Een microfluïdische benadering voor het functioneel onderzoek van signaaloscillaties die somitogenese beheersen

Signaalwegen die meercellige systemen aansturen zijn dynamisch. Om de functie van deze dynamica te begrijpen, is het essentieel om deze dynamiek subtiel te kunnen moduleren zonder de algehele signaalactiviteit te beïnvloeden. Dit protocol maakt gebruik van een microfluïdisch systeem dat functionele dissectie van signaaloscillaties mogelijk maakt bij het ontwikkelen van muizenembryo's.

Signaaldynamiek is gevonden in veel weefsels, waaronder volwassen weefsels. Microfluïdica is een veelzijdig hulpmiddel dat kan worden aangepast aan vele modelsystemen, waaronder cel-, weefsel- en organoïdeculturen. Bereid om te beginnen de vereiste hoeveelheid PDMS voor door het monomeer met de katalysator in een negen-op-één-verhouding te mengen om polymerisatie te induceren.

Gebruik wegwerpgereedschap en zorg ervoor dat het mengen goed wordt bereikt. Plaats het PDMS-mengsel in een exsiccator en breng ongeveer 30 minuten vacuüm aan om lucht te verwijderen. Giet een PDMS-laag van ongeveer drie tot vijf millimeter in de spaanvorm en plaats deze ongeveer 30 minuten terug in de exsiccator.

Hard de vorm uit door hem een nacht in een oven te plaatsen bij 65 graden Celsius of lager, afhankelijk van het vormmateriaal. Snijd de chip uit de mal met behulp van een scalpel. Pons inlaat- en uitlaatgaten met een biopsiepons van één millimeter vanaf de binnenkant van de microfluïdische kamer.

Reinig de glasplaat met perslucht. Om de chip aan de glasplaat te bevestigen, plaatst u de chip en glasschuif in de plasmaoven met de te verlijmen zijkanten naar boven gericht. Genereer plasma met behulp van het protocol dat specifiek is voor de gebruikte machine en bind vervolgens de chip aan het glas door de geactiveerde oppervlakken op elkaar te plaatsen en gelijkmatig druk uit te oefenen.

Om de slang en chip voor het experiment voor te bereiden, snijdt u de slang in een hoek van 45 graden en bevestigt u één naald aan elk van de buizen. Plaats de slang met naalden, de chip en de pluggen in een schaal en steriliseer ze door ze ongeveer 15 minuten bloot te stellen aan ultraviolet licht. Om de chip te coaten met fibronectine, plaatst u de chip in een bekerglas met PBS plus 1% penicilline of streptomycine bij kamertemperatuur.

Spoel de chip met PBS om lucht te verwijderen met een P200 pipet. Laad een spuit van drie milliliter voor elke kamer van de chip. Bevestig de naald aan de spuit die fibronectine bevat en sluit de spuit aan op de spuitpomp.

Spoel slangen handmatig om lucht te verwijderen. Bevestig de uitlaatslang aan de uitlaat van de chip. Zorg ervoor dat u de slang helemaal naar de bodem duwt en een laag debiet instelt om de chip te coaten.

Laat de spuitpomp minstens twee uur of een nacht draaien. Als u klaar bent, stopt u de pomp en snijdt u de slang direct na de naald af. Bereid spuiten gevuld met het medium voor het experiment en ontgas zowel het kweekmedium als de chip in PBS.

Probeer de meeste luchtbellen uit de chip weg te spoelen of op te zuigen, installeer vervolgens spuiten in de pompen en bevestig inlaatslangen aan de spuiten. Om weefsel op de chip te laden, ontleedt u de meest achterste punt van de staart. Spoel de chip met kweekmedium met 25 micromolaire HEPES om de PBS te verwijderen.

Laad het weefsel in de chip met behulp van een P200 pipet. Sluit na elke stap voor het laden van weefsel de overeenkomstige weefselbelastingsinlaat met behulp van een stuk pdms-gevulde buis. Om de microfluïdische opstelling te monteren, bevestigt u slangen aan de microfluïdische chip zonder luchtbellen binnen te krijgen.

Zorg er hiervoor voor dat er een druppel medium aanwezig is aan het einde van de slang. Zodra alle slangen aan de chip zijn bevestigd, haalt u deze uit het bekerglas en plaatst u deze in een schaal met een nat weefsel. Zet de schaal en ongeveer 1,5 meter inlaatslang in een couveuse voor nachtkweek.

Zorg voor een hoge luchtvochtigheid om de vorming van luchtbellen tijdens het kweken te voorkomen. U kunt ook de buitenkant van de chip drogen en in een microscoophouder plaatsen, vervolgens de houder en ongeveer 1,5 meter inlaatbuis in de incubatiekamer van een omgekeerde microscoop plaatsen voor een live beeldvormingsexperiment. Na ten minste 20 minuten constant debiet, start u het geplande pompen voor het experiment.

Om inkepingssignalering mee te nemen in het segmenterende muizenembryo, gebruikt u een pompprogramma van 100 minuten medium en 30 minuten medicijnpulsen herhaald tot het einde van het experiment, meestal gedurende 24 uur. Voor real-time beeldvorming, start de beeldvorming na ten minste 30 minuten. Om het meevoeren van signaaloscillaties te bevestigen, worden meerdere experimenten uitgelijnd met behulp van de timing van de medicijnpulsen en gevisualiseerd met de Cascade Blue-kleurstof.

Gekwantificeerde oscillaties kunnen worden gedetrendeerd en weergegeven als gemiddelde en standaarddeviatie of fasen van de oscillaties kunnen worden berekend. De faserelatie tussen oscillaties van onafhankelijke posterieure embryoculturen naar elkaar en naar de externe medicijnpulsen kan worden geanalyseerd. Om de entrainment te bevestigen, kan men bijvoorbeeld de periode van de endogene signaaloscillaties bepalen met behulp van het op Python gebaseerde programma pyBOAT.

Bij het toepassen van pulsen met een periode van 130 minuten laten notch signaleringsoscillaties ook een periode van 130 minuten zien. Het is van cruciaal belang om de verdamping van vloeistof tijdens het microfluïdische experiment te voorkomen. Anders zullen zich luchtbellen in de chip vormen die de mediumstroom verstoren.

Om dit te voorkomen, ontgas het medium en de chip en zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in de incubator hoog genoeg is. Met behulp van deze methode kan de signaaldynamiek worden gemoduleerd en kunnen hun effecten worden geanalyseerd door real-time beeldvorming van fluorescerende reporters, immunostainings of in situ hybridisatie. Bovendien kan het weefsel ook uit de chip worden gehaald voor verdere analyse.

Men kan deze methode gebruiken om de functie van signaalschommelingen in de embryonale ontwikkeling te bestuderen. Het werd toegepast om het belang aan te tonen van de faseverschuiving tussen twee oscillerende signaalroutes voor de segmentatie van het muizenembryo. Meer in het algemeen kan het nu worden gebruikt om het mechanisme van dynamische signaleringscodering in meercellige systemen te ontleden.