Voorbereiding van sample support films in transmissie elektronenmicroscopie met behulp van een support floatation block

Hier presenteren we verbeterde protocollen om cryo-EM-monsters met ondersteuningsfilms te bereiden met behulp van een nieuw flotatieblok dat de behandeling van dergelijke delicate films vergemakkelijkt. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het monster wordt beschermd tegen de luchtwaterinterface waar schadelijke effecten zoals denaturatie kunnen optreden. Een van de hier gepresenteerde protocollen vermijdt elke vorm van dure behandeling om grafische hydrofiel te maken, waardoor de toegankelijkheid voor de hele EM-gemeenschap wordt vergroot.

Kleine flotatie-apparaten worden nog niet veel gebruikt door elektromicroscopie voor een goede voorbereiding. Deze visuele demonstraties kunnen dus een benchmark bieden voor het gebruik ervan. Was om te beginnen de TEM-roosters met dubbel gedestilleerd water en ethelacetaat gevolgd door plasmareiniging.

Voeg vervolgens 10 tot 12 microliter van het monster toe aan de bufferwisselput, het flotatieblok en 10 tot 12 microliter 2% urinoiracetaatoplossing in de aangrenzende niet-bufferwisselput voor negatieve kleuring. Het is essentieel om de juiste veiligheidsmaatregelen te nemen bij het werken met vlekken. Snijd voorzichtig twee kleine stukjes mica met voorgepositeerde koolstoffilm erop.

Zorg ervoor dat de micafragmenten breed genoeg zijn om in de put te passen en langer dan de putlengte, zodat het fragment op de put kan zitten terwijl de koolstof zweeft en er voldoende ruimte is om het fragment met het pincet te hanteren. Dompel de mica onder in de put met een hoek van ongeveer 45 graden totdat de mica op de helling van de put zit en de koolstoflaag wordt waargenomen aan het oppervlak van het vloeibare monster. Trek na het uitbroeden van de koolstof met het monster de mica-plaat zeer langzaam terug om de koolstoffilm terug te winnen en de resterende viscusmonsterretentie te minimaliseren.

Dep de mica voorzichtig door met een filterpapier op het onderste koolstofvrije oppervlak te tikken om de overtollige vloeistof te verwijderen en het micafragment onder te dompelen in de tegenoverliggende put met 2% urinoiracetaatoplossing om de koolstoflaag te vervangen door de negatieve vlek. Herstel de zwevende koolstoflaag met de heilige met koolstof bedekte kant van het gewassen en plasma gereinigde EM-rooster. Laat de roosters vervolgens aan de lucht drogen totdat ze op de TEM worden afgebeeld, bij voorkeur bedekkend om besmetting in de lucht te voorkomen.

Na het reinigen van de TEM-roosters zoals eerder aangetoond, bereidt u de grafeenoxide-suspensie vlak voor gebruik voor en vortext u grondig. Voeg vervolgens 10 tot 12 microliter grafeenoxidesuspensie toe aan de vier niet-bufferuitwisselingsputten. langs het flotatieblok.

Voeg 10 tot 12 microliter dubbel gedestilleerd water of ultrazuiver water toe aan de resterende vier bufferwisselputten van het blok. Laat vier roosters voorzichtig op de grafeenoxide-suspensie van elke put vallen en incubeer gedurende één minuut om ervoor te zorgen dat de heilige met koolstof bedekte kant in contact komt met de oplossing. Herstel na een minuut elk rooster zorgvuldig door het pincet in de pincittergroef van elke niet-bufferwisselput te schuiven.

Duw voorzichtig en kort de koperen niet-koolstof bedekte kant van elk rooster met het dubbel gedestilleerde water in de aangrenzende put totdat de druppel water zichtbaar is op het rooster. Houd vervolgens de waterdruppel van het rooster voorzichtig ondersteboven tegen een stuk filterpapier. Dek de roosters af en laat ze in het pincet drogen.

Plaats vier wasroosters bovenop een koperen grafische plaat afgezet op een glazen dia en bedek elk rooster met een druppel isopropanol om intiem contact tussen het monolaag grafeen en het raster mogelijk te maken. Na de volledige verdamping van het isopropanol drijft u de koper grafeenplaat met roosters op de ijzerchlorideoplossing in de glazen petrischaal. Dek vervolgens de schaal af om besmetting in de lucht te voorkomen en laat het een nacht op kamertemperatuur etsen.

Gebruik een lus met een diameter groter dan de TEM-rastergrootte om de roosters die op de grafeenmonolaag drijven eruit te vissen en breng ze voorzichtig over naar een glazen petrischaal met dubbel gedestilleerd water om te wassen. Was de roosters tweemaal in water en breng de roosters over in een petrischaal met monsterbuffer tot de monstervoorbereiding en het vriesnat. Voeg 10 tot 12 microliter van het monster toe aan een put van het flotatieblok.

Wanneer het monster klaar is in het blok, plukt u het met grafeen beklede rooster uit de bufferoplossing met behulp van een schoon pincet en plaatst u het op het oppervlak van het monster dat put bevat. Na een geschikte incubatietijd pakt u het rooster op met een schoon vriespincet en gaat u verder met dempen en verglazen. Negatief gekleurde roosters voorbereid met het ondersteuningsflotatieblok zijn meestal bedekt met amorfe koolstof over het hele rasteroppervlak.

Hoewel breuk van de koolstoffilm in sommige gevallen optreedt, is een groot aantal rastervierkanten ongerept en daarom toepasbaar voor negatieve kleuringsdoeleinden. Evenzo wordt routinematig een goede filmdekking bereikt over het hele raster met behulp van het grafeenoxideprotocol. Grafeenoxideroosters kunnen snel worden bereid uit grondstoffen en zijn zeer beschermend voor het monster.

Het bevochtig houden van het grafeen en het in situ brengen van het monster vlak voor het invriezen is voldoende om geschikte ijslagen voor cryo-EM te genereren. Dit protocol vereist geen apparatuur om het grafeen hydrofiel te maken en biedt een voordeel voor monsterherstel. Het ondersteuningsflotatieblok heeft twee naaldpoorten op de plaats van elke put die bufferuitbreiding in C2 mogelijk maken, wat erg handig is voor monsters die zijn afgeleid van glycerolgradiënten.

Het flotatieblok heeft het mogelijk gemaakt om methoden voor affiniteitszuivering op het net te verkennen door gebruik te maken van controleerbare bufferstroom van kleine volumes, evenals gefunctionaliseerde ondersteuningsfilms.