Gene Knock-in door CRISPR/Cas9 en celsortering in macrofaag- en T-cellijnen

Het doel van dit protocol is om crispr/cas9 gemedieerde knock-in experimenten in macrofaag- en T-cellijnen te vereenvoudigen, met behulp van fluorescerende verslaggevers en celsortering te beïnvloeden. ROSA26 Locus staat bekend als een genomische veilige havenplaats voor het inbrengen van transgenen. Het is gebruikelijk om eiwit van belang met of zonder aanval uit te drukken in de muizenwereld van 26 locus, of in de menselijke ortho log.

Deel 1: Ontwerp en de plasmideconstructie van sgRNA's gericht op Rosa26 Locus. Ontwerp eerst sgRNA's van muis Rosa26 locus, met behulp van sequenties van muisgenoominformatica, en Ensemble Genome Browser, en download vervolgens de genomische sequentie van het Rosa26-gen van de muis. Ga naar de online webtool CRISPOR, plak 100 basenpaar van de invoervolgorde van de Rosa26 Locus.

Selecteer vervolgens een genoom, bijvoorbeeld Mus musculus-muis referentiegenoom 2011. Selecteer vervolgens het type PAM. Gebruik 20bp NGG"PAM-motief, herkend door spCas9.

Klik op Verzenden. Kies een gids met een hoge specificiteitsscore, een hoge score en minder off-targets. Gidsen die als inefficiënt zijn aangegeven, moeten worden vermeden.

Met name heeft het de voorkeur om twee hulplijnen met overlappende sequenties te selecteren, wat de knock-in-efficiëntie zoals gerapporteerd kan verhogen. Voor warme dine-sequentie, synthetiseer een voorwaartse illegale en een omkering illegaal, die gegloeid gefosforeerd en klaar voor klonen om te factor. Bereid de lineaire afname per Vactor voor waarop zou kunnen uitdrukken dat ik door BBS één vertering moet rapporteren, zoals de Neal, de legalen naar de lineaire vector om het uiteindelijke construct te genereren, dat tegelijkertijd gids-RNA en de CAS-negen kern uitdrukt, gekoppeld aan een DSRIP twee fluorescerende reporter.

Deel twee: Constructie van targetingvector als homologe recombinatiesjabloon. Voor expressie van het eiwit van belang. De mens hield het bijvoorbeeld vol.

U wilt de cDNA-sequentie synthetiseren per commerciële bron en affiniteit OST-tag of andere veelgebruikte aanval voor zuivering van eiwitten kan worden samengevoegd met de cDNA-sequentie. Vergeet niet om de Kazachse consensussequentie op te nemen vóór de start van het cDNA. Verteerd door Asc1 restrictie-enzym, en zoals krijgen de CD en de insert in de ruggengraat.

Vactor, namelijk pKhR26-IBFP IBP die het uiteindelijke richtconcentraat van de container oplevert, elk, KB van vijf priem- en drie priem-homologe armen. De expressie cast set bevat een CG promotor, het UST restaurant, als je wilt Koonin regio gekoppeld aan een Iris, als VFD verslaggever en een poly AC fondsen. Ten slotte wordt aan de horizon gericht op vector met behulp van unieke snijderenzymen, zoals EcoR1 of BamH1, de digesten en het product gezuiverd in een winkel die min 20 graden op elektroporatietonen.

Het wordt aanbevolen om een hoge concentratie gelineariseerd vector-DNA te verkrijgen. Deel drie: Elektroporatie van macrofaag- en T-cellijnen bereiden celcultuur voor op scheiding voor geritalkcellen. De optimale celdichtheid was ongeveer 0,5 miljoen cellen per ML op het moment van transfectie.

Volledige elektroporatie in tien macro kleine nucleaire modetipformaten bereiden een 24-putplaat met 500 microliter volledige groei, medium zonder antibiotica in elke put. Verwarm de platen voor in bevochtigde 37 graden, 5% die die setting incubator bedekt. Zet de ingangselektroporatieparameters van het elektrische besturingssysteem voor jet cat of Rosales lager.

Bereid cel DNA-mengsel follow-ups of operatie verzamelen kippencellen. Curchin 25 vierkante centimeter kolf transfer cellen in de 15 dieren. Omdat je buis, dan Phillip de cellen door centrofugatie op 90 keer G gedurende acht minuten bij kamertemperatuur, vraag ernaar, de supernatanten.

Voor het wassen resuspendeert u de cellen met de vijf ML PBS en spint u de celsuspensie door centrifugeren onder dezelfde voorwaarde als de vorige stap. Verwijder de DPP's. En resuspend de celkussens met behulp van twee ML DBS.

Je blijft micro kleine cel suspensie en mengt met het gelijke volume van 0,2% Trepan Ballou om het celgetal te schatten in termen van telsleuf invoegen Connie dia in de geautomatiseerde cel Connor en bekijk het beeld zelf. Krijg vervolgens een celtellingsresultaat. Bereken 2 miljoen cellen zullen reputaties van elektroporatie vinden per klopexperiment breng het aantal cellen over in 1,5 ML.Centrifugeer twee pelletcellen door centrifugaalisatie.

Om tijd te besparen, kan tijdens de centrifugalisatie een elektroporatiemengsel worden bereid dat 2,5 microgram van elk CRISPR CAS negen vector 2,4 microgram Belinda-rijst, talkative vector en re suspension Buffalo toevoegt. Ons totale volume van 55 macrostrooisel in een nieuwe 1,5 ML gecentrifugeerde buis vertex zachtjes en. Even goed mengen.

Laat het Luxor drukmengsel en de kamertemperatuur voor gebruik staan. Na het draaien van aspart, de DTB is deze in wezen zekering voor een extra 30 seconden, verwijder zoveel mogelijk supernatant re suspensie cellen door het toevoegen van de bereide elektroporatie mengsel pipet op en neer zachtjes op en neer. Elektroporatie vroeg om de cel elektroporatie mixer met behulp van 10 micro kleine nucleaire factie tip was pipetten belangrijk.

Vermijd luchtbellen tijdens het piaaien, het kost galvaniseerfouten. Druk op start. waarna de bewerking het monster binnen een tijdje overdraagt.

Put van 24, putplaten met een pre-warn het bruto medium voeren dezelfde elektrische druk en procedures uit als hierboven op de resterende vier gerepliceerde monsters, schommelen de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen. Incubeer de cellen in een incubator van 37 graden gedurende 48 tot 72 uur. Voorafgaand aan de feiten, celsortering Op 24 uur na transfectie, onderzoek de expressie van verstoring twee voor restaurantverslaggever met behulp van fluorescerende microscopie los van de vertegenwoordiger voor ons zelf geeft aan dat de elektroporatie naar behoren werkt.

Deel 4: celsortering om vermeende knock-in cellen te isoleren. Voordat celsortering zich voorbereidt, in 96 putplaten met 150 micro weinig celtype specifiek bruto medium per put gebruik verkeerde bodem micro plaats voor cultuur en zichzelf en de platte bodem micro plaats voor alle cellen overbrengen cellen in een steriele FACS om de buis in ijs te houden en om de doos in het pad door venster te zetten, aansluiten op celsorteerkamer indien van toepassing set celsorteerder met 85 micro meter mondstuk en lage stroomsnelheid voor immuuncelsortering om optimale celbewasbaarheid en overleving te bereiken, neem monsters van de pass-through venstervertex kort en laad het monster in de acquisities. Champer zette fact skating op voor celsortering, definieerde eerst verkooptrechters voor Ford-scatter en side scatter en definieerde vervolgens de levenscellen door de set talks rode negatieve cellen te verkrijgen.

Vervolgens vinden ze een levende enkele cel door singlet gating met behulp van de FSC H versus FSE een multi-gevarieerd blok. Stel ten slotte een poort in voor de gewenste DSRs twee en B als de Volvo-positieve subpopulatie, wat aangeeft dat cellen met succes zijn getransfecteerd met CRISPR-vector en de pocketing vector. Dus 10 enkele cellen in elke put van de 96, putplaat aangevuld met de voorwarm, het volledige groeimedium met behulp van periodemodus of eencellige modus na sortering incuberen de 96, putplaten in de celkweekincubator voor celexpansie.

Deel vijf:screening van verhoging van positieve knock-in cellen Na ongeveer twee weken celexpansie voorbij de overleven, beoordelen de cellen in de 48-putplaat de expressie van BFP of flowcytometrie met behulp van een klein deel van proliferaat zichzelf met behulp van de wandtype cellen als een negatieve controlecelpopulaties, die een hoger percentage BFP-positieve cellen bezitten, worden bewaard om te voldoen aan het validatie-extract van het genomische DNA uit de cellen die we moeten uitdrukken BFP passeert het geïsoleerde genomische DNA door PCR met primers die elke kant van de homologe armen overspannen, namelijk één primaire lokallocatie in de genomische sequentie, buiten de targetingvector. De geziene kant van het praten met de vector in dit experiment, de voorspelde grootte van het PCR-product versterkt met de primaire is 1,2 KV. En met F twee en R twee is 1,2 KB Sanger sequencing resultaten. Pcr-producten tonen dus de sequenties van elk integratieknooppunt dat de juiste en kloppende positie in de Rosa 26 Lucas demonstreert.

Ik zeg dat immuno blotting de validatie van correct kloppen op eiwitniveau mogelijk maakt deel zes representatieve resultaten. Als voorbeeld, gepubliceerd in eerdere studie, hebben we uitgedrukt dat krijgen 45 moleculen tack dat de inter met een OSD-tag, en er was een 26 locus in checkout T-cellen vervolgens USD tact. Ik word 45 en incidentdirecteuren of naar beneden getrokken door affiniteitszuivering en een onderwerp van massaspectrometrie.

Ze proteomics gegevens onthulden interactie van T-cellen. Daarom heeft deze productpool de zoektocht naar nieuwe intercalators om de functie van een bepaald eiwit op te helderen aanzienlijk vergemakkelijkt. Deze technische presentatie toonde aan dat door transiënt uitgedrukte verhoogde per gegoten lijn RFP met de sprekende vector co-uitgedrukt en BFP voor Rosa 26 locus.

We genereerden kloppende cellijnen met permanente genexpressie in zowel T-cellen als macrofagen, die moeilijk uit te voeren zijn bij genetische manipulaties. Deze methoden en aanbevelingen zijn van toepassing op Chris toegestaan in beweringen van groot DNA-segment voor mechanistische studies van immuuncellen, zoals voor identificatie van eiwitten, eiwitinteractiestudie.