Name: Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Ontdek een snelle screeningsworkflow voor combinatietherapieën tegen glioblastoom met behulp van patiënt-afgeleide gliomastamcellen. Deze methode identificeert synergetische geneesmiddelen zoals UMI-77 en A 83-01.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de National Natural Science Foundation of China (81672962), de Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation en de Joint Key Project Foundation van Southeast University en Nanjing Medical University voor hun steun.

GBM-monster werd verkregen van een patiënt tijdens een routineoperatie na het verkrijgen van volledig geïnformeerde toestemming door de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het First Affiliated Hospital van de Nanjing Medical University.
1. Isolatie en cultuur van patiënt-afgeleide GSC's
<ol><li>Plaats vers chirurgisch gereseceerd glioblastoomweefsel in een centrifugebuis van 15 ml gevuld met steriel PBS en bewaar het weefsel op ijs tot verdere operatie.</li>
	<li>Gehakt het GBM-weefsel in stukken met een diameter van ongeveer 0,5 tot 1 mm met behulp van een dissectieschaar en was de weefselmonsters met neuronaal basaal medium om cellulair puin in een bioveiligheidskast te verwijderen.</li>
	<li>Verteer de weefselfragmenten met 1 mg/ml collagenase A bij 37 °C gedurende 30 minuten en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder het bovennatuurlijk middel en hang de pellet op met blanco neuronaal basaal medium en dissocieer de pellet mechanisch door herhaaldelijk pipetteren op ijs.</li>
	<li>Kweek het mengsel in ultralage aanhechting 6-well kweekplaten gevuld met GSC-kweekmedium (zie tabel 1 voor het recept) in een steriele celincubator met 5% CO2 en 90% vochtigheid bij 37 °C tot neurosfeervorming.</li>
	<li>Bij voldoende neurosfeervorming verzamelt u ze met een pipet in een microbuis van 1,5 ml en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 800 x g.</li>
	<li>Resuspend de pellet en splits deze in verschillende kolven gevuld met het bovenstaande kweekmedium voor het behoud van de primaire GSC's. OPMERKING: Patiënt-afgeleide GSC's die in het voorbeeld werden gebruikt, waren afgeleid van chirurgische biopsieën van een 34-jarige mannelijke patiënt met WHO graad IV recidiverende GBM. De GSC's werden genoemd als XG387 voor de toekomstige experimenten. Pcr-gebaseerde mycoplasmatests werden uitgevoerd voor de bovenstaande GSC's om te bevestigen dat er geen mycoplasmabesmetting aanwezig is. Alle experimenten met GSC's die in dit protocol werden gebruikt, werden uitgevoerd <15 passages.</li>
</ol>2. Luciferase-gelabelde GSC's voorbereiden
<ol><li>Verzamel de GSC's uit de mediumcultuur en centrifugeer ze gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur bij 70 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, verteer de cellen met accutase gedurende 4 min bij 37 °C. Gebruik een tip en pipet van 200 μL herhaaldelijk om de celkorrel te dissociëren en opnieuw te suspenen.</li>
	<li>Verdun de cellen tot 2 x 105 cellen per put in een 12-well kweekplaat en kweek de cellen 's nachts.</li>
	<li>Voeg 30 μL luciferase-EGFP-virus supernatant (titer >108 TU /ml) toe aan elke put in de plaat en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 2 uur bij 25 °C bij 1.000 x g. Kweek de cellen 's nachts.</li>
	<li>Ververs het medium de volgende dag en kweek de cellen nog eens 48 uur.</li>
	<li>Observeer de cellen onder een fluorescerende microscoop om het uiterlijk van de GFP-positieve cellen te bevestigen.</li>
	<li>Gebruik een flow cell sorter om de GSC's met hoge GFP-fluorescentie te sorteren en te selecteren om de cellen verder te kweken.</li>
</ol>3. Bio-luminescentie gebaseerde meting van de levensvatbaarheid van cellen
<ol><li>Coatingplaten met het extracellulaire matrixmengsel (ECM) (bijv. Matrigel): voeg 40 μL van 0,15 mg/ml ECM-mengsel toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C. Verwijder het overtollige ECM-mengsel en spoel het eenmaal voorzichtig af met PBS.</li>
	<li>Voeg 100 μL kweekmedium met 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 en 500 XG387-Luc cellen samen met 100 μL blanco medium toe als controle in elke put voor 6 replicaties in een 96-well optische bodemplaat en kweek de cellen 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, voeg 50 μL kweekmedium met 150 ng/μL D-luciferine toe in elke put en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Maak foto's van de cellulaire bio-luminescentie in de plaat met behulp van het IVIS-spectrumbeeldvormingssysteem. Gebruik de ingebouwde software om meerdere cirkelvormige gebieden van de regio van belang (ROI) te creëren en de cellulaire bio-luminescentie te kwantificeren.</li>
</ol>4. Temozolomide behandeling en combinatie screening
<ol><li>Precoat vier 96-well platen zoals hierboven beschreven, voorafgaand aan de behandeling.</li>
	<li>Zaad XG387-Luc-cellen met een dichtheid van 1.000 cellen in 100 μL kweekmedium in elke put van een optische bodemplaat met 96 putten en kweek de cellen 's nachts.</li>
	<li>Bereid temozolomide en de beoogde middelen van tevoren uit de stamoplossing. Bereid een concentratiereeks voor bestaande uit 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM en 50 μM temozolomide in kweekmedium voor de behandeling met één middel. Verdun temozolomide en de beoogde middelen in voorraadoplossing in het kweekmedium, respectievelijk, om eindconcentraties van 200 μM en 2 μM te verkrijgen voor combinatiescreening van geneesmiddelen(tabel 2).</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium wanneer de meeste GSC's zich aan de onderkant van de platen hechten; voeg het hierboven bereide medium dat temozolomide bevat toe aan elke put voor drie technische replicaties per behandeling.</li>
	<li>Om Temozolomide te behandelen en de geneesmiddelcombinaties te screenen, verwijdert u het lege medium en voegt u het hierboven bereide medium toe dat 200 μM temozolomide of 2 μM-gericht middel bevat, of een combinatie van beide in elke put voor drie technische replicaties per behandeling.</li>
	<li>Incubeer alle platen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3 dagen.</li>
	<li>Verwijder het geneesmiddelbevattende medium, voeg 50 μL blanco medium met 150 ng/μL D-luciferine toe in elke put en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Maak foto's van de cellulaire bio-luminescentie in de plaat met behulp van het IVIS-spectrumbeeldvormingssysteem. Gebruik de ingebouwde software om meerdere circulaire ROM's te maken en de cellulaire bio-luminescentie te kwantificeren.</li>
</ol>5. Combinatiebehandeling van temozolomide en UMI-77 in XG387-Luc en XG328-Luc cellijnen
<ol><li>Precoat drie 96-well platen zoals hierboven beschreven, voorafgaand aan de behandeling.</li>
	<li>Zaad XG387-Luc en XG328-Luc cellen met een dichtheid van respectievelijk 1.000 cellen in 100 μL kweekmedium in elke put van een 96-well optische bodemplaat en kweek de cellen 's nachts.</li>
	<li>Bereid een concentratiereeks voor bestaande uit 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM en 0 μM temozolomide en een concentratiereeks bestaande uit 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM en 0 μM UMI-77 in het kweekmedium voor titratiematrixbehandelingen met zes bij zes doses.</li>
	<li>Verwijder het lege medium wanneer de meeste GSC's zich aan de onderkant van de plaat hechten; voeg het hierboven bereide medium toe aan elke put voor drie technische replicaties per behandeling.</li>
	<li>Incubeer deze platen gedurende 3 dagen bij 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Verwijder het medicijnbevattende medium; voeg 50 μL blanco medium met 150 ng/μL D-luciferine toe aan elke put en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C voor bioluminescentiemeting.</li>
</ol>6. Data-analyse
<ol><li>Bereken de gevoeligheidsindexscore (SI) van temozolomide en het beoogde middel volgens de formule in figuur 2A. OPMERKING: De SI-score is om de invloed van de toevoeging van een ander medicijn te kwantificeren. Het varieerde van -1 tot +1, met positieve waarden die wijzen op synergetische effecten van temozolomide.</li>
	<li>Bereken de combinatie-indexwaarden (CI) tussen temozolomide en UMI-77 met behulp van CompuSyn-software om hun gecombineerde interacties te analyseren. CI-waarde <1 duidt op synergie; CI-waarde >1 duidt op antagonisme.</li>
	<li>Bereken de hoge HSA-waarden (Single Agent) tussen temozolomide en UMI-77 met behulp van Combenefit-software. HSA-waarde geeft het gecombineerde remmende effect aan. HSA-waarde >0 duidt op synergie en de HSA-waarde <0 op antagonisme.</li>
</ol>

<ol><li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes & Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li>
<li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+stem+cells%3A+a+novel+framework+for+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combenefit%3A+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li>
<li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li>
<li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4%2F6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li>
<li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752(2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen conflicten bekend te maken.

In de huidige studie werd een protocol beschreven dat kan worden toegepast om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide GSC's. In tegenstelling tot het standaard synergie/additiviteitsmetrische model zoals Loewe, BLISS of HSA-methoden, werd een eenvoudige en snelle workflow gebruikt waarbij een medicijnpaar niet op een volledige factoriële manier in meerdere concentraties moet worden gecombineerd als de traditionele methoden. In deze workflow werd SI (sensitivity index) geïn...

Glioblastoom (GBM) is het meest voorkomende en agressieve type primaire hersentumor. Momenteel is de totale overleving van GBM-patiënten die een maximale behandeling kregen (een combinatie van chirurgie, chemotherapie en radiotherapie) nog steeds korter dan 15 maanden; dus nieuwe en effectieve therapieën voor GBM zijn dringend nodig.
De aanwezigheid van glioomstamcellen (GSC's) in GBM vormt een aanzienlijke uitdaging voor de conventionele behandeling, omdat deze stamcellen een centrale rol spelen bij het behoud van tumormicro-omgeving, medicijnresistentie en tumorrecidief1. Daarom kan het richten op GSC's een veelbelovende strategie zijn voor GBM-behandeling2. Niettemin is een groot nadeel voor de werkzaamheid van het geneesmiddel bij GBM de heterogene aard ervan, inclusief maar niet beperkt tot het verschil in genetische mutaties, gemengde subtypen, epigenetische regulatie en tumormicro-omgeving, waardoor ze zeer refractair zijn voor behandeling. Na vele mislukte klinische onderzoeken realiseerden wetenschappers en klinische onderzoekers zich dat gerichte therapie met één middel waarschijnlijk niet in staat is om de progressie van zeer heterogene kankers zoals GBM volledig te beheersen. Terwijl zorgvuldig geselecteerde medicijncombinaties zijn goedgekeurd voor hun effectiviteit door synergetisch het effect van elkaar te versterken, waardoor een veelbelovende oplossing voor GBM-behandeling wordt geboden.
Hoewel er veel manieren zijn om de geneesmiddel-geneesmiddelinteracties van een geneesmiddelcombinatie te evalueren, zoals de CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) en Bliss-waarden, enz.3,4, zijn deze berekeningsmethoden meestal gebaseerd op combinaties van meerdere concentraties. Inderdaad, deze methoden kunnen een positieve beoordeling van de interactie tussen geneesmiddel en geneesmiddel bieden, maar kunnen zeer bewerkelijk zijn als ze worden toegepast bij screening met hoge doorvoer. Om het proces te vereenvoudigen, werd een screeningsworkflow ontwikkeld voor het snel identificeren van de potentiële medicijncombinaties die de groei van GSC's remmen, afkomstig van chirurgische biopsieën van patiënt GBM. Een gevoeligheidsindex (SI) die het verschil van het verwachte gecombineerde effect en het waargenomen gecombineerde effect weergeeft, werd in deze methode geïntroduceerd om het synergetische effect van elk geneesmiddel te kwantificeren, zodat de potentiële kandidaten gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door de SI-ranglijst. Ondertussen demonstreert dit protocol een voorbeeldscherm om de potentiële kandidaat (en) te identificeren die het anti-glioomeffect kunnen synergiseren met temozolomide, de eerstelijns chemotherapie voor GBM-behandeling, onder 20 kleine moleculaire remmers.

<table><tbody><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0263</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Gluta Max</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>1X</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>P: 10,000 units/ml&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; S:&nbsp; 10,000 ug/ml</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>2088876</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Tabel 1. De&nbsp;formulering&nbsp;van GSC&nbsp;compleet kweekmedium.&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABT-737</td><td>MCE</td><td></td><td>Selectieve en BH3 mimetische&nbsp;Bcl-2,&nbsp;Bcl-xL&nbsp;en&nbsp;Bcl-w&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>Adavosertib (MK-1775)</td><td>MCE</td><td></td><td>Wee1&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>Axitinib</td><td>MCE</td><td></td><td>Multi-targeted tyrosine kinase remmer</td></tr><tr><td>AZD5991</td><td>MCE</td><td></td><td>Mcl-1&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>MCE</td><td></td><td>Krachtige remmer van TGF-&beta; type I receptor&nbsp;ALK5 kinase</td></tr><tr><td>CGP57380</td><td>Selleck</td><td></td><td>Krachtige&nbsp;MNK1&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>Dactolisib (BEZ235)</td><td>Selleck</td><td></td><td>Dual ATP-competitieve&nbsp;PI3K&nbsp;en&nbsp;mTOR&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>Dasatinib</td><td>MCE</td><td></td><td>Dual&nbsp;Bcr-Abl en Src familie tyrosine kinase&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>Erlotinib</td><td>MCE</td><td></td><td>EGFR&nbsp;tyrosine kinase remmer</td></tr><tr><td>Gefitinib</td><td>MCE</td><td></td><td>EGFR tyrosine kinase&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>Linifanib</td><td>MCE</td><td></td><td>Multi-target remmer van&nbsp;VEGFR&nbsp;en&nbsp;PDGFR&nbsp;familie</td></tr><tr><td>Masitinib</td><td>MCE</td><td></td><td>Remmer van&nbsp;c-Kit</td></tr><tr><td>ML141</td><td>Selleck</td><td></td><td>Niet-competitieve remmer van&nbsp;Cdc42 GTPase&nbsp;</td></tr><tr><td>OSI-930</td><td>MCE</td><td></td><td>Multi-target remmer van Kit, KDR en CSF-1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Palbociclib</td><td>MCE</td><td></td><td>Selectieve&nbsp;CDK4&nbsp;en&nbsp;CDK6&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>MCE</td><td></td><td>Selectieve&nbsp;p38 MAP kinase&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>Sepantronium bromide (YM-155)</td><td>MCE</td><td></td><td>Survivin&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>TCS 359</td><td>Selleck</td><td></td><td>Krachtige FLT3 remmer</td></tr><tr><td>UMI-77</td><td>MCE</td><td></td><td>Selectieve&nbsp;Mcl-1&nbsp;remmer</td></tr><tr><td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td><td>Selleck</td><td></td><td>Selectieve&nbsp;oestrogeen receptor (ER)&nbsp;modulator</td></tr><tr><td>Tabel 2. De informatie van 20 gerichte agentia gebruikt in de testscreen. Dit zijn allemaal doelgerichte selectieve kleine moleculaire remmers. De leverancier, naam en doelen werden gegeven in de tabel.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor gbm te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

De glioomstamcellen (GSC's) zijn een klein deel van de kankercellen die een essentiële rol spelen bij tumorinitiatie, angiogenese en medicijnresistentie bij glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en verwoestende primaire hersentumor. De aanwezigheid van GSC's maakt de GBM zeer refractair voor de meeste individuele gerichte middelen, dus screeningmethoden met hoge doorvoer zijn vereist om potentiële effectieve combinatietherapieën te identificeren. Het protocol beschrijft een eenvoudige workflow om snelle screening op mogelijke combinatietherapie met synergetische interactie mogelijk te maken. De algemene stappen van deze workflow bestaan uit het vaststellen van luciferase-gelabelde GSC's, het voorbereiden van matrigel gecoate platen, combinatiegeneesmiddelscreening, analyseren en valideren van de resultaten.

De XG387-cellen vormden neurosferen in het kweekmedium beschreven in tabel 1 in een ultralage aanhechting 6-well kweekplaat of een niet-gecoate plaat5 (figuur 1A). Eerst werd een test uitgevoerd om te controleren of de bio-luminescentie-intensiteit van XG387-Luc-cellen evenredig was met het celnummer. Zoals te zien is in figuur 1B,nam de bio-luminescentie-intensiteit evenredig toe met de celdichtheid en resulteerde in een...

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Glioomstamcellen zijn subpopulatie van cellen in het glioom, die meestal resistent zijn tegen chemo en radiotherapie. Hier beschreven we de methode voor snelle identificatie van combinatietherapieën, gericht op glioomstamcellen, in plaats van gedifferentieerde glioomcellen. Vergeleken met andere methoden, die moeizaam en ingewikkeld kunnen zijn.Dit protocol is relatief eenvoudig en snel, om potentiële nuttige medicijncombinaties te identificeren. Begin met het verzamelen van de glioomstamcellen of GSC's uit het kweekmedium en centrifugeer ze gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op 70 keer G. Na het verwijderen van het supernatant, verteer de cellen met accutase gedurende vier minuten bij 37 graden Celsius.Pipetteer de cellen herhaaldelijk met behulp van een tip van 200 microliter om te dissociëren en resuspend de celkorrel. Voeg de GSC's met een dichtheid van 200.000 cellen in één milliliter kweekmedium toe aan elke put van een kweekplaat met 12 putten en incubeer ze een nacht. Oh, voeg de volgende dag 30 microliter luciferase-eGFP-virus supernatant toe aan elke put van de plaat.Centrifugeer de cellen op 1000 keer G gedurende twee uur, bij 25 graden Celsius en incubeer ze een nacht. Vervang de volgende dag het medium in de putten door de GSC's te verzamelen, ze te centrifugeren, het supernatant te verwijderen, ze in vers medium te resuspenderen en ze opnieuw te verdrijven. Kweek de cellen nog eens 48 uur.Observeer de plaat onder een fluorescerende microscoop en bevestig het uiterlijk van GFP-positieve cellen. Sorteer en verzamel de GSC's met een hoge fluorescentie met behulp van een flow cell sorter en kweek ze verder. Bestrijk 96 goed optische bodemplaten met een extracellulair matrixmengsel, zoals matrigel, en incubeer ze gedurende een uur bij 37 graden Celsius.Verwijder het overtollige mengsel en spoel de platen voorzichtig eenmaal met PBS, zaad vervolgens XG387-Luc-cellen met een dichtheid van 1000 cellen in 100 microliter kweekmedium en in elke put van de gecoate platen en kweek ze een nacht. Observeer de volgende dag de cellen onder een microscoop om hun hechting aan de plaat te bevestigen. Bereid vervolgens een 200 micromolaire temozolomide-oplossing en twee micromolaire oplossingen van de beoogde middelen, in kweekmedium.Verwijder voor de screening van combinatiegeneesmiddelen het lege medium en voeg het medium met 200 micromolaire temozolomide of twee micromolaire gerichte middelen, of een combinatie van beide, toe aan elke put voor drie technische replicaties per behandeling. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie dagen. Maak foto's van de cellulaire bioluminescentie in de plaat met behulp van het IVIS-spectrumbeeldvormingssysteem.Maak met behulp van de ingebouwde software meerdere cirkelvormige gebieden van het interessegebied en kwantificeer de cellulaire bioluminescentie. Om potentiële kandidaten te identificeren die het antiglioblastoomeffect van temozolomide zouden kunnen versterken, werden 20 doelselectieve kleine molecuulremmers geanalyseerd door middel van screening van geneesmiddelencombinaties. De gevoelige indexwaarden van 13 beoogde middelen lagen boven nul en vijf daarvan lagen boven de 0,1.De gevoelige index van de twee belangrijkste kandidaat-geneesmiddelen UMI-77 en A 83-01 was hoger dan 0,25, wat suggereert dat ze kunnen samenwerken met temozolomide. De gecombineerde behandeling van temozolomide en UMI-77 werd geëvalueerd met behulp van een antiproliferatieve test in een titratiematrix van zes bij zes doses. De combinatie-indexwaarden waren minder dan één.En de hoge enkelvoudige agentwaarden waren groter dan nul voor de meeste combinaties van temozolomide en UMI-77 bij verschillende concentraties. Suggereert een algemene synergetische interactie van temozolomide en UMI-77 in zowel XG387 als XG328 GSC's. Dit protocol kan ook worden toegepast bij het vinden van medicijncombinaties met behulp van adherente kankercellen door eenvoudig de plaatcoatingstap te verwijderen.

a-rapid-screening-workflow-to-identify-potential-combination-therapy

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Deze video protocol toont de isolatie en de uitbreiding van stamcellen als cellen van chirurgisch gereseceerd menselijke glioblastoom mutliforme (GBM) tumor weefsel met behulp van de neurosphere assay kweekmethode.

Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

De identificatie van hersentumor initiëren cellen (BTICs), de zeldzame cellen binnen een heterogene tumor bezit stamcel eigenschappen, geeft nieuwe inzichten in de menselijke hersenen tumor pathogenese. We hebben verfijnd specifieke kweekomstandigheden te verrijken voor BTICs, en we routinematig gebruik van flowcytometrie om verder te verrijken deze populaties. Zelfvernieuwing en assays transcript analyse door eencellige RT-PCR kan vervolgens worden uitgevoerd op deze geïsoleerde cellen.

Verwerking van primaire hersentumor Weefsel voor Stem Cell Testen en Flow sorteren

Door het combineren van een gepolijste en versterkte dunne-schedel (poorten) craniale venster en glioblastoma (GBM) cel injectie, kunnen we zien glioom initiatie en groei van geïnjecteerd GBM cellen in de hersenen van een levende muis lengterichting.

Imaging glioom Initiatie<em&gt; In Vivo</em&gt; Door middel van een gepolijst en versterkte Thin-schedel Schedel Window

This video demonstrates the establishment of luciferase-tagged glioma stem cells via lentivirus-mediated gene delivery. Luciferase acts as a reporter gene and helps facilitate rapid drug screening experiments.

Luciferase-tagged Glioma Stem Cell Model: A Lentivirus-mediated Method to Prepare Luciferase-tagged Glioma Stem Cells for In Vitro Therapeutic Studies

This video demonstrates a technique to generate a glioblastoma stem cell reporter line to identify the differentiation of glioblastoma stem cells (GSCs) into astroglia. It outlines the steps involved in seeding GSCs, transducing them with a lentivirus encoding GFP, and determining GFP reporter expression through flow cytometry.

A Lentiviral Transcriptional Reporter System to Generate a Glioblastoma Stem Cell Differentiation Reporter Line

Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Tumor-zoekende therapeutische mesenchymale stamcellen (MSCs) tonen belofte als een behandeling voor invasieve glioblastoma. Optimale transplantatie gaat om levering van MSCs in de holte van de resectie tumor op steigers. Hier, preklinische technieken om te studeren MSC behandeling van glioblastoma zijn geleverd inclusief: afbeelding-geleide tumor resectie; implantatie van MSC-geplaatste steigers; en postoperatieve therapie volgen.

Image-Guided resectie van Glioblastoma en intracraniële implantatie van therapeutische stamcel-geplaatste steigers

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Hier schetsen we een uitgebreid protocol voor het genereren en gebruiken van in het laboratorium gemanipuleerde glioblastoom-organoïden (LEGO) om genotype-fenotype-afhankelijkheden te onderzoeken en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling van glioblastoom te screenen.

In het laboratorium gemanipuleerde glioblastoom organoïdecultuur en screening van geneesmiddelen

Dit protocol beschrijft een methode voor de snelle verwerking van post-mortem diffuse intrinsieke pontijnse glioom monsters voor de oprichting van de patiënt afgeleide celcultuur modellen of directe karakterisering van tumor en micro-omgeving van de cellen.

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Ontdek een snelle screeningsworkflow voor combinatietherapieën tegen glioblastoom met behulp van patiënt-afgeleide gliomastamcellen. Deze methode identificeert synergetische geneesmiddelen zoals UMI-77 en A 83-01.

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen (Video) | JoVE Journal

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

Meer video's verkennen