fungiforme, circumvallaat- en gehemelte-smaakpapillen die consequent hele en intacte smaakpapillen opleveren (inclusief de zenuwvezels die ze innerveren) en de relaties tussen structuren in smaakpapillen en de omliggende papilla onderhouden.

Whole-Mount kleuring, visualisatie en analyse van fungiforme, circumvallaat en gehemelte smaakpapillen

We hebben een gegeneraliseerd protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid hoogwaardige enkelvoudige cellen te scheiden van het epitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale en volwassen muistongs.

Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen

De Trowell-type orgaankweekmethode is gebruikt om complexe signaleringsnetwerken te ontrafelen die de tandontwikkeling regelen en, meer recent, voor het bestuderen van regulatie die betrokken is bij stamcellen van de continu groeiende muizensnijder. Fluorescerende reporter diermodellen en live-imaging methoden vergemakkelijken diepgaande analyses van tandheelkundige stamcellen en hun specifieke niche micro-omgeving.

Gebruik van trowell-type orgaancultuur om de regulatie van tandheelkundige stamcellen te bestuderen

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en cultuur van orale keratinocyten afgeleid van het volwassen muizengehemelte. Een evaluatiemethode met behulp van immunostaining wordt ook gemeld.

Isolatie en kweek van primaire orale keratinocyten uit het volwassen muizengehemelte

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.

Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden

Hier hebben wij een reproduceerbare werkwijze voor volwassenen neurogenese onderzocht onder toepassing van een assay neurosphere afgeleid van de gehele hersenen of van ofwel de telencephalic, tectal of cerebellaire gebieden van de volwassen hersenen zebravis. Daarnaast beschrijven we de procedure om genexpressie te manipuleren in zebravis neurosferen.

Isolatie en cultuur van de Adult zebravis Brain-afgeleide Neurosferen

Leer een gestandaardiseerd protocol voor het genereren van linguale organoïden uit volwassen muizen smaakstamcellen. Deze methode biedt een reproduceerbare, hoogdoorvoetsbare alternatief voor in vivo-studies naar smaakcelontwikkeling en regeneratie.

Generatie en cultuur van linguale organoïden afgeleid van volwassen muizensmaak stamcellen

Meer video's verkennen