Name: Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Leer glycosaminoglycanen detecteren en analyseren met polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring. Deze gevoelige methode maakt nauwkeurige groottebepaling van sulfated GAGs uit biologische monsters mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL en EPS)

Alle biologische monsters die in dit protocol werden geanalyseerd, werden verkregen van muizen, volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparansulfaat isolatie
<ol><li>Delipidatie van weefselmonsters OPMERKING: Delipidatie is een optionele stap voor vetrijke weefsels.<ol>
<li>Maak een 1:1 mengsel van methanol en dichloormethaan. Bereid ongeveer 500 μL per monster; grotere stukken weefsel kunnen tot 1 ml nodig hebben.</li>
		<li>Plaats elk weefselmonster in een kleine glazen container met een deksel voor delipidatie. OPMERKING: De massa van het monster kan variëren per weefsel van belang en experimentele behoeften. 50 mg of minder is meestal voldoende voor een adequate GAG-opbrengst, maar enige optimalisatie kan nodig zijn voor de eindgebruiker.</li>
		<li>Voeg 500 μL van de methanol:dichloormethaanoplossing toe aan elke glazen container en meng. Zorg ervoor dat alle vaste weefselmonsters volledig zijn ondergedompeld in oplosmiddel. OPMERKING: Gebruik serologische pipetten of plastic conische buizen om de methanol/ dichloormethaanoplossing te mengen en te hanteren; andere kunststoffen kunnen oplossen.</li>
		<li>Plaats monsters op een shaker (in beveiligd rek) in een chemische zuurkast en roer voorzichtig gedurende 1 uur.</li>
		<li>Roer de monsters tot een mengsel en centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Pipetteer voorzichtig de organische oplosmiddelfractie (supernatant). Dit is de lipidenfractie - het bevat geen GAG's en kan worden weggegooid. OPMERKING: Probeer het weefsel niet te verstoren, omdat kleine stukjes verloren kunnen gaan. Het verdient de voorkeur om een deel van de organische laag in de monstercontainer te laten, in plaats van het verlies van het monster te riskeren.</li>
		<li>Laat het deksel van de glazen container open en laat het een nacht in de kap verdampen. Vervang de buis voor de volgende stap, omdat die buizen de verdere verwerking niet zullen overleven.</li>
		<li>Zodra het oplosmiddelmengsel volledig is verdampt, gaat u over tot mechanische desintegratie (als het resterende monster is >50 mg) of Actinase E-vertering (< 50 mg).</li>
	</ol></li>
	<li>Mechanische desintegratie van vast weefsel (optioneel; voor grotere weefselmonsters) OPMERKING: De meeste kleinere stukjes vast weefsel (ongeveer 50 mg of minder) moeten volledig oplossen tijdens de verteringsstap. Grotere monsters vereisen echter mechanische desintegratie.<ol>
<li>Flash-freeze monsters van belang door ze in een polypropyleenbuis van de juiste grootte te plaatsen en de gesloten buis in vloeibare stikstof te plaatsen. Laat het monster bevriezen tot het helemaal vast is.</li>
		<li>Maal met een schone vijzel en stamper bevroren monsters tot een poederachtige consistentie.</li>
		<li>Ga direct verder met Actinase E digestie (Stap 1.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Monster ontsalting en concentratie OPMERKING: Dit is een optionele stap en alleen vereist voor verdunde vloeibare weefselmonsters (bijv. Broncho-alveolaire lavagevloeistof (BALF) of plasma).<ol>
<li>Vloeibare monsters bundelen in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld per biologische replicatie of experimentele groep)</li>
		<li>Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO) van 3.000 Da.</li>
		<li>Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.</li>
		<li>Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen. Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.</li>
	</ol></li>
	<li>Actinase E spijsvertering OPMERKING: Deze stap is nodig om eiwitverontreinigingen uit uw monster te verteren en uiteindelijk te verwijderen.<ol>
<li>Meng monsters 1:1 met recombinant Actinase E tot een gewenste concentratie van 10 mg/ml. Voeg het juiste volume van 10x digestiebufferconcentraat toe. Gewenste eindconcentratie: 0,005 M calciumacetaat en 0,01 M natriumacetaat, pH 7,5. Bijvoorbeeld: 190 μL vloeibaar monster, 190 μL 20 mg/ml Actinase E, 20 μL 0,05 M calciumacetaat, 0,1 M natriumacetaat.</li>
		<li>Roer de monsters voorzichtig om te mengen en verteer vervolgens gedurende 48-72 uur bij 55 °C (tot 7 dagen voor het hele weefsel).</li>
		<li>Verwarm tot 80 °C gedurende 15-20 minuten om Actinase E te verwarmen.</li>
		<li>Vries het monster in bij -80 °C of ga verder met stap 1.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Monster ontsalting en concentratie OPMERKING: Als een lage massa van de GAG van belang wordt verwacht in het biologische monster, of als het behoud van verbruiksreagentia (d.w.z. centrifugaalfilterkolommen) wenselijk is, kunnen monsters worden samengevoegd om een enkel concentraat per experimentele groep te produceren (bijvoorbeeld door biologische replicatie of experimentele groep).<ol>
<li>Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.</li>
		<li>Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.</li>
		<li>Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen (meestal inbegrepen bij de centrifugaalfilterkolommen). Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.</li>
	</ol></li>
	<li>Desiccation<ol>
<li>Plaats de opgeloste monsters uit stap 1.5.5 's nachts in een roterende vacuümconcentrator of lyofiliseer de monsters zoals hieronder beschreven.</li>
		<li>Vries monsters grondig in, hetzij een nacht in -80 °C, hetzij door het onderdompelen in vloeibare stikstof.</li>
		<li>Doorprik monsterdeksels met een naald van 18 G en plaats ze in de lyofilisatorkamer. Voeg indien nodig papieren handdoeken toe om in te pakken.</li>
		<li>Bevestig de lyofilisatorkamer op de lyofilisator en vries deze 's nachts droog (ten minste -40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol></li>
	<li>Kationenuitwisselingskolom<ol>
<li>Resuspend gedroogde monsters in maximaal 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS-oplossing (of, bij bundeling van monsters, resuspend tot een maximum van (400/n) μL, waarbij n = het aantal monsters in de gewenste pool. Gebruik zo min mogelijk van de reinigingsoplossing.</li>
		<li>Kalibatie de kationenuitwisselingskolom (IEX) in evenwicht met 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS-oplossing. Draai gedurende 5 minuten bij 2.000 x g bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Laad 400 μL monsters/gepoolde monsters in de IEX-kolom. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g.</li>
		<li>Wassen 3x met 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS oplossing. Draai elke keer 5 minuten op 2.000 x g.</li>
		<li>Elute 3x met 400 μL van 0,2 M NaCl. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g elk. Dit is de fractie met lage affiniteit - deze kan indien gewenst worden behouden voor kwaliteitscontroledoeleinden.</li>
		<li>Elute 3x met 400 μL van 2,7 M (16%) NaCl. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g elk. Deze fractie bevat de geïsoleerde glycosaminoglycanen van belang - bewaar het allemaal!</li>
		<li>Voeg elke eluteerde fractie toe aan methanol tot 80 vol% en incubeer bij 4 °C gedurende de nacht. Draai elk monster gedurende 5 minuten op 2.000 x g. Herstel het vaste residu omdat dit gedroogde gezouten glycosaminoglycaan is. OPMERKING: U kunt deze stap ook overslaan en doorgaan naar stap 1.8 om het eluaat zonder methanol te ontzouten.</li>
	</ol></li>
	<li>Monster ontsalting en concentratie<ol>
<li>Indien nodig, groepeer eluteerde fracties (vanaf 1.7.6) in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld per biologische replicatie of experimentele groep).</li>
		<li>Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.</li>
		<li>Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.</li>
		<li>Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Weggooien stroomt door. Ga direct verder met stap 1.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Chondroïtine spijsvertering OPMERKING: Het doel van deze stap is om GAG's te verwijderen die niet interessant zijn voor de eindgebruiker. In dit geval wordt chondroitinase gebruikt om chondroïtine te verwijderen. In de weefsels die worden gebruikt voor het genereren van representatieve resultaten (broncho-alveolaire lavagevloeistof en hele longen), laat het verteren van chondroïtinesulfaat heparansulfaat achter als de primaire resterende GAG. Eindgebruikers moeten mogelijk extra verteringsstappen toevoegen, afhankelijk van hun experimentele doelen.<ol>
<li>Laad 350 μL vergistingsbuffer (50 mM ammoniumacetaat met 2 mM calciumchloride aangepast tot pH 7,0) op de centrifugaalfilterkolom zonder het membraan aan te raken.</li>
		<li>Voeg 5 μL recombinant chondroitinase ABC toe.</li>
		<li>Plaats de monsterbuis in een oven van 37 °C en incubeer gedurende 1 uur.</li>
		<li>Draai de kolom om en plaats deze in de juiste gelabelde opvangbuizen. Draai gedurende 1 min op 2000 x g.</li>
		<li>Verwarm monsters tot 80 °C gedurende 15-20 minuten om chondroitinase ABC te inactiveren.</li>
	</ol></li>
	<li>Monster ontsalting en concentratie<ol>
<li>Indien nodig, bundel chondroïtine verteerde monsters uit stap 1.9.5 in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld door biologische replicatie of experimentele groep)</li>
		<li>Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.</li>
		<li>Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal indien nodig indien gewenst het monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.</li>
		<li>Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen. Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.</li>
	</ol></li>
	<li>Desiccation OPMERKING: In deze stap is uitdroging nodig, zodat monsters kunnen worden geresuspendeerd in een zo klein mogelijke hoeveelheid water en lopende buffer.<ol>
<li>Plaats de met chondroïtine verteerde monsters uit stap 1.10.5 's nachts rechtstreeks in een roterende vacuümconcentrator of lyofiliseer als volgt:</li>
		<li>Vries monsters grondig in, hetzij een nacht in -80 °C, hetzij door het onderdompelen in vloeibare stikstof.</li>
		<li>Doorprik monsterdeksels met een naald van 18 G en plaats ze in de lyofilisatorkamer. Voeg indien nodig papieren handdoeken toe om in te pakken.</li>
		<li>Bevestig de lyofilisatorkamer aan de lyofilisator en vries een nacht droog (ten minste 40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol></li>
</ol>2. Polyacrylamide gel elektroforese van geïsoleerde en gezuiverde glycosaminoglycanen
<ol><li>Bereid oplossingen die nodig zijn voor polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) van tevoren voor(tabel 1). OPMERKING: Selecteer het percentage acrylamide van de oplossende geloplossing, afhankelijk van de grootte van de glycosaminoglycanen die naar verwachting in het monster zullen zitten. 15% wordt aanbevolen voor het oplossen van grotere fragmenten (langer dan 30 disacharide subeenheden); 22% voor kleinere fragmenten (<20 disacharide subeenheden in lengte).</li>
	<li>Plaats de lege cassette in de PAGE-tank. Giet de oplossende gel als volgt: Meng in een buis van 15 ml 10 ml oplossende geloplossing, 60 μl 10% ammoniumpersulfaat (moet vers worden bereid) en 10 μl TEMED (voeg ALS LAATSTE TEMED toe). Keer de buis voorzichtig 2-3x om. Gebruik pipet om de bovenstaande 10 ml oplossing snel aan de cassette toe te voegen. Overlay met 2 ml gedeïoniseerd, gefilterd water en laat de oplossende gel gedurende 30 minuten polymeriseren. OPMERKING: Het volgende PAGE-protocol is geoptimaliseerd voor een verticaal PAGE-systeem met behulp van 13,3 x 8,7 cm (breedte x lengte) 1,0 mm dikke gietcassettes met een totaal volume van ongeveer 12 ml. Andere cassettesystemen kunnen worden gebruikt, maar vereisen mogelijk optimalisatie door de eindgebruiker.</li>
	<li>Nadat de oplossende gel volledig is gepolymeriseerd, gooit u het bedekte water weg en giet u de stapelgel als volgt: meng in een buis van 15 ml 3 ml van de stapelgeloplossing, 90 μl 10% ammoniumpersulfaat (moet vers worden bereid), 3 μl TEMED (voeg TEMED als laatste toe).</li>
	<li>Keer de buis voorzichtig 2-3x om. Gebruik een pipet om snel de stapelgeloplossing over de gestolde oplossende gel toe te voegen; vul cassette tot rand. Volledig insteekkam meegeleverd met de set-up. Laat de stapelgel 30 min polymeriseren.</li>
	<li>Zodra de gel is gepolymeriseerd, zorgt u ervoor dat de tapestrip van de bodem van de cassette wordt verwijderd en plaatst u de cassette terug in de PAGE-tankassemblage.</li>
	<li>Vul de bovenste en onderste kamers met respectievelijk de bovenste en onderste kamerbuffer.</li>
	<li>Los de gedroogde monsters uit stap 1.11.4 op in het minimaal noodzakelijke volume gedeoniseerd, gefilterd water (ten hoogste 50% van het volume van de putten in de PAGE-gel). Meng 1:1 met de buffer voor het laden van het monster. Laad de monsters en de HS oligosaccharide "ladders" (zie tabel 1) in de gel.</li>
	<li>Voer de gel 5 min voor op 100 V. Laat de gel vervolgens 20-25 minuten op 200 V lopen (voor een 15% polyacrylamide oplossende gel), 40-50 min (voor een 18% polyacrylamide oplossende gel), 90-100 min (voor 22% polyacrylamide oplossende gel). OPMERKING: Enige optimalisatie van de 200 V-looptijd kan nodig zijn. Fenolrood migreert voor heparine oligosacchariden die 2 polymeersubeenheden lang zijn (d.w.z. mate van polymerisatie 2 of dp2); broomfenolblauw migreert voor dp10-dp14. De beste resultaten worden verkregen wanneer de spanning zodanig wordt toegepast dat de fenolrode band bijna, maar niet helemaal, naar de bodem van de gel migreert. Pas de looptijd dienovereenkomstig aan.</li>
</ol>3. Zilverkleuring protocol
<ol><li>Bereid alle oplossingen die nodig zijn voor zilverkleuring van tevoren voor(tabel 2). OPMERKING: Raak de PAGE-gel niet direct aan totdat deze is gekleurd, ontwikkeld en in stopoplossing is geplaatst. Manipuleer in plaats daarvan de gel met schoon plastic of glazen gereedschap. Het direct hanteren van de gel zal resulteren in vingerafdrukvervormingen en andere zichtbare artefacten op de gel na kleuring.</li>
	<li>Zodra de run is voltooid, demonteert u de cassette en extraheert u de gel in een schone, middelgrote container gevuld met gedeïoniseerd, gefilterd water. OPMERKING: Om te voorkomen dat de gel direct wordt gehanteerd, gebruikt u pipetpunt of een ander plastic voorwerp om de gel voorzichtig van de cassette af te pellen terwijl deze in water wordt ondergedompeld. Gel kan kwetsbaar zijn - voorzichtig omgaan.<ol>
<li>Gooi het water weg. Kleur de gel in Alcian blauwe kleuringsoplossing gedurende 5 min.</li>
		<li>Gooi Alcian blauwe vlek weg. Snel spoelen/wassen 2-3x met gedeoniseerd, gefilterd water totdat het grootste deel van de Alcian blauwe kleuroplossing is verwijderd.</li>
		<li>Laat de vlekken een nacht in gedeoniseerd, gefilterd water op de rocker. Zorg ervoor dat er voldoende volume gedeoniseerd, gefilterd water is om ervoor te zorgen dat eventuele resterende vlek 's nachts volledig van de gel wordt gewassen.</li>
		<li>Wasgel in 50% methanol (40 min totaal, vervang de oplossing 2-3x).</li>
		<li>Was gel in gedeïoniseerd, gefilterd water gedurende 30 min. Gooi water weg en herhaal nog 3 keer voor een totaal van 2 uur, vervang het water elke keer.</li>
		<li>In een verse, schone container, beits de gel gedurende 30 minuten in zilvernitraatkleuringsoplossing.</li>
		<li>Snel spoelen/wassen 2-3x in gedeoniseerd, gefilterd water om de zilverkleuringsoplossing volledig te verwijderen.</li>
		<li>Was gedurende 30 minuten in gedeïoniseerd, gefilterd water. Gooi water weg en herhaal dit 2x gedurende een totaal van 90 minuten, waarbij u telkens het waterbad vervangt.</li>
		<li>Gooi water weg en voeg een ontwikkelingsoplossing toe.</li>
		<li>Zodra de ontwikkelingsoplossing is toegevoegd, observeer de gel zorgvuldig en let op het verschijnen van banden. Afhankelijk van de kwaliteit van de vlek en de massa van het geladen monster, kan de ontwikkeling enkele seconden tot enkele minuten duren.</li>
		<li>Zodra de gewenste banden zichtbaar zijn, gooit u de ontwikkelende oplossing onmiddellijk weg en wast u kort met stopoplossing.</li>
		<li>Gooi de was van de stopoplossing weg en vervang deze door een nieuwe stopoplossing. Laat 1 uur weken op een rocker of shaker.</li>
		<li>Was 's nachts in gedeioniseerd, gefilterd water (de gel kan echter onmiddellijk na het wassen van de stopoplossing in beeld worden gebracht).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS%3A+A+critical+role+for+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membrane%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li>
<li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+the+developing%2C+healthy%2C+and+injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li>
<li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratry+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li>
<li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li>
<li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li>
<li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li>
<li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li>
<li>Møller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li>
<li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels%3A+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li>
<li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels%3A+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li>
<li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+prostaglandin+E1+%28TLC+C-53%29+in+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+a+controlled%2C+randomized%2C+double-blind%2C+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li>
<li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li>
<li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li>
<li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025(2021).</li>
<li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

GAG's spelen een centrale rol in veel verschillende biologische processen. Een van de belangrijkste functies van gesulfateerd GAG's (zoals HS en CS) is om te interageren met en te binden aan liganden, die stroomafwaartse signaleringsfuncties kunnen veranderen. Een belangrijke determinant van GAG-bindingsaffiniteit aan verwante liganden is de lengte van de GAG-polymeerketen 8,9,14. Om deze reden is het belangrijk voor onderzoeker...

Glycosaminoglycanen (GAG's) zijn een diverse familie van lineaire polysacchariden die een alomtegenwoordig element zijn in levende organismen en bijdragen aan vele fundamentele fysiologische processen1. GAG's zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) kunnen op verschillende posities langs de polysaccharideketen worden gesulfateerd, waardoor geografische domeinen van negatieve lading worden overgedragen. Deze GAG's, wanneer ze worden vastgebonden aan celoppervlakeiwitten die bekend staan als proteoglycanen, projecteren in de extracellulaire ruimte en binden aan verwante liganden, waardoor de regulatie van zowel cis- (ligand gehecht aan dezelfde cel) als trans- (ligand gehecht aan naburige cel) signaleringsprocessen mogelijk is2. Bovendien vervullen GAG's ook kritieke rollen als structurele elementen in weefsels zoals het glomerulaire keldermembraan3,de vasculaire endotheelglyx4 en pulmonale epitheliale glycocalyx5, en in bindweefsels zoals kraakbeen6.
De lengte van GAG-polysaccharideketens varieert aanzienlijk afhankelijk van de biologische context en kan dynamisch worden verlengd, gesplitst en gewijzigd door een zeer complex enzymatisch regulerend systeem7. Belangrijk is dat de lengte van GAG-polymeerketens substantieel bijdraagt aan hun bindingsaffiniteit voor liganden en vervolgens aan hun biologische functie8,9. Om deze reden vereist de bepaling van de functie van een endogene GAG waardering van de grootte ervan. Helaas bestaan er, in tegenstelling tot eiwitten en nucleïnezuren, zeer weinig direct beschikbare technieken om GAG's te detecteren en te meten, wat historisch heeft geresulteerd in relatief beperkt onderzoek naar de biologische rollen van deze diverse polysaccharidefamilie.
Dit artikel beschrijft hoe GAG's uit de meeste biologische weefsels kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd en beschrijft ook hoe polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) kan worden gebruikt om de lengte van de geïsoleerde polymeren met een redelijke mate van specificiteit te evalueren. In tegenstelling tot andere, zeer complexe (en vaak op massaspectrometrie gebaseerde) glycomische benaderingen, kan deze methode worden gebruikt met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en -technieken. Deze praktische benadering kan daarom het vermogen van onderzoekers uitbreiden om de biologische rol van inheemse GAG's en hun interactie met contextueel belangrijke liganden te bepalen.

```html
<table><tbody><tr><td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td>Elke combinatie van benchtop microcentrifuge/rotor die 14000 xG kan is geschikt</td></tr><tr><td>Acrylamide (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP170-100</td><td>Electroforesekwaliteit</td></tr><tr><td>Actinase E</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>Proteasemix van S. griseus</td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC400460100</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A639-500</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide (liquid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>gecertificeerd ACS</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>elektroforesekwaliteit</td></tr><tr><td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10-451-217PKG</td><td>Elk waterde-ionisatie-/zuiveringssysteem is een acceptabel alternatief</td></tr><tr><td>Boric acid (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Bromphenol blue (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Calcium acetate (solid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18-609-432</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Calcium chloride (solid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC349610250</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28299</td><td></td></tr><tr><td>Chondroitinase ABC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3667</td><td></td></tr><tr><td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td><td>Bio-Rad</td><td>3459901</td><td>Elk 1.0mm dik PAGE-gietkastsysteem volstaat</td></tr><tr><td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td><td>Bio-Rad</td><td>1656019</td><td>elk vergelijkbaar verticaal gel PAGE-systeem zal werken)</td></tr><tr><td>Dichloromethane (liquid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC610931000</td><td>gecertificeerd ACS</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid (liquid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A35-500</td><td>Gecertificeerd ACS</td></tr><tr><td>Glycine (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>G48-500</td><td>Electroforesekwaliteit</td></tr><tr><td>Heparanase I/III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3917</td><td>Van Flavobacterium heparinum</td></tr><tr><td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td><td>galen scientific</td><td>HO10</td><td></td></tr><tr><td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td><td>Galen scientific</td><td>HO06</td><td></td></tr><tr><td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td><td>galen scientific</td><td>HO20</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (liquid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A466-250</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>7752020</td><td>Elke lyofilisaat die -40C en 0.135 Torr kan bereiken, zal werken; kan ook worden vervangen door een rotatievacuüm concentrator</td></tr><tr><td>Methanol (liquid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A412-500</td><td>Gecertificeerd ACS</td></tr><tr><td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td>Elk vergelijkbaar gelbeeldsysteem is een acceptabel alternatief</td></tr><tr><td>N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP171-25</td><td>Electroforesekwaliteit</td></tr><tr><td>Phenol red (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>P74-10</td><td>Vrije zuur</td></tr><tr><td>Q Mini H Ion Exchange Column</td><td>Vivapure</td><td>VS-IX01QH24</td><td>Ionenuitwisselingskolom moet een minimaal laadvolume van 0.4mL, werk-pH van 2-12 en selectiviteit voor ionische groepen met pKa van 11 hebben</td></tr><tr><td>Silver nitrate (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S181-25</td><td>gecertificeerd ACS</td></tr><tr><td>Sodium Acetate (solid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Sodium chloride (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S392-212</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>Electroforesekwaliteit</td></tr><tr><td>Tris base (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Moleculaire biologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecuulgewicht afsnijding</td><td>Amicon</td><td>UFC500324</td><td>Grotere volumefiltereenheden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de steekproefomvang.&nbsp;</td></tr><tr><td>Urea (solid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>Elke rotatievacuüm concentrator zal werken; kan worden vervangen door lyofilisaat</td></tr><tr><td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>569-0020</td><td>Alternatieve volumes en filtermaterialen acceptabel</td></tr></tbody></table>
```

detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) zijn alomtegenwoordig in levende organismen en spelen een cruciale rol in een verscheidenheid aan fundamentele biologische structuren en processen. Als polymeren bestaan GAG's als een polydisperse mengsel met polysaccharideketens die kunnen variëren van 4000 Da tot ruim 40.000 Da. Binnen deze ketens bestaan domeinen van sulfatie, die een patroon van negatieve lading verlenen dat interactie met positief geladen residuen van verwante eiwitliganden vergemakkelijkt. Gesulfateerde domeinen van GAG's moeten voldoende lang zijn om deze elektrostatische interacties mogelijk te maken. Om de functie van GAG's in biologische weefsels te begrijpen, moet de onderzoeker in staat zijn om de grootte van GAG's te isoleren, te zuiveren en te meten. Dit rapport beschrijft een praktische en veelzijdige polyacrylamide gel elektroforese-gebaseerde techniek die kan worden gebruikt om relatief kleine verschillen in grootte tussen GAG's geïsoleerd uit een verscheidenheid aan biologische weefseltypen op te lossen.

Alcian blauw wordt gebruikt om gesulfateerd GAGs 10te kleuren; dit signaal wordt versterkt door het gebruik van een volgende zilvervlek 11. Figuur 1 geeft een visuele demonstratie van het ontwikkelingsproces van zilverkleuring. Zoals aangetoond, wordt het Alcian blauwe signaal dat GAG's vertegenwoordigt, gescheiden door elektroforese, versterkt naarmate het zich ontwikkelende middel de polyacrylamide-gel binnendringt. Typisch, het ontwikkelings...

Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.

Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om de aanwezigheid te detecteren en de lengte van glycosaminoglycanen te meten, moleculen van steeds meer erkende betekenis voor veel biologische processen. Deze techniek is gemakkelijk aan te passen aan de meeste life science laboratoria. Vergelijkbare glycomische technieken vereisen vaak apparatuur en expertise die alleen te vinden zijn in glycochemische onderzoekslaboratoria.Deze techniek kan vooral nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de glycocalyx, een polysaccharidelaag die de endotheel- en epitheliale oppervlakken van het menselijk lichaam bekleedt. Begin met het plaatsen van een lege cassette in de PAGE-tank. Giet een oplossende gel door 10 milliliter oplossende geloplossing te mengen met 60 microliter vers bereid met 10% ammoniumperssulfaat in een buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens 10 microliter TEMED toe. Keer de buis twee tot drie keer voorzichtig om. Voeg snel 10 milliliter van de geactiveerde polyacrylamide-geloplossing toe aan de cassette met behulp van een pipet.Overlay met twee milliliter gedeioniseerd gefilterd water en laat de oplossende gel gedurende 30 minuten polymeriseren. Nadat de oplossende gel volledig is gepolymeriseerd, gooit u het bedekte water weg. Giet de stapelgel door drie milliliter stapelgeloplossing te mengen met 90 microliter vers bereid 10% ammoniumpersulfaat in een buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens drie microliter TEMED toe en keer de buis twee tot drie keer voorzichtig om. Gebruik een pipet om snel de stapelgeloplossing over de gestolde oplossende gel toe te voegen totdat de cassette tot de rand gevuld is. Plaats de kam die bij de lege polyacrylamide-gelcassette is meegeleverd volledig en laat de stapelgel gedurende 30 minuten polymeriseren.Zodra de gel is gepolymeriseerd, verwijdert u de tapestrip van de onderkant van de cassette en plaatst u de cassette terug in de PAGE-tankassemblage. Vul de bovenste en onderste kamers met de respectieve bufferoplossingen. Los gedroogde glycosaminoglycaanmonsters op in het minimaal noodzakelijke volume gedeïoniseerd gefilterd water en meng met monsterbelastingsbuffer in een één-op-één-verhouding.Laad de monsters en de HS oligosaccharide ladders in de gel. Laat de gel vijf minuten voorlopen op 100 volt en laat hem vervolgens 20 tot 100 minuten op 200 volt lopen, afhankelijk van het acrylamidepercentage van de oplossende geloplossing. Zodra de run is voltooid, demonteer je de cassette en haal je de gel voorzichtig uit in een grote schone container gevuld met gedeïoniseerd gefilterd water.Gooi vervolgens het water weg en kleur de gel gedurende vijf minuten in Alcian blue staining solution. Gooi de Alcian blauwe vlek weg en was snel twee tot drie keer met gedeioniseerd gefilterd water totdat het grootste deel van de Alcian blauwe kleuroplossing is verwijderd. Kleur de gel in zilvernitraatkleuringsoplossing in een verse schone container gedurende 30 minuten.Was vervolgens twee tot drie keer gedurende 30 minuten elk in gedeioniseerd gefilterd water om de zilverkleuringsoplossing volledig te verwijderen. Gooi het water weg en voeg de ontwikkelingsoplossing toe. Observeer de gel zorgvuldig voor het verschijnen van banden.Afhankelijk van de kwaliteit van de vlek en de massa van het geladen monster, kan de ontwikkeling enkele seconden tot enkele minuten duren. Zodra de gewenste banden zichtbaar zijn, gooit u de ontwikkelende oplossing onmiddellijk weg en wast u de gel kort met STOP-oplossing. De geïsoleerde en gezuiverde glycosaminoglycanen werden gevisualiseerd met behulp van Alcian blauwe en zilveren kleuringstechniek na dichtheidsafhankelijke resolutie door een polyacrylamidegelelektroforese.Zoals te zien is in deze figuur, waren heparansulfaat oligosacchariden van verschillende polymeerlengtes gemakkelijk detecteerbaar met behulp van deze op PAGE gebaseerde benadering. De detectiegrens van deze methode, zo laag als 0,5 microgram, laat zien dat de techniek zeer gevoelig is bij het detecteren van glycosaminoglycanen geïsoleerd en gezuiverd uit biologische monsters. Van de vier verschillende heparinesulfaat oligosacchariden die met deze methode werden gevisualiseerd, was ongefractioneerde heparine het minst gemakkelijk detecteerbaar.Vanwege de polydispersiteit van ongefractioneerde heparine is de dichtheid van elke individuele band uit dit monster lager dan de banden die worden geproduceerd door een gelijke massa gezuiverde heparine oligosacchariden. De efficiëntie van glycosaminoglycaanzuivering uit vloeibare biologische monsters werd beoordeeld met behulp van bronchoalveolaire lavagemonsters verzameld van muizen, die oorspronkelijk relatief lage concentraties glycosaminoglycanen bevatten. Bovendien werd het succes van deze techniek aangetoond met behulp van heparinesulfaat geïsoleerd uit hele longhomogenaat, wat een ruime hoeveelheid geïsoleerd heparinesulfaat opleverde, waarbij de kleinste fragmenten gelijk waren aan ongeveer 10 disacharide subeenheden in massa.Het is erg belangrijk om vers bereide reagentia te gebruiken en elk reagens dat in dit protocol wordt gebruikt te filteren. Het is van cruciaal belang om reagentia van de hoogste zuiverheid en kwaliteit te gebruiken om deze techniek met succes uit te voeren.

detection-glycosaminoglycans-polyacrylamide-gel-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

In this video, we demonstrate a silver staining method of polyacrylamide gels for the visualization of total protein by using fluorogenic probes.

Fluorescent Silver Staining: A Technique to Visualize Total Protein in Polyacrylamide Gels

In this video, we demonstrate a procedure for combined Alcian blue and silver staining of sulfated glycosaminoglycan oligosaccharide fragments. This combined staining technique significantly amplifies the bands of glycosaminoglycan polymers of different lengths in polyacrylamide gels.

Silver Staining of Sulfated Glycosaminoglycans: A Staining Method for Visualization of Sulfated Glycosaminoglycans in Polyacrylamide Gels

This video demonstrates the separation procedure of heparan sulfates isolated from mouse lung tissue using polyacrylamide gel electrophoresis.

Polyacrylamide Gel Electrophoresis: An Analytical Technique to Detect Heparan Sulfates of Varying Chain Lengths Isolated from Mouse Lung Tissue

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Om de diversiteit van O-gekoppelde glycanen grondig te onderzoeken, wordt een nieuwe procedure voor in-gel reducerende β-eliminatie, gecombineerd met permethylering en een snelle fase-verdelingsmethode, toegepast op de analyse van O-gekoppelde glycanen die direct vrijkomen uit glycoproteïnen opgelost door SDS-PAGE en bruikbaar voor verdere glycomics-analyse door massaspectrometrie.

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Dit artikel beschrijft een methode cardiovasculaire weefselmonsters voor MS analyse mogelijk maakt (1) de analyse van ECM eiwitsamenstelling, (2) het identificeren van glycosyleringsplaatsen, en (3) de samenstelling karakterisering van glycan vormen moeten worden bereid. Deze methodologie kan worden toegepast, met kleine modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefsels.

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

Sialic acid is een typische monosaccharide-eenheid gevonden in glycoconjugates. Het is betrokken bij een overvloed van moleculaire en cellulaire interacties. Hier presenteren we een methode als u wilt wijzigen van cel oppervlakte sialic zuur expressie metabole glycoengineering met N- acetylmannosamine derivaten.

Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Wij rapporteren hier een eenvoudige en goedkope silver kleuring protocol dat vereist slechts drie reagentia en 7 min van verwerking, en is geschikt voor snelle generatie voor kwalitatief hoogwaardige SSR data in de genetische analyse.

Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin een nieuwe TL kleuring techniek voor de detectie van de totale proteïne in polyacrylamide gels. Het protocol maakt gebruik van een zilveren ion-specifieke fluorescentie turn-on sonde, die Ag+detecteert-eiwitcomplexen, en elimineert bepaalde beperkingen van traditionele chromogenic zilveren vlekken.

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.

Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie

Leer glycosaminoglycanen detecteren en analyseren met polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring. Deze gevoelige methode maakt nauwkeurige groottebepaling van sulfated GAGs uit biologische monsters mogelijk.

Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Meer video's verkennen