Name: Beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer een protocol voor het fabriceren en analyseren van 3D menselijke skeletspier-microtissues met de MyoTACTIC 96-well plaat. Deze methode maakt schaalbare productie mogelijk en ondersteunt herhaalde metingen van contractiele kracht en calciumtransiënten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli en Sadegh Davoudi bedanken voor hun bijdrage aan de uitvinding van het MyoTACTIC-cultuurplatform en het vaststellen van de fabricage- en analysemethoden die hierin worden beschreven. HL ontving financiering van een Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Training Program in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship en een University of Toronto Wildcat graduate scholarships. PMG is de Canada Research Chair in Endogenous Repair en kreeg voor deze studie steun van het Ontario Institute for Regenerative Medicine, het Stem Cell Network en van Medicine by Design, een Canada First Research Excellence Program. Schematische diagrammen werden gemaakt met BioRender.com.

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22DMM+Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li>
<li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoScreen%2C+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li>
<li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+price+of+innovation%3A+New+estimates+of+drug+development+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307(2018).</li>
<li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li>
<li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).</li>
<li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+skeletal+muscle%3A+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847(2018).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li>
<li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121(2020).</li>
<li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li>
<li>Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574(2018).</li>
<li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li>
<li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li>
<li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918(2020).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545(2018).</li>
<li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dit manuscript beschrijft methoden om een 3D hMMT-cultuurmodel te fabriceren en te analyseren dat kan worden toegepast op studies van elementaire spierbiologie, ziektemodellering of voor het testen van kandidaat-moleculen. Het MyoTACTIC-platform is kostenvriendelijk, eenvoudig te produceren en vereist een relatief klein aantal cellen om microtissues van skeletspieren te produceren. hMMTs gevormd binnen het MyoTACTIC-cultuurplatform bestaan uit uitgelijnde, multinucleated en dwarsgestreepte myotubes en reageren op elektri...

Skeletspieren zijn een van de meest voorkomende weefsels in het menselijk lichaam en ondersteunen belangrijke lichaamsfuncties zoals voortbeweging, warmtehomeostase enmetabolisme 1. Historisch gezien zijn diermodellen en tweedimensionale (2D) celkweeksystemen gebruikt om biologische processen en ziektepathogenese te bestuderen, evenals voor het testen van farmacologische verbindingen bij de behandeling van skeletspierziekten2,3. Hoewel diermodellen onze kennis van skeletspieren in gezondheid en ziekte sterk hebben verbeterd, is hun translationele impact belemmerd door hoge kosten, ethische overwegingen en verschillen tussen soorten2,4. Bij het wenden tot menselijke celgebaseerde systemen om skeletspieren te bestuderen, zijn 2D-celkweeksystemen gunstig vanwege hun eenvoud. Er is echter een beperking. Dit formaat slaagt er vaak niet in om de cel-cel en cel-extracellulaire matrixinteracties samen te vatten die van nature in het lichaam voorkomen5,6. In de afgelopen jaren zijn driedimensionale (3D) skeletspiermodellen naar voren gekomen als een krachtig alternatief voor hele diermodellen en conventionele 2D-kweeksystemen door de modellering van fysiologisch en pathologisch relevante processen ex vivo7,8mogelijk temaken. Inderdaad, een overvloed aan studies hebben strategieën gerapporteerd om menselijke skeletspieren te modelleren in een bioartificiaal 3D-cultuurformaat1. Een beperking voor veel van deze studies is dat actieve kracht wordt gekwantificeerd na het verwijderen van de spierweefsels van de kweekplatforms en de hechting aan een krachtomvormer, die destructief is en daarom beperkt is tot het dienen als eindpunttest9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Anderen hebben kweeksystemen ontworpen die niet-invasieve methoden voor het meten van actieve kracht mogelijk maken, maar niet alle zijn geschikt voor toepassingen voor het testen van moleculen met een hoog gehalte7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode om menselijke spiermicrotissues (hMMCT's) te fabriceren in het skeletspieren (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) platform; een 96 well plate apparaat dat de bulkproductie van 3D skeletspier microtissuesondersteunt 30. De MyoTACTIC-plaatfabricagemethode maakt het mogelijk om in één gietstap een 96-put polydimethylsiloxaan (PDMS) kweekplaat en alle bijbehorende putkenmerken te genereren, waarbij elke put een relatief klein aantal cellen nodig heeft voor microtissuevorming. Microtissues gevormd binnen MyoTACTIC bevatten uitgelijnde, gestreepte en multinucleated myotubes die reproduceerbaar zijn van goed naar put van het apparaat, en bij rijping kunnen reageren op chemische en elektrische stimuli in situ30. Hierin worden de techniek om een PDMS MyoTACTIC-cultuurplaatapparaat te vervaardigen uit een replica van polyurethaan (PU), een geoptimaliseerde methode om onsterfelijke menselijke myogene voorlopercellen te implementeren om hMMT's te fabriceren, en de functionele beoordeling van gemanipuleerde hMMT-krachtgeneratie en calciumbehandelingseigenschappen geschetst en besproken.

<table><tbody><tr><td>0.9% Saline Solution, Sterile</td><td>House Brand</td><td>1010</td><td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&deg;C</td></tr><tr><td>25G Needle</td><td>BD, Medstore, University of Toronto</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocaproic Acid, &ge;99% (titration), Powder</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&deg;C</td></tr><tr><td>6.35 mm ID Tubing</td><td>VWR</td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 Myoblast Cell Line</td><td>Institut de Myologie (Paris, France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arbitrary Waveform Generator</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14132-02</td><td>Stored as aliquots of 50 &micro;L or 100 &micro;L at -80&deg;C</td></tr><tr><td>Benchtop Vacuum Chamber</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>BNC to Aligator Clip Cable</td><td></td><td></td><td>Ordered from Amazon</td></tr><tr><td>Culture Plastics</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600069</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&deg;C</td></tr><tr><td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Insulin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>91077C</td><td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &micro;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&deg;C</td></tr><tr><td>Image Acquisition Software</td><td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>Image Processing Software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Oven</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Microscope - Camera Mount</td><td>Labcam</td><td>Labcam for iPhone</td><td>Ordered from Amazon</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&deg;C</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td><td>Dow</td><td>4019862</td><td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td></tr><tr><td>Polyurethane Negative Mold</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Release Agent</td><td>Mann Release Technologies</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Vane Vacuum Pump</td><td>Edwards</td><td>A65401906</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Razor Blade</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td><td>Promocell</td><td>C-23260</td><td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&deg;C.</td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td><td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&deg;C.</td></tr><tr><td>Smartphone (iPhone)</td><td>Apple</td><td>SE</td><td></td></tr><tr><td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilization Bag</td><td>Alliance</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>Thimble</td><td>Igege</td><td></td><td>Ordered from Amazon</td></tr><tr><td>Thrombin from human plasma</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T6884-250UN</td><td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &micro;L aliquots are prepared and stored at - 20&deg;C.</td></tr><tr><td>Tin coated copper wire</td><td>Arco</td><td>B8871K48</td><td>Ordered from Amazon</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td><td>Thermo FIsher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Chamber 2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Driedimensionale (3D) in vitro modellen van skeletspieren zijn een waardevolle vooruitgang in biomedisch onderzoek omdat ze de mogelijkheid bieden om skeletspierreformatie en -functie te bestuderen in een schaalbaar formaat dat vatbaar is voor experimentele manipulaties. 3D-spierkweeksystemen zijn wenselijk omdat ze wetenschappers in staat stellen om skeletspieren ex vivo te bestuderen in de context van menselijke cellen. 3D in vitro modellen bootsen aspecten van de inheemse weefselstructuur van volwassen skeletspieren na. Hun universele toepassing wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van platforms die eenvoudig te fabriceren, kosten- en gebruiksvriendelijk zijn en relatief grote hoeveelheden menselijke skeletspierweefsels opleveren. Bovendien, aangezien skeletspieren een belangrijke functionele rol spelen die in de loop van de tijd in veel ziektetoestanden wordt aangetast, is een experimenteel platform voor microtissue-studies het meest praktisch wanneer minimaal invasieve calciumtransiënte en contractiele krachtmetingen direct binnen het platform zelf kunnen worden uitgevoerd. In dit protocol wordt de fabricage van een 96-well platform dat bekend staat als 'MyoTACTIC', en de massale productie van 3D menselijke skeletspiermicrotissues (hMMTs) beschreven. Bovendien worden de methoden voor een minimaal invasieve toepassing van elektrische stimulatie gerapporteerd die herhaalde metingen van de skeletspierkracht en calciumbehandeling van elke microtissue in de loop van de tijd mogelijk maakt.

Hierin worden methoden beschreven om een 96-well PDMS-gebaseerd MyoTACTIC-kweekplatform uit een PU-mal te gieten, om arrays van hMMT-replicaweefsels te fabriceren en om twee aspecten van hMMT-functie te analyseren binnen de generatie van kweekapparatuurkracht en calciumbehandeling. Figuur 1 biedt een schematisch overzicht van de bereiding van MyoTACTIC kweekputten voor hMMT-zaaien. PDMS is een veelgebruikt polymeer op siliconenbasis, dat gemakkelijk kan worden gegoten om complexe apparaten t...

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol om arrays van 3D menselijke skeletspierenmicrotissues en minimaal invasieve downstream in situ assays van functie te produceren, inclusief contractiele kracht en calciumbehandelingsanalyses.

Beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Ons protocol beschrijft gedetailleerde methoden om een 3D-microtissuecultuur van menselijke skeletspieren te fabriceren en te analyseren. Spiermicrotissues kunnen worden toegepast op studies van elementaire spierbiologie, ziektemodellering of voor het testen van kandidaat-moleculen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in-situ beoordeling van contractiele kracht en calciumtransiënten mogelijk maakt.Daarom kunt u longitudinale studies van de spierweefselfunctie uitvoeren. De procedure wordt gedemonstreerd door Brennen Musgrave en Heta Lad, afgestudeerde studenten van mijn laboratorium. Plaats twee tot drie uur voor het zaaien van de cel een gedeelte van zes goed milde tactiekplaten in een celkweekschaal van 10 centimeter.Bereid elke individuele myotactische cultuur goed voor door 100 microliter van een 5% pluronische F-127-oplossing toe te voegen. Gebruik het deksel om de putjes af te dekken en breng een paraffinefilm aan om de schaal af te sluiten. Centrifugeer de schotel gedurende één minuut op 1.550 maal G in een centrifuge die is uitgerust met een platenspinneradapter.Bewaar de kweekschaal bij vier graden Celsius totdat de cellen klaar zijn om te zaaien. Ontdo

assessing-functional-metrics-skeletal-muscle-health-human-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

Dit protocol beschrijft het gebruik van microschaal silicium consoles als buigzaam cultuur oppervlakken voor het meten van de contractiliteit van spiercellen in vitro. Cellular samentrekking cantilever buigen, die kan worden gemeten, geregistreerd en omgezet in uitlezingen van kracht, die een non-invasieve en schaalbaar systeem voor het meten contractiele functie in vitro.

Benutting van microschaal Silicon Cantilevers to Cellular contractiele functie Beoordelen In Vitro

Dit protocol beschrijft een robuuste, reproduceerbare en eenvoudige methode van isolatie en de cultuur van myoblast stamcellen uit de skeletspieren van volwassen en ouderen. De spieren die hier gebruikt behoren voet- en beenspieren. Deze aanpak maakt het isoleren van een verrijkte populatie van primaire myoblasten voor functionele studies.

Voorbereiding en Cultuur van Myogene voorloper cellen / Primary myoblasten uit Skeletal Muscle van Adult en Aged Humans

Meting van knaagdier skeletspieren contractiele functie is een nuttig instrument dat kan worden gebruikt voor het bijhouden van de progressie van de ziekte, alsmede de werkzaamheid van de therapeutische interventie. Hier beschrijven we de niet-invasieve, in vivo beoordelingvan de releveurs spieren die na verloop van tijd in de dezelfde muis kan worden herhaald.

Niet-invasieve beoordelingvan releveurs spier functie in muizen

Dit technische rapport beschrijft een variatie van de gewijzigde Bergström techniek voor de biopsie van de musculus tibialis voorste die vezelschade beperkt.

Verzameling skeletspierbiopten uit het superieure compartiment van human musculus Tibialis Anterior voor mechanische evaluatie

Kwantificering van de maximale kracht van de knie-extensor is noodzakelijk om functionele aanpassingen aan veroudering, ziekte, letsel en revalidatie te begrijpen. We presenteren een nieuwe methode om herhaaldelijk in vivo knie-extensie isometrisch piek tetanisch koppel te meten.

In vivo meting van de spierfunctie van de knie-extensor bij muizen

In dit protocol wordt een in vitro kweek- en functionele analysemethode voor spierstamcellen beschreven, die de meeste van hun interacties met hun endogene niche behoudt.

Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

Dit protocol biedt methoden voor het genereren van 3D-gemanipuleerde hart- en skeletspierweefsels en beschrijft het gebruik ervan in preklinische screeningsmodaliteiten voor geneesmiddelen. De beschreven methoden maken gebruik van een magnetisch detectiesysteem om de gelijktijdige beoordeling van 24 weefsels parallel te vergemakkelijken.

Preklinische geneesmiddelentests in schaalbare 3D-gemanipuleerde spierweefsels

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Dit protocol maakt gebruik van microcomputertomografie om de kosteneffectieve kwantificering van vetvrije massa mogelijk te maken, inclusief skeletspieren en visceraal weefsel, vetweefsel en skeletweefsel bij kleine dieren. Het maakt onderscheid tussen mager en vetweefsel, wat aanzienlijke voordelen biedt voor biomedisch onderzoek, met name bij translationeel onderzoek bij kleine dieren.

Niet-invasieve kwantificering van skeletspieren bij kleine dieren met behulp van microcomputertomografie

Leer een protocol voor het fabriceren en analyseren van 3D menselijke skeletspier-microtissues met de MyoTACTIC 96-well plaat. Deze methode maakt schaalbare productie mogelijk en ondersteunt herhaalde metingen van contractiele kracht en calciumtransiënten.

Beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren

Meer video's verkennen