Name: Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer hoe je reactieve zuurstofsoorten kwantificeert in neutrofielen besmet met meningitische Escherichia coli. Deze methode met fluorescentieprobes en real-time microplaatlezing helpt onderzoekers bij het bestuderen van bactericide mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) en het Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35).

Perifeer bloed van vrijwilligers dat in dit onderzoek werd toegepast, werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de eerste Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Bereiding van reagentia en kweekmedium
<ol><li>Bereid de rode bloedcellysebuffer voor door 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3,37,2 mg Na2EDTA toe te voegen aan 1 L dubbel gedestilleerd water en de pH aan te passen tot 7,2-7,4. Verwijder de bacteriën door filtratie met 0,22 μm filters.</li>
	<li>Bereid het experimentele kweekmedium voor neutrofielen voor door 5% foetale runderserum toe te voegen aan RPMI 1640 medium en op te slaan bij 4 °C. Voor gebruik op kamertemperatuur brengen. OPMERKING: Gebruik het RPMI 1640 medium zonder fenolrood.</li>
	<li>Bereid fosfaatbufferoplossing (PBS) door 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO4 ·2H2O en 0,2 g KH2PO4toe te voegen aan 1 L dubbel gedestilleerd water in een glazen kolf van 1 L. Stel de pH in op 7,2-7,4. Autoclaaf het gedurende 15 minuten bij 121 °C.</li>
	<li>Bereid rifampicineoplossing door 0,5 g rifampicinepoeder op te lossen in 10 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om een rifampicineoplossing van 50 mg/ml op te leveren.</li>
	<li>Bereid LB agar-oplossing door 10 g NaCl, 10 g trypton, 5 g gistextract en 15 g agarpoeder toe te voegen aan 1 L dubbel gedestilleerd water en het mengsel te autoclaafen. Vul de Petrischalen tot de helft van het volume door warme LB-agaroplossing met 100 μg/ml rifampicine te gieten. Bewaar de afgekoelde massieve plaat op 4 °C.</li>
	<li>Bereid hersenhartinfusie (BHI) bouillon geschikt voor bacteriële stammen door 37 g BHI-poeder op te lossen in 1 L dubbel gedestilleerd water. Stel de pH in op 7,2 en autoclaaf deze.</li>
	<li>Los de fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) op in DMSO-oplosmiddel om een voorraadoplossing van 10 mM op te leveren. Voorzichtig mengen voor gebruik. OPMERKING: Breng de voorraadoplossing onmiddellijk in lichtdichte flacons. De houdbaarheid van de voorraadoplossing is 6 maanden bij -20 °C.</li>
</ol>2. Bereiding van E44-bacteriestam
OPMERKING: E44 is een mutante stam van meningitische E. coli met rifampicineresistentie.
<ol><li>Dompel de cryopreserved E44 kolonie onder met een steriele pipetpunt, enen de E44 stam op de LB agar plaat die 100 μg/ml rifampicine bevat door lijnen te tekenen. Zet de plaat 's nachts ondersteboven in de incubator bij 37 °C.</li>
	<li>Pluk een dag voor het experiment een E44-kolonie van de plaat met een steriele pipetpunt en doe deze in 5 ml BHI-bouillon met 100 μg/ml rifampicine in een kolf van 50 ml. Incubeer de bacteriecultuur bij 37 °C met 90 tpm gedurende 17 uur in een incubatie shaker.</li>
</ol>3. Isolatie van neutrofielen uit menselijk perifeer bloed
<ol><li>Neem 5 ml bloedmonster van vrijwilligers intraveneus naar de vacuümbloedafnamebuis met EDTA voor anticoagulatie.</li>
	<li>Centrifugeer de perifere bloedmonsters gedurende 5 minuten op 500 x g. De bloedmonsters zijn verdeeld in drie lagen door centrifugeren, die van onder naar boven de rode bloedcel (RBC) laag, de witte bloedcel (WBC) laag en de plasmalaag, opeenvolgend zijn.</li>
	<li>Aspireer de witte bloedcellaag met een pipet naar een nieuwe buis met 3x RBC-lysisbuffer. Meng het mengsel grondig en plaats het gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.</li>
	<li>Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 500 x g. Aspireer het supernatant volledig en gooi het weg.<ol>
<li>Herhaal de lysisprocedure met RBC-lysisbuffer 1-2 keer, totdat het neerslag wit wordt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was de cellen door het neerslag te resuspenderen met 2 ml PBS. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 300 x g om de cellen tot op de bodem van de buis te laten bezinken.</li>
	<li>Label de neutrofielen met CD16 microbeads door het sediment opnieuw te bezinken met 50 μL voorgekoelde magnetische celsorteerbuffer. Meng vervolgens grondig met 50 μL menselijke CD16 microbeads. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten op 4 °C. OPMERKING: Oplossingen moeten voorgekoeld worden om aftopping van antilichamen op het celoppervlak en niet-specifieke etikettering te voorkomen. De meeste volwassenen hebben ongeveer 4.000 tot 10.000 witte bloedcellen per microliter bloed, waaronder neutrofielen goed zijn voor ongeveer 50-70%. Volgens schatting zijn de tellingen van de totale witte bloedcellen in 5 ml menselijk perifeer bloed meestal tot 2-5 x 107.</li>
	<li>Was de cellen door 2 ml magnetische celsorteerbuffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 4 °C, 300 x g. Gooi het supernatant volledig weg en resuspendeer het neerslag met 500 μL sorteerbuffer.</li>
	<li>Monteer de magnetische kolom en de scheidingsplank. Verplaats de afscheider met de magnetische kolom naar de plank en spoel de kolom af met 3 ml sorteerbuffer.</li>
	<li>Laat de celsuspensie in de kolom vallen zodat de neutrofielen die door de magnetische kralen zijn gelabeld, zich aan de magnetische kolom kunnen hechten.</li>
	<li>Was de niet-gelabelde cellen af door 3 keer 3 ml magnetische celsorteerbuffer toe te voegen en zorg ervoor dat het kolomreservoir elke keer leeg is.</li>
	<li>Verwijder de kolom van de magneetscheider en plaats deze op een buis van 15 ml. Voeg 5 ml magnetische celsorteerbuffer toe aan de kolom. Duw de cellen met een magnetisch label naar buiten met behulp van een zuiger. OPMERKING: Om de zuiverheid van de neutrofielen te verbeteren, kunnen de sorteerstappen worden herhaald met behulp van een nieuwe kolom.</li>
	<li>Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 300 x g, gooi het supernatant volledig weg en resuspendeer het neerslag met 1 ml kweekmedium. Bepaal het celnummer met een celteller en bereid de cellen voor op verdere experimenten.</li>
</ol>4. Meting van ROS
<ol><li>Centrifugeer de geïsoleerde neutrofielen gedurende 5 minuten op 300 x g, resuspeneer het neerslag en pas de celconcentratie aan op 2 x 106/ml met een kweekmedium dat 5 μM DHE fluorescentiesonde bevat.</li>
	<li>Incubeer de neutrofielen gedurende 30 minuten bij 37 °C om de DHE-sonde te laden en wijs de celsuspensie vervolgens toe aan een 96-put zwarte polystyreenmicroplaat met 200 μL per put.</li>
	<li>Schakel de microplaatlezer in en open de detectiesoftware. Kies ondoorzichtig 96-wells plaatformaat en bepaal het leesgebied.<ol>
<li>Stel de fluorescentie (Ex/Em = 518/605 nm) elke 5 min in kinetische modus in gedurende 60 min op 37 °C. Zorg ervoor dat u de plaat voor elke meting 3 s schudt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haal de microplaat uit de incubator, voeg de gekweekte E44 (MOI=100) of phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) (100 ng/ml) toe aan elke put met voorgeladen neutrofielen met 3 replica's. Gebruik PMA als een positieve controle.</li>
	<li>Plaats de plaat in de microplaatlezer en start de test onmiddellijk.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).</li>
<li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+%3C%2F%3D60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis%3A+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31(2019).</li>
<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li>
<li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li>
<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li>
<li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Molecules%2C+Functions+and+Pathophysiological+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li>
<li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+ROS-induced+ROS+release%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li>
<li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li>
<li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neutrophil%27s+Role+During+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li>
<li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases%3A+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li>
<li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Neutrophil+Oxidants%3A+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li>
<li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+%28ETs%29+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li>
<li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neutrophil+function+test%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li>
<li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li>
<li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mitochondrial+Mass%2C+Damage%2C+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Neutrofielen fungeren als de meest voorkomende component van witte bloedcellen in de menselijke bloedsomloop. Het zijn belangrijke effectorcellen in het aangeboren menselijke immuunsysteem, dat de eerste verdedigingslinie bouwt tegen de invasie van ziekteverwekkers11. De generatie van ROS vertegenwoordigt een van de belangrijkste bacteriedodende mechanismen van neutrofielen na fagocytose11. Recente studies hebben aangetoond dat een netachtige structuur die vrijkomt door een...

Neonatale bacteriële meningitis is een veel voorkomende pediatrische infectieziekte. Escherichia coli (E. coli) met een K1 capsule is de meest voorkomende Gram-negatieve ziekteverwekker die neonatale bacteriële meningitis veroorzaakt, goed voor ongeveer 80% van de totale incidentie1,2,3. Ondanks de vooruitgang in de antimicrobiële chemotherapie en ondersteunende zorg, is bacteriële meningitis nog steeds een van de meest verwoestende aandoeningen met hoge morbiditeit enmortaliteit 4.
Het optreden van neonatale bacteriële meningitis begint meestal met bacteriëmie veroorzaakt door het binnendringen van pathogene bacteriën in de perifere circulatie van de lokale laesies van de pasgeborenen, gevolgd door penetratie door de bloed - hersenbarrière (BBB) in de hersenen, wat resulteert in de ontsteking van de hersenvliezen4. Het begin van bacteriëmie hangt af van de interactie tussen bacteriën en gastheerimmuuncellen, waaronder neutrofielen en macrofagen, enz. Neutrofielen, die goed zijn voor ~ 50-70% van de witte bloedcellen, zijn de eerste verdedigingslinie tegen bacteriële infecties5,6. Tijdens de invasie van bacteriën worden de geactiveerde neutrofielen gerekruteerd naar de besmettelijke locaties en geven reactieve zuurstofsoorten (ROS) vrij, waaronder het superoxide anion, waterstofperoxide, hydroxylradicalen en singlet zuurstof7. Ros ondergaat redoxreacties met het celmembraan, nucleïnezuurmoleculen en proteïnen van de bacteriën, resulterend in het letsel en de dood van de binnenvallende bacteriën8. De mitochondriën is de belangrijkste plaats van ROS-productie in eukaryotische cellen, en verschillende oxidasen (bijv. nicotinamide adenine dinucleotidefosfaat (NADPH) oxidasecomplex, lipoxygenasesysteem, eiwitkinase C en cyclooxygenasesysteem) bemiddelen de productie van ROS9,10. De real-time meting van de productie van ROS, die het primaire antimicrobiële mechanisme bij neutrofielen vertegenwoordigt, is een nuttige methode voor het bestuderen van gastheerverdediging tijdens de interactie tussen bacteriën en gastheer.
In dit protocol werd de tijdsafhankelijke ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli gekwantificeerd met een fluorescerende ROS-sonde DHE, gedetecteerd door een real-time fluorescentiemicroplaatlezer. Deze methode kan ook worden toegepast bij de beoordeling van de ROS-productie in andere zoogdiercellen tijdens de interactie tussen ziekteverwekker en gastheer.

<table><tbody><tr><td>15 mL polypropyleenconische centrifugebuizen</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Automatische celteller</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast</td><td>Shanghai Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>Brain heart infusion</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Microbeads, menselijk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>Kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>Fataal runder serum</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell</td><td></td></tr><tr><td>MACS-scheidingsbuffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)</td><td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS scheidingseenheid</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifamycin</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640-medium</td><td>Sangon Biotech</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>Thermostaatschudder</td><td>Shanghai Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische escherichia coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is de meest voorkomende Gram-negatieve bacterie die neonatale meningitis veroorzaakt. Het optreden van bacteriëmie en bacteriële penetratie door de bloed - hersenbarrière zijn onmisbare stappen voor de ontwikkeling van E. coli meningitis. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vertegenwoordigen de belangrijkste bacteriedodende mechanismen van neutrofielen om de binnengevallen pathogenen te vernietigen. In dit protocol werd de tijdsafhankelijke intracellulaire ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli gekwantificeerd met behulp van fluorescerende ROS-sondes die werden gedetecteerd door een real-time fluorescentiemicroplaatlezer. Deze methode kan ook worden toegepast bij de beoordeling van de ROS-productie in zoogdiercellen tijdens interacties tussen pathogene gastheer en gastheer.

Met behulp van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, werden de neutrofielen geïsoleerd uit menselijk perifeer bloed en geladen met fluorescentiesonde DHE om de veranderingen van ros-niveaus als reactie op E44-infectie te detecteren. Hier leveren we representatieve gegevens die de ROS-productie aantonen die wordt opgeroepen door E44-stam, bepaald door een microplaatlezer in realtime. Door E44-stammen toe te voegen bij een MOI van 100 namen de ROS-niveaus onmiddellijk toe en vertoonden zij een continue opwaarts...

Escherichia coli is de belangrijkste oorzaak van neonatale gramnegatieve bacteriële meningitis. Tijdens de bacteriële infectie spelen reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door neutrofielen een belangrijke bacteriedodende rol. Hier introduceren we een methode om de reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen te detecteren als reactie op meningitis E. coli.

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli is de meest voorkomende gramnegatieve bacterie die neonatale meningitis veroorzaakt. Het optreden van neonatale bacteriële meningitis begint puur met de bacteriëmie en vervolgens dringen de bacteriën in het bloed door de bloed-hersenbarrière om meningitis te veroorzaken. Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie tegen de bacteriële infecties.Tijdens bacteriële invasie geven de actieve neutrofielen ROS vrij. ROS vertegenwoordigt de belangrijkste bacteriocidale mechanismen van gastheercellen om de binnendringende pathogenen te vernietigen. Het meten van de productie van ROS bij neutrofielen is een handige methode om de afweer van de gastheer te starten tijdens interactie tussen bacteriën en gastheer.Neem een enkele bacteriekolonie van de plaat met een steriele pipet en doe deze in vijf milliliter Brain-Heart infusiemedium met Rifampicine in een holle kolf. Incubeer de bacteriecultuur bij 37 graden Celsius, met 90 RPM gedurende 17 uur in de incubatie shaker. Centrifugeer de perifere bloedmonsters bij 2000 RPM gedurende vijf minuten.Na centrifugeren worden de bloedmonsters verdeeld in drie lagen. Van onder naar boven, de rode bloedcellenlaag, de witte bloedcellenlaag en de plasmalaag. Aspireer de witte bloedcellen laag naar een nieuwe buis met een steriele pipet.Voeg een drievoudige rode bloedcellysebuffer toe. Meng het mengsel grondig en plaats het gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Centrifugeer de buis vijf minuten bij 2000 rpm.Aspireer het supernatant volledig en gooi het weg. Herhaal de lysisprocedure van rode bloedcellen een of twee keer, totdat de sedimenten wit worden. Was de cellen door het sediment opnieuw op te schorten met twee milliliter PBS.Centrifugeer de buis vervolgens gedurende vijf minuten bij 1000 RPM. Resuspendeer het sediment met 15 microliter voorcode magnetische cel sorteerbuffer voor 15 miljoen cellen. Voeg 15 microliter magnetische microbeads toe en meng grondig.Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Onder normale omstandigheden heeft de volwassen mens ongeveer vier tot 10.000 witte bloedcellen per microliter bloed. Dus de kosten van totale witte bloedcellen in vijf milliliter menselijk perifeer bloed, bijna minder dan 50 miljoen.En 50 microliter magnetische kralen in 15 microliter magnetische sorteerbuffer is genoeg. Het normale percentage neutrofielen is 50 tot 70% van de totale witte bloedcellen. Dus ongeveer 10 miljoen neutrofielen kunnen worden verkregen uit vijf milliliter bloed.Was de cellen door twee milliliter magnetische sorteerbuffer, per 10 miljoen cellen aan de buis toe te voegen, en centrifugeer gedurende 10 minuten op vier graden Celsius, 1200 RPM. Monteer de magnetische kolom en de scheidingsplank. Gooi het supernatant volledig weg en resuspendeer de sedimenten met 500 microliter magnetische sorteerbuffer voor maximaal 100 miljoen cellen.Spoel de kolom af met een magnetische sorteerbuffer van drie milliliter. Breng de celsuspensie aan op de kolom zodat de neutrofielen die door de magnetische kralen zijn gelabeld, aan de kolom kunnen worden bevestigd. Spoel de niet-specifieke specifieke cellen af door drie keer drie milliliter buffer toe te voegen, zodra het kolomreservoir elke keer leeg is.Verwijder de kolom van de magneetscheider en plaats deze in een nieuwe buis. Voeg vijf milliliter magnetische sorteerbuffer toe aan de kolom. Duw de cellen met een magnetisch label naar buiten met behulp van een zuiger.Centrifugeer de buis bij 1,200 RPM gedurende vijf minuten. Aspireer het supernatant volledig en resuspendeer het sediment met één milliliter kweekmedium. Bepaal het celnummer met een teller.De celconcentratie is aangepast tot 2 miljoen per milliliter in het kweekmedium dat de fluorescentiesonde DHE bevat. Plaats de neutrofielen gedurende 30 minuten in de incubator om de DHE-sonde te laden. Wijs de celophanging toe aan een 96-put zwarte microplaat met 200 microliter per put.Schakel de microplaatlezer in. Stel de temperatuur in op 37 Graden Celsius, kies fluorescentie leesmodus, kinetisch leestype, stel de fluorescentiegolflengte in. Kies het plaatformaat.Bepaal het leesgebied. Meet de fluorescentie-intensiteit elke vijf minuten gedurende een uur. Schud de plaat drie seconden voor elke meting.Haal de microplaat uit de incubator. Voeg PMA- of E44-stammen toe met drie herhalingen. Plaats de plaat in de microplaatlezer, druk op de startknop om de test onmiddellijk te starten.Met behulp van het protocoloverzicht in dit artikel werden de neutrofielen geïsoleerd uit het menselijke perifere bloed en geladen met fluorescentiesonde DHE. Door toevoeging van PMA vertoonde intracellulair ROS bij neutrofielen een significante toename van 20 tot 40 minuten en bereikte het een piek na 60 minuten. Maar ik denk dat E44-stammen, de ROS-productie onmiddellijk plaatsvindt en de tijd afhankelijk verhoogt.De expressie van ROS veroorzaakt door E44-stam is vergelijkbaar met die veroorzaakt door PMA. De detectie van ROS-productie bij neutrofielen kan bijdragen aan de verdere studie van de bacteriocidale mechanismen van neutrofielen. In dit protocol bieden we een eenvoudigere manier om de ROS-productie bij neutrofielen in realtime te detecteren.De eenvoudige methode kan ook worden gebruikt om de ROS-productie in andere hosts-celtypen te monitoren tijdens interacties tussen gastheer en bacterie.

real-time-quantification-reactive-oxygen-species-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Neisseria meningitidis (Nm), een gram negatieve mens-specifieke respiratoire pathogeen, kan binden aan menselijke α-actinine. Hier presenteren wij een protocol voor de visualisatie van colocalisation van de bacterie met de intracellulaire α-actinine na bacteriële binnenkomst in menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen (HBMECs).

Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging

In this video, we demonstrate an in vitro chemiluminescence assay to detect the generation of reactive oxygen species by neutrophils upon exposure to an opsonized bacterial biofilm.

Determination of ROS Production by Neutrophils upon Interaction with Opsonized Biofilm

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor...

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Infectie van neonatale muizen met bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulteert in een septische infectie met significante longontsteking en longpathologie. Hier beschrijven we procedures om neonatale sepsis te modelleren en verder te bestuderen met behulp van longitudinale intravitale beeldvorming parallel met de opsomsoming van systemische bacteriële lasten, ontstekingsprofilering en longsentopathologie.

Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis

Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.

Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

Dit protocol beschrijft de studie van neutrofiel-biofilm interacties. Staphylococcus aureus biofilms worden in vitro vastgesteld en geïncubeerd met perifere bloed-afgeleide menselijke neutrofielen. De oxidatieve burst-respons van neutrofielen wordt gekwantificeerd en de neutrofiellokalisatie in de biofilm wordt bepaald door microscopie.

Gestandaardiseerde in vitro assays om interacties tussen menselijke neutrofielen en staphylococcus aureus biofilms te visualiseren en te kwantificeren

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Leer hoe je reactieve zuurstofsoorten kwantificeert in neutrofielen besmet met meningitische Escherichia coli. Deze methode met fluorescentieprobes en real-time microplaatlezing helpt onderzoekers bij het bestuderen van bactericide mechanismen.

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Meer video's verkennen