Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Eencellige labeling en visualisatie van dendritische of axonale priële priëlen is vereist om neuronale morfogenese te bestuderen. Door ontwikkelende priëlen op een minimaal invasieve manier te labelen, blijft netvliesweefsel gezond en geschikt voor langdurige confocale live beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om individuele priëlen met meerkleurige fluorescerende eiwitten binnen vier dagen na injectie te visualiseren.

Dit maakt het bestuderen van neonatale arbor morfologieën mogelijk. Dit injectiebeeldvormings- en analyseprotocol kan worden gebruikt om neuronale morfologieën in het centrale zenuwstelsel te bestuderen. De juiste Cre-selectie en injectielocatie moeten worden bepaald om zich te richten op de celpopulatie van belang.

Begin met het selecteren van een Cre-muislijn om de retinale celpopulaties van belang te labelen. Verkrijg recombinase-afhankelijk AAV-virus dat codeert voor fluorescerende eiwitten. Voor een optimale etikettering van fijne processen selecteert u vectoren die gemodificeerde fluorescerende eiwitten tot expressie brengen die zich op het plasmamembraan richten.

Voor de AAV aliquot op ijs, en bereid een één tot vier AAV verdunning met behulp van steriele zoutoplossing of PBS. Om de injecties te visualiseren, kleurt u de oplossing blauw door ongeveer één microliter 0,02% Fast Green FCF-kleurstofoplossing toe te voegen voor elke 15 microliter AAV-verdunning. Steriliseer het injectiegebied met 70% ethanol.

Vul de micropipette met de AAV-verdunning met behulp van een microsyringe. Breek onder een stereomicroscoop de micropipettepunt met een naald van 30 gauge om de punt los te maken. Na het verdoven van de neonatale muizen, tatoeëer hun voetzolen met tatoeage-inkt met behulp van een naald van 30 gauge om de dieren te identificeren.

Verzamel staartknipsels voor DNA-isolatie en genotypering. Veeg de huid boven de ogen af met 70% ethanol. Gebruik een naald van 30 gauge om het vergroeide ooglid te openen terwijl u lichte druk uitoefent met de vingers om het oog te openen.

Prik een klein gaatje door het hoornvlies bij de kruising van de cornea sclera. Steek de glazen micropipette in het gat en druk twee tot vier keer op het voetpedaal van de micro-injector om de AAV in de intravitreale ruimte te injecteren. Verwijder langzaam de micropipette en bevestig de AAV-injectie door de blauwe kleurstof in de pupil te visualiseren.

Na het voorbereiden van de retinale aCSF zoals beschreven in het teksthandschrift, oxygeneert u de retinale aCSF door minimaal 15 minuten met carbogen te borrelen en vervolgens de pH aan te passen aan 7,4. Sluit een petrischaaltje met een diameter van 60 millimeter in een ijsbak en vul deze met zuurstofrijke retinale aCSF. Leg de gevulde petrischaal onder een stereomicroscoop.

Snijd vervolgens de ooglidflap van de geëuthanaseerde muis om het oog bloot te leggen. Gebruik een stompe tang om de ogen te enucleeren en breng ze over naar de koude retinale aCSF die onder de stereomicroscoop is geplaatst. Stabiliseer onder de stereomicroscoop het oog door de oogzenuw vast te klemmen met behulp van dumont nummer vijf tang en prik een gat in het midden van het hoornvlies met een naald van 30 gauge en steek vervolgens een punt van de microschaar in het gat om een incisie te maken van het gat naar het einde van het hoornvlies.

Herhaal dit om vier plakjes in de windrichtingen te maken, waardoor er vier flappen ontstaan. Pak de twee aangrenzende flappen vast en trek ze uit elkaar en pel de sclera voorzichtig van het netvlies voor alle hoornvliesflappen. Verwijder vervolgens de lens van de retinale cup met behulp van de tang.

Gebruik ten slotte een microschaar om vier radiale incisies te maken van de rand van het netvlies naar de oogzenuw, waardoor vier gelijke bloemblaadjes ontstaan. Als u grijze MCE-membraanfilters met een grote diameter gebruikt voor montage, snijdt u de schijf in kwadranten van ongeveer een centimeter breed en plaatst u de MCE-schijf vervolgens op het midden van een groter wit filterpapier. Gebruik twee verfkwasten van maat drie bij nul en draai een retinale cup op een verfkwast met de retinale ganglioncel naar beneden.

Til het netvlies voorzichtig uit de aCSF en zorg ervoor dat de waterspanning het netvlies niet scheurt. Terwijl u de verfkwast nog steeds met het netvlies vasthoudt, verplaatst u de petrischaal met aCSF uit de weg en plaatst u het witte filterpapier met het MCE-membraan onder de stereoscoop. Plaats met behulp van een transferpipet een druppel aCSF in het midden van het MCE-filterpapier.

Drijf het netvlies in de aCSF-druppel die wordt gecreëerd door de oppervlaktespanning en het geladen MCE-membraan. Gebruik verfkwasten om het netvlies in de druppel te plaatsen met de retinale ganglioncel naar boven en vouw vervolgens de vier bloemblaadjes uit. Eenmaal geplaatst, maak je een waterbrug tussen de verfkwast en wit filterpapier om de oppervlaktespanning van de druppel te breken.

Monteer de live imaging incubatiekamer en vul deze met zuurstofrijke aCSF. Schakel de pomp en temperatuurregelaar in en zorg ervoor dat de temperatuur niet boven de 34 graden Celsius komt. Het kan tot een uur duren voordat de kamertemperatuur is gestabiliseerd.

Het wordt aanbevolen om de incubatiekamer in te stellen voordat u begint met retinale dissectie. Stabiele kamertemperatuur helpt de monsterdrift te verminderen. Om de retinale platte heuvel in de perfusiekamer over te brengen, stopt u de pomp en verwijdert u de aCSF die zich in de kamer bevindt.

Plaats vervolgens de MCE-schijf met de retinale platte houder in de incubatiekamer. Maak een monstergewicht voor om de oppervlaktespanning te breken en plaats het vervolgens op de vlakke houder om ervoor te zorgen dat het monstergewicht op het MCE-papier wordt geplaatst om de monsterdrift te verminderen. Vul de kamer opnieuw met de opgewarmde aCSF en laat aCSF circuleren met ongeveer één milliliter per minuut.

Plaats het neusstuk met het 25 keer waterdippende objectief in de beeldvormingskamer. Scherm voor gelabelde cellen van belang met behulp van epifluorescent licht en pas het beeldvolume aan om dendritische kenmerken van belang vast te leggen. Gebruik een opzoektabel die zowel oververzadigde als onderverzadigde pixels identificeert, pas het laservermogen zodanig aan dat er geen pixels oververzadigd zijn.

Verkrijg het 3D-beeldvolume en herhaal acquisitie met de gewenste framesnelheid. Het beeldvolume kan tussen elk tijdstip worden aangepast om de monsterdrift te compenseren. Importeer de afbeeldingsreeks en splitst de afbeeldingen op tijd.

Sla alle tijdspunten handmatig op of door een macro-plug-in uit te voeren. Maak een theoretische puntspreidingsfunctie met behulp van de ImageJ-plug-in door te klikken op Defraction PSF 3D, lens numeriek diafragma, fluorofoore-emissiegolflengte, pixelgrootte en Z-afstand zijn vereist om een nauwkeurige PSF te maken. Selecteer plug-ins, macro's en voer uit om batch parallelle iteratieve deconvolutie uit te voeren voor alle tijdspunten met behulp van de meegeleverde macro.

Importeer alle gedeconvolgeerde tijdspunten als een stapel door op bestand te klikken en vervolgens op afbeeldingsvolgorde. Converteer de stack naar een hyperstack door te klikken op image, hyperstacks en vervolgens stacks naar hyperstack. Voeg het aantal Z-slices en tijdframes toe en corrigeer de 3D-drift met de juiste 3D-driftplug-in.

Sla de 3D-drift gecorrigeerde hyperstack op en converteer de afbeelding terug naar een gewone stapel door op afbeelding, hyperstacks, hyperstacks te klikken om te stapelen en splits vervolgens de tijdpunten door op afbeelding, stapels, gereedschappen en stapels splitter te klikken. Als u het aantal substacks wilt splitsen, voert u het aantal tijdpunten in. Gebruik batchverwerking om een maximale projectie voor alle tijdspunten te maken.

Importeer de timelapse-afbeeldingsreeks door op bestand, importeer en vervolgens op afbeeldingsreeks te klikken. En gebruik conventionele ImageJ-tools voor de gewenste analyse van gedeconvolgeerde en nabewerkte tweedimensionale video, Een hoge resolutie 3D-video van het ontwikkelen van starburst-celdendrieten werd verkregen, gedeconvoleerd en gecorrigeerd voor 3D-drift. Z-plane maximale projecties werden geproduceerd om 2D-video's te maken voor analyse, die een gebied van dendritische verfijning en een gebied van dendritische uitgroei laten zien.

3D-deconvolutie van elk tijdspunt verhoogde de resolutie van fijne filopodiaprojecties van enkele P6 starburst amacrinecel voor en na deconvolutie met ImageJ. Langdurige AAV-infectieperioden leiden niet noodzakelijkerwijs tot een verhoogd fluorescerend signaal, zoals blijkt uit vergelijkbare niveaus van eiwitexpressie vijf en 11 dagen na injectie. Het verminderen van monsterdrift tijdens beeldvorming is belangrijk.

Drift wordt geminimaliseerd door een consistente beeldtemperatuur te handhaven en door het gewicht op de juiste manier op het monster te plaatsen. Als er drift optreedt, maakt handmatige acquisitie van de tijdreeks het mogelijk om het beeldvolume tussen frames aan te passen. Dit zorgt ervoor dat de kenmerken van belang in beeld blijven.

Dit protocol produceert hoge resolutie, gedeconvolgeerde en drift-gecorrigeerde 3D-video's van het ontwikkelen van neurieten. Dergelijke video's leiden tot een beter begrip van neuronbedrading en zijn nodig om computationele analysemethoden van 3D-morfogenese te bevorderen. Betere automatische tracerings- en trackingsoftware is vereist om een hoge doorvoeranalyse van neurietontwikkeling te bereiken.