Circulerende tumorcellijnen: een innovatief hulpmiddel voor fundamenteel en translationeel onderzoek

Metastase is een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen. Dit fenomeen treedt op wanneer kankercellen zich losmaken van de primaire tumor, in de bloedcirculatie gaan om uiteindelijk een ver doelorgaan te bereiken. Zodra deze losgemaakte cellen in het bloed gaan, noemen we ze secundaire tumorcellen.

Ze vertegenwoordigen een variabel materiaal omdat ze aan de ene kant de belangrijkste boosdoener zijn van metastasevorming en aan de andere kant zijn ze gemakkelijker dan tumorbiopten. Inderdaad, ze kunnen worden verzameld door een eenvoudige bloedpunctie. Ondanks het lage aantal van deze cellen in het bloedmonster, zijn we de eersten die verschillende circulerende tumorcellijnen uit het bloed van de patiënt met grotere bezorgdheid vaststellen met behulp van de 3D-gecontroleerde aandoening.

Deze cellijn kan op elke commerciële cellijn worden gebruikt voor routine-experimenten. Bijvoorbeeld voor genetische geneesmiddelenscreening, voor eiwit van belang, maar ook voor in vivo experimenten om het tumorinitiatievermogen en hun metastatische potentieel te testen. CTC, circulerende tumorcellijnen, moet worden gekweekt in 3D-omstandigheden bij hypoxie.

Zodra CTC bollen heeft gevormd, kunnen we het in het medium plaatsen en het gedurende vijf minuten centrifugeren bij 300 RCF. Gooi het supernatant weg en voeg 500 microliter Accumax toe. We hangen er een op en incuberen de oplossing 20 minuten bij 37 graden.

Was vervolgens gedissocieerde bollen met PBS en pellet de cellen. Resuspend de pellet met een vers aangevuld DMEM/F12 en zie de cellen met de dichtheid van vijf cellen per microliter in een nieuwe 24 Low Attachment plaat. Centrifuge CTC-bolletjes elimineren het supernatant en wassen de pellet twee keer met PBS.

Meng bij 500 microliter PFE goed en incubeer de tube gedurende 20 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de vaste bollen en was de pellet twee keer met PBS, elimineer het maximale volume PBS en voeg 20 microliter gevormde HistoGel toe. Neem het in suspensie en maak een druppel op de kweekvaas, laat het 10 minuten drogen en maak het los met een scalpel.

U kunt nu voor elke gewenste proces om CTC's te richten op een gewenst eiwit van belang. Verzamel CTC's en dissocieer de bollen met Accumax zoals eerder beschreven. Elimineer de Accumax en resuspend de pellet met drie ml blokkerende buffer en breng de suspensie over door een celzeef van 14 micrometer om een eencellige oplossing te verkrijgen.

Tel de cellen en verzend in buizen en voeg een volume van 200.000 cellen toe, centrifugeer de buizen en gooi het supernatant weg. Voeg volgens het antilichaamgegevensblad in een buis het gewenste volume van het antilichaam en in een andere buis het isotype toe en vervolg de stappen volgens de richtlijnen van de fabrikant. De resterende buis wordt niet gelabeld en het gebruik van een levensvatbaarheidsmarkt wordt sterk aanbevolen in dit experiment.

Begin op de cytometer met de niet-gelabelde buis om de spanning in het negatief gelabelde gebied in te stellen. Plaats hierna de isotypebuis. Het isotype zou dienen als een negatieve controle om onderscheid te maken tussen het positieve signaal en het niet-specifieke signaal.

En voltooi het experiment met de gelabelde cellen met het antilichaam van belang waar je een verschuiving in de positief gelabelde poort zou moeten zien, als het eiwit van belang wordt uitgedrukt. Deze suspensie gedissocieerde CTC's in aangevuld medium met een dichtheid van 200.000 cellen per ml. In een Ultra Low attachment 96, putplaat, sluit het volume van 50 microliter af en incubeer de plaat 24 uur bij hypoxie.

Voeg de volgende dag 50 microliter van verschillende concentraties van het geteste medicijn toe en voeg hetzelfde volume DMEM / F12 toe om de basis van cellulaire levensvatbaarheid verder te bepalen en de plaat nog eens 48 uur te incuberen. Reconstitueer op dag drie het middel en voeg 70 microliter van het mengsel toe aan elke put. Leg de plaat gedurende 20 minuten op een orbitale shaker en meet vervolgens de luminescentie.

Deze test is een nuttig hulpmiddel om een groot aantal geneesmiddelen te testen om hun effecten op de celgroei van CTC te evalueren. In Eppendorf knijpen resuspend cellen in 100 microliter PBS in de huid op de achterkant van de muis en brengen de naald onder de huid in. Injecteer langzaam het hele volume op dezelfde plek en controleer de tumorgroei om de tweede dag en offerde de muizen op als de tumor een grootte van 1,5 kubieke centimeter overschreed.

Injecteer voorafgaand aan de operatie subcutaan een pijnstiller, aan de dorsale ventrale kant van de muis, doe een kleine incisie onder de 10e rib. Til de milt voorzichtig op en leg hem op een steriel gaasje. Injecteer met behulp van een insulinespuit 50 microliter geresuspendeerde CTC's in PBS en wacht drie minuten zonder de naald te verwijderen.

Ligate het arteriële vat van de ene kant en het venale vat van de andere kant. Verwijder vervolgens de milt door direct boven de twee ligaturen te snijden. Steek het buikvlies en de huid en desinfecteer het gebied goed.

Het doel van dit experiment is om de capaciteit van CTC's afgeleid van colorectale kankerpatiënt te testen om de lever te koloniseren door het induceren van, zichtbare gemetastaseerde vooruitziendheid. Het isoleren en vaststellen van de tumorcellijn van de kliniek is een opkomend hulpmiddel voor zowel fundamentele als translationele studies. Als u bijvoorbeeld een interessant gen hebt waarbij de in vivo studies hebben aangetoond dat dit gen betrokken is bij migratie en invasiecapaciteit van colorectale kankercellijnen, kan het uitschakelen van dit gen in circulerende tumorcellijnen voorafgaand aan de injectie in de milt van muizen, om ze de lever te laten koloniseren een goed hulpmiddel zijn om uw resultaat in vivo te bevestigen.

Voor translationele studies is ons belangrijkste perspectief van het isoleren van circulerende tumorcellijnen het gebruik van dit kostbare materiaal in gepersonaliseerde geneeskunde. Uit de bloedmonsters van de patiënt zouden we CTC's gedurende twee of drie weken in cultuur isoleren en versterken om voldoende materiaal te hebben om het panel van geneesmiddelen dat beschikbaar is te screenen en de cytotoxiciteit ervan te beoordelen om uiteindelijk toe te schrijven