Intranasale immunisatie en melkverzameling in studies naar maternale immunisatie bij Nieuw-Zeelandse witte konijnen (Oryctolagus cuniculus)

Studies naar maternale immunisatie en antilichaamoverdracht zijn om tal van redenen van onschatbare waarde, omdat dit de eerste route is van immuniteitsoverdracht en daaropvolgende bescherming tegen pathogenen en ziekten bij pasgeborenen en zuigelingen. Vanwege overeenkomsten in placentatie en antilichaamoverdracht met mensen, zijn konijnen een uitstekend model van maternale immunisatie. In dit videoartikel demonstreren we technieken die ons lab heeft gebruikt in studies naar maternale immunisatie bij Nieuw-Zeelandse witte konijnen, waaronder intranasale immunisatie en melkverzameling.

We zullen eerst een voorbeeldtijdlijn en reeks gebeurtenissen beschrijven voor een mucosale maternale immunisatiestudie bij Nieuw-Zeelandse witte konijnen. Vrouwelijke konijnen worden geïmmuniseerd via de intranasale route, zoals aangetoond in deze video. Afhankelijk van het onderzoek kan het vaccin een boost nodig hebben of via een extra route moeten worden toegediend, zoals intramusculaire immunisatie.

Hoewel niet afgebeeld, moet bloed worden verzameld voorafgaand aan de initiële immunisatie voor nulmetingen en gedurende de rest van het onderzoek met regelmatige tussenpozen. Bloed wordt gemakkelijk verkregen door de centrale oorslagader met milde sedatie en een topisch pijnstillend middel. De aanwezigheid van antigeenspecifieke IgG-niveaus kan in deze monsters worden gemeten.

Konijnen worden dan gefokt. We geven er de voorkeur aan om bewezen fokkers van verkopers te kopen om te gebruiken om een hoger zwangerschapspercentage voor deze studies te garanderen. Afhankelijk van de immunisatietijdlijn kunnen konijnen tijdens de zwangerschap extra immunisaties krijgen.

Antigeen-specifieke IgG wordt transplacentally overgebracht naar de kits. Bij ongeveer 30 tot 32 dagen na het fokken zal zwanger doen aanmaak. We raden aan om de behandeling van de kits de eerste dagen te beperken om afwijzing van de does te minimaliseren.

Bloedmonsters kunnen worden verzameld uit de kits om antigeenspecifieke IgG-niveaus te beoordelen die transplacentaal zijn overgedragen. Bloed kan worden verzameld uit een klein aantal kits op of in de buurt van het moment van geboorte om vroege antigeenspecifieke antilichaamniveaus te beoordelen. Naast een breed scala aan voedingsstoffen, krijgen kits antigeenspecifieke IgA van de lacterende doe tijdens het verplegen.

Kits worden meestal gespeend op de leeftijd van vier tot acht weken. Voorafgaand aan het spenen kan melk gemakkelijk worden verzameld uit lactaat, zoals aangetoond in deze video. De verzamelde melkmonsters worden vervolgens verwerkt voor de detectie van antigeenspecifieke IgA.

Afhankelijk van de studie kunnen vaccins en een boost aan de kits worden toegediend en kunnen seriële bloedmonsters op zeer jonge leeftijd uit de kits worden verzameld met behulp van de laterale sapheneuze ader. We zullen nu intranasale immunisatie en melkverzameling demonstreren in Nieuw-Zeeland White Rabbits.Protocol. Alle procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de Duke University Institutional Animal Care And Use Committee.

Intranasale immunisatie. Benodigde materialen: Acepromazine, spuit en naald, oftalmisch smeermiddel, Isofluraan, neuskegel, pipet en pipettips, mucosaal vaccin. Bereid de immunisatieoplossing voor op de behandeling van dieren.

Konijnen worden intramusculair verdoofd met Acepromazine één milligram per kilogram en verdoofd met Isofluraan met behulp van een neuskegel. Eenmaal volledig verdoofd zoals beoordeeld door ooglidreflex, wordt een oftalmisch smeermiddel aan elk oog toegevoegd om uitdroging van de ogen en daaropvolgende hoornvlieszweren te voorkomen. Zodra het laboratoriumlid klaar is om het vaccin toe te dienen en het konijn zich in een adequaat anesthesievlak bevindt, schakelt u de isofluraan en zuurstof uit en verwijdert u de neuskegel.

Plaats het konijn in dorsale ligfiets en prop de nek en het hoofd onder een hoek van ongeveer 45 graden, waardoor beide alars gemakkelijk toegankelijk en visualisatie kunnen zijn door het laboratoriumlid dat het vaccin toedient. Laad de pipet met niet meer dan 100 microliter van de vaccinoplossing en dien de oplossing snel toe aan één neusgat en herhaal de procedure voor het tweede neusgat. De pipet moet in een hoek van ongeveer 45 graden worden gehouden.

Hoek naar het mediale aspect van de neuspassage. Het doel van immunisatie is dat de oplossing in contact komt met de slijmvliezen van de nares. De punt mag dus niet in de nares worden geplaatst, omdat dit kan leiden tot slijtage of irritatie van de slijmvage delen en mogelijk de immunogeniciteit van het nasaal toegediende vaccin kan beïnvloeden.

Het vaccin moet snel worden toegediend en op dezelfde manier in het andere neusgat worden toegediend. Na toediening in beide neuspassages wordt het konijn gedurende 30 seconden in dorsale liggedrag gehouden om lekkage van de vaccinoplossing te minimaliseren. Het lab zal meestal niet meer dan 100 microliter per neusgat tegelijk toedienen.

Als een groter volume moet worden toegediend met een maximaal totaal volume van 500 microliter, kan het vaccin worden toegediend in 100 microliter aliquots met een rustperiode van 30 seconden tussen immunisaties. En extra toedieningen van vaccin herhaald met 30 seconden rust tussen elke toediening totdat het totale vaccinvolume is geleverd. Plaats het konijn na immunisatie op het ventrum voor herstel en houd het dier nauwlettend in de gaten totdat het in staat is om sternale ligfiets te behouden.

In sommige gevallen kan de vaccinformulering niet volledig in de neusholte worden afgeleverd en kan een deel van de vaccinformulering op het buitenste deel van de nares achterblijven. In dit geval, omdat het niet duidelijk is over het exacte volume van het vaccin dat correct in de neusholte is afgeleverd, raadt u niet aan om extra vaccinmateriaal opnieuw toe te voegen, omdat dit een ongedefinieerde variabele aan het experiment zou toevoegen. Het is belangrijk om een vaccinafgiftetechniek te gebruiken die volledige en consistente levering van de vaccinformulering aan de nares biedt.

Melkinzameling. Benodigde materialen: Acepromazine, spuiten en naalden, alcoholdoekje, gaas, oftalmisch smeermiddel, Isofluraan, neuskegel, oxytocine en een verzamelflacon. Konijnen worden intramusculair verdoofd met Acepromazine één milligram per kilogram en verdoofd met Isofluraan met behulp van een neuskegel.

Eenmaal volledig verdoofd zoals beoordeeld door ooglidreflex, wordt een oftalmisch smeermiddel op elk oog aangebracht om uitdroging van de ogen en daaropvolgende hoornvlieszweren te voorkomen. Reinig de huid over de marginale oorader met het alcoholdoekje. Met behulp van een spuit van één mil en een naald van 25 gauge, ongeveer één tot twee internationale eenheden oxytocine intraveneus toedienen door de marginale oorader om melk te induceren die in de steek wordt gelaten.

Vanwege de soepele spierontspanning is het gebruikelijk dat het konijn plast of poept na toediening van oxytocine. Oefen na toediening van oxytocine druk uit op de injectieplaats met een stuk gaas om hemostase te veroorzaken. Terwijl u het anesthesiemasker of de neuskegel over de neus van het konijn houdt, propt u het konijn op zijn achtervertrekken.

Als kanttekening kan melkverzameling ook worden uitgevoerd met het dier in laterale ligligheid, maar het lab vindt dat het verzamelen gemakkelijker is wanneer het konijn op zijn romp wordt gepropt met een assistent die het konijn rechtop houdt met het anesthesiemasker. Open de steriele buis om zich voor te bereiden op het verzamelen van melk en zoek het borstweefsel en de bijbehorende spenen. Konijnen hebben meestal vier tot vijf paar borstklieren.

De spenen zijn meestal omgeven door natte vacht van recente verpleging en het borstweefsel is gemakkelijk voelbaar als het vol melk zit. Grijp naar het borstweefsel geassocieerd met de speen tussen duim en wijsvinger en oefen een zachte masseerdruk uit op het klierweefsel in de richting van de speen. Plaats de opvangbuis over de speen om de uitgedrukte melk op te halen.

Het kan soms enkele minuten duren voordat de oxytocine effectief is en de melkproductie lijkt te variëren tussen de borstklieren. Als de melkexpressie niet succesvol is, wacht dan enkele minuten of draai rond naar een extra borstklier. Melk van alle spenen kan in hetzelfde vileine worden verzameld.

Meestal kunnen enkele milliliter melk gemakkelijk worden verzameld bij een zogende doe. Nadat het gewenste volume melk is verzameld, schakelt u de Isofluraan en zuurstof uit en verwijdert u de neuskegel van het konijn en laat u het konijn herstellen terwijl het nauwlettend wordt gevolgd totdat het dier in staat is om sternale ligfiets te behouden. Representatieve resultaten.

Figuur één. Voor maternale studies is het nuttig om de zwangerschap zo vroeg mogelijk te bepalen om te bevestigen dat de doe niet opnieuw hoeft te worden gefokt. Opties voor zwangerschapsdetectie omvatten palpatie, echografie, röntgenfoto's, gewichtstoename en moleculaire technieken zoals metingen van insulinegroeifactoren en progesteron.

Adequate progesteronniveaus zijn nodig voor het behoud van zwangerschap bij konijnen. Daarom hebben verschillende studies ook progesteronniveaus bij zwangere konijnen beoordeeld en verhoogde niveaus aangetoond ten opzichte van niet-zwangere konijnen, met name tijdens organogenese rond het midden van de zwangerschap. Zoals getoond in figuur één, kunnen verhoogde progesteronniveaus worden gedetecteerd bij zwangere konijnen in vergelijking met niet-zwangere konijnen, zelfs nadat paringen door een bok voor iedereen werden bevestigd.

Serum progesteron niveaus werden gemeten met behulp van een geautomatiseerde chemiluminescente test. Figuur twee. Antigeenspecifieke IgG die transplacent werd overgedragen tijdens de zwangerschap kan door Elisa worden gemeten in het serum van de kits.

Bloed kan worden verzameld uit een klein aantal kits op of in de buurt van het moment van geboorte om vroege antigeenspecifieke antilichaamniveaus te beoordelen. Seriële bloedafname is technisch veel gemakkelijker naarmate de kits ouder worden en in omvang toenemen. Zoals afgebeeld in figuur twee, kunnen serumspiegels van antigeenspecifieke IgG in de kits worden gemeten en vergeleken met de maternale niveaus.

Maternale overgedragen IgG-niveaus zijn hoger bij de geboorte en nemen in de loop van de tijd af. Figuur drie. Konijnenmelk kan worden verzameld zoals getoond in deze video en worden verwerkt om de totale en antigeenspecifieke antilichaamniveaus door Elisa te meten.

Zoals in deze figuur wordt getoond, vormt IgA een aanzienlijk deel van de totale antilichamen in de moedermelk die beschikbaar zijn voor passieve overdracht naar de kits. Zowel IgA- als IgG-niveaus zijn aanzienlijk hoger dan IgM.Summary. Dit videoartikel beschrijft en demonstreert de toediening van intranasale vaccins en het verzamelen van melk van zogende konijnen als een middel om mucosale immuniteit te beoordelen in een translationeel geschikt model van maternale immunisatie.

Afgebeeld is een samenvattende afbeelding voor een typisch ontwerp van een intranasale immunisatiestudie bij de moeder waarin de immunisaties, fokken, aanmaak, lactatie en antilichaamoverdracht zijn opgenomen.