Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

Glioomstamcellen zijn subpopulatie van cellen in het glioom, die meestal resistent zijn tegen chemo en radiotherapie. Hier beschreven we de methode voor snelle identificatie van combinatietherapieën, gericht op glioomstamcellen, in plaats van gedifferentieerde glioomcellen. Vergeleken met andere methoden, die moeizaam en ingewikkeld kunnen zijn.

Dit protocol is relatief eenvoudig en snel, om potentiële nuttige medicijncombinaties te identificeren. Begin met het verzamelen van de glioomstamcellen of GSC's uit het kweekmedium en centrifugeer ze gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op 70 keer G. Na het verwijderen van het supernatant, verteer de cellen met accutase gedurende vier minuten bij 37 graden Celsius.

Pipetteer de cellen herhaaldelijk met behulp van een tip van 200 microliter om te dissociëren en resuspend de celkorrel. Voeg de GSC's met een dichtheid van 200.000 cellen in één milliliter kweekmedium toe aan elke put van een kweekplaat met 12 putten en incubeer ze een nacht. Oh, voeg de volgende dag 30 microliter luciferase-eGFP-virus supernatant toe aan elke put van de plaat.

Centrifugeer de cellen op 1000 keer G gedurende twee uur, bij 25 graden Celsius en incubeer ze een nacht. Vervang de volgende dag het medium in de putten door de GSC's te verzamelen, ze te centrifugeren, het supernatant te verwijderen, ze in vers medium te resuspenderen en ze opnieuw te verdrijven. Kweek de cellen nog eens 48 uur.

Observeer de plaat onder een fluorescerende microscoop en bevestig het uiterlijk van GFP-positieve cellen. Sorteer en verzamel de GSC's met een hoge fluorescentie met behulp van een flow cell sorter en kweek ze verder. Bestrijk 96 goed optische bodemplaten met een extracellulair matrixmengsel, zoals matrigel, en incubeer ze gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Verwijder het overtollige mengsel en spoel de platen voorzichtig eenmaal met PBS, zaad vervolgens XG387-Luc-cellen met een dichtheid van 1000 cellen in 100 microliter kweekmedium en in elke put van de gecoate platen en kweek ze een nacht. Observeer de volgende dag de cellen onder een microscoop om hun hechting aan de plaat te bevestigen. Bereid vervolgens een 200 micromolaire temozolomide-oplossing en twee micromolaire oplossingen van de beoogde middelen, in kweekmedium.

Verwijder voor de screening van combinatiegeneesmiddelen het lege medium en voeg het medium met 200 micromolaire temozolomide of twee micromolaire gerichte middelen, of een combinatie van beide, toe aan elke put voor drie technische replicaties per behandeling. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie dagen. Maak foto's van de cellulaire bioluminescentie in de plaat met behulp van het IVIS-spectrumbeeldvormingssysteem.

Maak met behulp van de ingebouwde software meerdere cirkelvormige gebieden van het interessegebied en kwantificeer de cellulaire bioluminescentie. Om potentiële kandidaten te identificeren die het antiglioblastoomeffect van temozolomide zouden kunnen versterken, werden 20 doelselectieve kleine molecuulremmers geanalyseerd door middel van screening van geneesmiddelencombinaties. De gevoelige indexwaarden van 13 beoogde middelen lagen boven nul en vijf daarvan lagen boven de 0,1.

De gevoelige index van de twee belangrijkste kandidaat-geneesmiddelen UMI-77 en A 83-01 was hoger dan 0,25, wat suggereert dat ze kunnen samenwerken met temozolomide. De gecombineerde behandeling van temozolomide en UMI-77 werd geëvalueerd met behulp van een antiproliferatieve test in een titratiematrix van zes bij zes doses. De combinatie-indexwaarden waren minder dan één.

En de hoge enkelvoudige agentwaarden waren groter dan nul voor de meeste combinaties van temozolomide en UMI-77 bij verschillende concentraties. Suggereert een algemene synergetische interactie van temozolomide en UMI-77 in zowel XG387 als XG328 GSC's. Dit protocol kan ook worden toegepast bij het vinden van medicijncombinaties met behulp van adherente kankercellen door eenvoudig de plaatcoatingstap te verwijderen.