Name: Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer hoe je met DRaCALA eiwitdoelen van kleine signaalmoleculen identificeert in Escherichia coli. Deze methode maakt snelle, gevoelige screening van eiwit-ligand interacties mogelijk voor bacteriële fysiologie onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk wordt ondersteund door een NNF-projectsubsidie (NNF19OC0058331) aan YEZ en het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst (Nº 801199) aan MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Bereiding van hele cellysaten
<ol><li>Ent de E. coli K-12 ASKA ORFeome collectie stammen15 in 1,5 ml Lysogeney bouillon (LB) met 25 μg/ml chlooramfenicol in 96-put diepe putplaten. Laat 's nachts (O/N) groeien gedurende 18 uur bij 30 °C met schudden bij 160 tpm. Voeg de volgende dag isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (laatste 0,5 mM) toe aan de O/N-culturen om gedurende 6 uur eiwitexpressie bij 30 °C te induceren.</li>
	<li>Pelletcellen bij 500 x g gedurende 10 min. Vries de pellets in bij -80 °C tot gebruik. Om de cellen te lyseren, voegt u 150 μL lysisbuffer L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, aangevuld met 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 40 μg/ml DNase 1 en 0,5 mg/ml lysozym) toe.</li>
	<li>Vries de cellen gedurende 30 minuten in bij -80 °C en ontdooi vervolgens bij 37 °C gedurende 20 minuten. Herhaal deze cyclus drie keer om de cellen te lyseren. Bewaar de lysaten voor gebruik bij -80 °C.</li>
</ol>2. Zuivering van Relseq en GppA
OPMERKING: De recombinante eiwitten Relseq van Streptococcus equisimilis en GppA van E. coli K-12 worden gebruikt om respectievelijk het radiolabel pppGpp en ppGpp te synthetiseren.
<ol><li>Groei en verzamel cellen die elk eiwit overexpresseren.<ol>
<li>Kweek de E. coli BL21 DE3 stam tot exponentiële fase (optische dichtheid (OD) ~0,3-0,4) in LB bouillon, en draai 1 ml cultuur naar beneden bij 6000 x g gedurende 5 min. Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen met 100 μL ijskoude TSB-bouillon (LB-bouillon aangevuld met 0,1 g/ml PEG3350, 0,05 ml/ml dimethylsulfoxide, 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Meng de plasmiden met de histidine-gelabelde relseq en gppA, elk 100 ng, met de bovenstaande celsuspensingen in TSB en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Schok de cellen bij 42 °C gedurende 40 s. Leg het mengsel gedurende 2 minuten op ijs en voeg 1 ml LB bouillon toe bij kamertemperatuur, zodat de cellen zich gedurende 1 uur bij 37 °C kunnen herstellen met agitatie bij 160 tpm.</li>
		<li>Plaat de teruggewonnen cellen op LB-agarplaten aangevuld met de bijbehorende antibiotica (Relseq: 100 μg/ml ampicilline; GppA: 30 μg/ml kanamycine). Inenteer de volgende dag de kolonies in LB bouillon om O/N preculturen van beide stammen bij 37 °C te starten.</li>
		<li>Na 18 uur 500 ml LB-medium enten met 10 ml O/N-culturen en de bijbehorende antibiotica. Kweek de culturen door te schudden bij 160 tpm bij 37 °C. Wanneer de OD600nm 0,5-0,7 bereikt, induceer dan eiwitexpressie door 0,5 mM IPTG toe te voegen en 3 uur te groeien bij 30 °C met schudden bij 160 tpm.</li>
		<li>Verzamel de cellen door 10 minuten bij 4 °C op 6084 x g te draaien. Resuspendeer de pellet in 20 ml ijskoude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifugeer opnieuw bij 1912 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Decanteer het supernatant en vries de pellets voor gebruik in bij -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nikkel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affiniteit zuivering OPMERKING: Controleer vanaf dit punt of de monsters koud zijn.<ol>
<li>Voeg 40 ml ijskoude lysisbuffer L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoethanol aangevuld met proteaseremmers (EDTA-vrije tablet; zie de materialentabel)toe om de pellet opnieuw te gebruiken. Lyse de cellen via sonicatie (60% amplitude, 2 s ON/ 4 s OFF gedurende 8 min ON). Ontruim het lysaat door 40 minuten bij 4 °C op 23.426 x g te draaien en ga verder met het supernatant voor de zuivering.</li>
		<li>Bereid tijdens de bovenstaande centrifugeren de Ni-NTA-hars voor.<ol>
<li>Breng 500 μL gehomogeniseerde Ni-NTA-hars over in een staande polypropyleenchromatografiekolom en laat het 15 minuten bezinken en de opslagoplossing wordt afgevoerd. Was de hars tweemaal met 15 ml ultrapure water en was vervolgens de kolom met 15 ml van de lysisbuffer L2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laad de gewiste supernatant van cellysaat vanaf stap 1 op de kolom en laat deze doorstromen. Was de kolom met 30 ml wasbuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 20 mM imidazol).</li>
		<li>Elute de eiwitten met 400 μL van de elutiebuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazol) driemaal. Herhaal vervolgens elutie met nog eens 300 μL van de elutiebuffer. Combineer de geëuteerde eiwitten tot een eindvolume van 700 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelfiltratie<ol>
<li>Bereid gelfiltratiebuffer voor (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glycerol). Was de kolom met uitsluiting van de grootte met één kolomvolume (25 ml) van de gelfiltratiebuffer.</li>
		<li>Laad het bovenstaande monster van 700 μL met behulp van een lus van 500 μL, loop op 0,5 ml/min en verzamel 2-3 fracties, elk met een volume van 0,5 ml, die de respectieve eiwitten bevatten.</li>
		<li>Combineer en concentreer de fracties die elk van de eiwitten bevatten met behulp van een spinkolom en meet de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Synthese van 32P-gelabelde pppGpp en ppGpp
<ol><li>Monteer een kleinschalige Relseq-reactie in een schroefdopbuis (zie tabel 1). OPMERKING: Werk alleen met radioactieve reagentia op een gelicentieerde plaats en met persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Volume (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Kleinschaligheid</td>
			<td>Grootschalige</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Relseq buffer*</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP (8 mM finale)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Relseq (4 μM finale)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>
32 P-α-Guanosinetrifosfaat (GTP) (laatste 120 nM) (LET OP)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>totaal</td>
			<td>20</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Samenstellen van informatie voor de kleinschalige en grootschalige synthesereacties van 32P-gelabeld pppGpp. *10x Relseq buffer bevat 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Afkorting: pppGpp = guanosine pentafosfaat.
<ol start="2"><li>Incubeer de buis op 37 °C in een thermomixer gedurende 1 uur, vervolgens bij 95 °C gedurende 5 minuten en leg deze gedurende 5 minuten op ijs. Draai het neergeslagen eiwit gedurende 5 minuten op 15.700 x g en breng het supernatant (gesynthetiseerd 32P-pppGpp) over naar een nieuwe schroefdopbuis.</li>
	<li>Om 32P-ppGpp van 32P-pppGpp te synthetiseren, breng je de helft van het 32p-pppGpp-product over naar een nieuwe schroefdopbuis en voeg je 1 μM GppA toe. Incubeer de buis gedurende 10 minuten op 37 °C, gedurende 5 minuten op 95 °C en leg deze vervolgens 5 minuten op ijs.</li>
	<li>Draai het neergeslagen eiwit gedurende 5 minuten op 15.700 x g en breng het supernatant (gesynthetiseerd 32P-ppGpp) over naar een nieuwe schroefdopbuis.</li>
	<li>Analyseer de 32P-pppGpp en 32P-ppGpp door 1 μL van de monsters uit te voeren op een dunnelaagchromatografie (TLC) plaat (polyethyleenimine gemodificeerde cellulose TLC platen) met behulp van de 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, als mobiele fase. OPMERKING: Gebruik de α-32P-gelabeld guanosine 5'-trifosfaat(32P-α-GTP) als controle.</li>
	<li>Droog de TLC-plaat volledig, plaats deze tussen een transparante plastic map en stel deze gedurende 5 minuten bloot aan een fosforscherm. Visualiseer en kwantificeer de signalen met behulp van een fosforbeeld. OPMERKING: Wanneer de verhoudingen van 32P-pppGpp en 32P-ppGpp hoger zijn dan 85%, kan een grootschalige reactie (500 μL, voldoende voor het screenen van 20 96-putplaten) worden geassembleerd en gesynthetiseerd met behulp van tabel 1.</li>
</ol>4. DRaCALA screening van de doeleiwitten van (p)ppGpp
<ol><li>Ontdooi en breng 20 μL hele cellysaten over naar een 96-put V-bodem microtiterplaat. Voeg 2,5 U/put endonuclease van Serratia marcescenstoe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om de viscositeit van lysaat te verminderen. Leg de lysaten 20 minuten op ijs.</li>
	<li>Meng de 32P-pppGpp en 32P-ppGpp in een 1:1 verhouding en voeg 1x lysis buffer L1 toe om de uiteindelijke concentratie van (p)ppGpp gelijk te maken aan 4 nM. OPMERKING: Gezien de chemische gelijkenis tussen pppGpp en ppGpp, zal een mix van beide chemicaliën het screeningsproces vereenvoudigen.</li>
	<li>Gebruik een meerkanaals pipet en gefilterde pipettips om 10 μL van het (p)ppGpp-mengsel toe te voegen en te mengen met het cellysaat. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Was het gereedschap van 96 x pin door 30 s in 0,01% oplossing van niet-ionisch reinigingsmiddel te plaatsen en droog gedurende 30 s op een tissuepapier. Herhaal het wassen van het speldgereedschap 3x.</li>
	<li>Plaats het pengereedschap in de bovenstaande monsterplaten met 96 put en wacht 30 s. Til het pengereedschap recht omhoog en plaats het gedurende 30 s recht naar beneden op een nitrocellulosemembraan. OPMERKING: Als er een vlek ontbreekt, moet u 2 μL van de overeenkomstige monsters met een pipet en gefilterde uiteinden plaatsen. Het is raadzaam om een dubbele vlek van hetzelfde monster te maken zoals hieronder aangegeven.</li>
	<li>Droog het membraan 5 minuten bij RT. Plaats het membraan tussen een transparante plastic map en stel het gedurende 5 minuten bloot aan een fosforscherm. Visualiseer met behulp van een fosforvisser.</li>
</ol>5. Kwantificering en identificatie van potentiële doeleiwitten
<ol><li>Gebruik de analysesoftware die is gekoppeld aan de fosforvisualisatie om het .gel-bestand van de gevisualiseerde platen te openen. Gebruik de functie Array-analyse om de 96 spots te definiëren door een raster van 12 kolommen x 8 rijen in te stellen.</li>
	<li>Definieer grote cirkels om de buitenrand van de hele vlekken te omgrenzen (zie figuur 1B). Exporteer de Volumn+Background en Area van de gedefinieerde grote cirkels en sla op in een spreadsheet. OPMERKING: Verplaats indien nodig elke afzonderlijke cirkel om perfect te overlappen met de vlekken en pas het formaat van elke afzonderlijke cirkel aan om deze iets groter te maken dan de werkelijke plek.</li>
	<li>Verklein de gedefinieerde cirkels om de kleine binnenste stippen te omringen. Exporteer de Volumn+Backgrounden het gebied van de gedefinieerde kleine cirkels en sla op in een spreadsheet.</li>
	<li>Bereken de bindingsfracties in het werkblad met behulp van de vergelijking in figuur 1Ben plot de gegevens. Identificeer de potentiële bindende eiwitten in de putten die hoge bindingsfracties vertonen in vergelijking met de meeste andere putten.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg"> Figuur 2: Algemene workflow van het DRaCALA-screeningsproces. Eiwitproductie uit een Escherichia coli ASKA-collectie wordt geïnduceerd en de cellen worden gelyseerd. Ondertussen worden de recombinante eiwitten Relseq-His en GppA-His gezuiverd en gebruikt om 32P-gelabelde pppGpp en ppGpp van 32P-α-GTP te synthetiseren. De radioactief gelabelde (p)ppGpp-moleculen worden vervolgens gemengd met de lysaten en een 96-pins tool wordt gebruikt om de mengsels op een nitrocellulosemembraan te herkennen voor latere blootstelling aan een fosforopslagscherm, beeldvorming en kwantificering van de radioactieve signalen. Afkortingen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosine penta- en tetrafosfaten; RT = kamertemperatuur; IPTG = isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosine 5'-trifosfaat; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese ; TLC = dunne laagchromatografie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<ol><li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide%2C+c-di-GMP%2C+c-di-AMP%2C+cGMP%2C+cAMP%2C+%28p%29ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li>
<li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+small-molecule+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins%3A+from+protein+kinase+A+to+potassium%2Fsodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li>
<li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404(2015).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+%27%2C5+%27-cAMP+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li>
<li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li>
<li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232(2015).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GIL%2C+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li>
<li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+%28p%29ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mbio%22%5BJournal%5D)">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188(2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus%2C+with+functions+distinct+from+those+of+%28p%29+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388(2020).</li>
<li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+%28DRaCALA%29+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+Unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li>
<li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p%29ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.

Een van de cruciale stappen bij het uitvoeren van DRaCALA-screening is het verkrijgen van goede hele cellysaten. Ten eerste moeten de geteste eiwitten in grote hoeveelheden en in oplosbare vormen worden geproduceerd. Ten tweede moet de lysis van cellen volledig zijn en moet de viscositeit van het lysaat minimaal zijn. De opname van lysozym en het gebruik van drie cycli van vries-dooi zijn vaak genoeg om cellen volledig te lyseren. Het vrijgegeven chromosomale DNA maakt het lysaat echter stroperig en genereert een hoog ac...

Bacteriën gebruiken verschillende kleine signaalmoleculen om zich aan te passen aan constant veranderende omgevingen1,2. Bijvoorbeeld, de auto-inducers, N-acylhomoserine lactones en hun gemodificeerde oligopeptiden, bemiddelen de intercellulaire communicatie tussen bacteriën om populatiegedrag te coördineren, een fenomeen dat bekend staat als quorum sensing2. Een andere groep kleine signaalmoleculen zijn de NSM's, waaronder het veel bestudeerde cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP), cyclisch di-AMP, cyclisch di-guanosinemonofosfaat (cyclisch di-GMP) en guanosine penta- en tetrafosfaat (p)ppGpp1. Bacteriën produceren deze NSM's als reactie op verschillende stressomstandigheden. Eenmaal geproduceerd, binden deze moleculen zich aan hun doeleiwitten en reguleren ze verschillende fysiologische en metabolische routes om de ondervonden stress aan te kunnen en de bacteriële overleving te verbeteren. Daarom is identificatie van de doeleiwitten een onvermijdelijke voorwaarde voor het ontcijferen van de moleculaire functies van deze kleine moleculen.
Het afgelopen decennium is getuige geweest van een hausse aan kennis van deze kleine signaalmoleculen, voornamelijk als gevolg van verschillende technische innovaties die de doeleiwitten van deze kleine moleculen onthulden. Deze omvatten de afvangverbindingstechniek3,4,5, en de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)6 die in dit artikel moet worden besproken.
Uitgevonden door Vincent Lee en collega's in 20116, DRaCALA zet het vermogen van een nitrocellulosemembraan in om differentieel vrije en eiwitgebonden liganden vast te zetten. Moleculen zoals eiwitten kunnen zich niet verspreiden op een nitrocellulosemembraan, terwijl kleine liganden, zoals de NSM's, dat wel kunnen. Door het NSM (bijv.ppGpp ) te mengen met het te testen eiwit en deze op het membraan te spotten, kunnen twee scenario's worden verwacht(figuur 1):Als (p)ppGpp zich aan het eiwit bindt, wordt het radiolabel (p)ppGpp in het midden van de vlek door het eiwit behouden en zal het niet naar buiten diffuus zijn, wat een intens klein puntje geeft (d.w.z. sterk radioactief signaal) onder een fosforimager. Als (p)ppGpp zich echter niet aan het eiwit bindt, zal het vrij naar buiten diffuus zijn om een grote vlek met een uniform radioactief achtergrondsignaal te produceren.
Bovendien kan DRaCALA de interactie tussen een klein molecuul en een ongezuiverd eiwit in een hele cellysaat detecteren als het eiwit in voldoende hoeveelheid aanwezig is. Deze eenvoud maakt het gebruik van DRaCALA mogelijk bij het snel identificeren van eiwitdoelen met behulp van een ORFeome-expressiebibliotheek. Doeleiwitten van cAMP7, cyclische di-AMP8, cyclische di-GMP9,10en (p)ppGpp 11,12,13 zijn systematisch geïdentificeerd met behulp van DRaCALA. Dit videoartikel gebruikt (p)ppGpp als voorbeeld om de kritische stappen en overwegingen bij het uitvoeren van een succesvolle DRaCALA-screening te demonstreren en te beschrijven. Een meer grondige beschrijving van DRaCALA14 wordt ten zeerste aanbevolen om te lezen in combinatie met dit artikel voordat U DRaCALA uitvoert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figuur 1: Het principe van DRaCALA. (A) Schematisch van de DRaCALA-test. Zie de tekst voor meer informatie. B) Kwantificering en berekening van de bindende fractie. Zie de tekst voor meer informatie. Kortom, de DRaCALA-vlekken worden geanalyseerd door twee cirkels te tekenen die de hele vlek en de binnenste donkere stip omringen(d.w.z.de behouden (p)ppGpp vanwege de binding van het geteste eiwit). Het specifieke bindingssignaal is het radioactieve signaal van de binnenste cirkel (S1) na aftrek van het niet-specifieke achtergrondsignaal (berekend door A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). De bindingsfractie is het specifieke bindingssignaal gedeeld door het totale radioactieve signaal (S2). Afkortingen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosine penta- en tetrafosfaten; RT = kamertemperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>32P-&alpha;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 x pin tool</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td></tr><tr><td>96-well V-bottom microtiter plate</td><td>Sterilin</td><td>MIC9004</td><td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>LP0011</td><td>Agar no. 1</td></tr><tr><td>ASKA collection strain</td><td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td><td></td><td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&ndash;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU</td><td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td></tr><tr><td>Bradford Protein Assay Dye</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Reagent Concentrate</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&ge;99.9%</td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>gel filtration10x300 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>contains 20% ethanol as preservative</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>Glycerol 87% for analysis</td></tr><tr><td>Hypercassette</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>puriss. p.a., &ge; 99.5% (GC)</td></tr><tr><td>IP Storage Phosphor Screen</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td><td>Isopropyl &beta;-D-thiogalactoside</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher</td><td>12795027</td><td>Miller's LB Broth Base</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &ge;98%</td></tr><tr><td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td><td>SIGMA</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ water</td><td></td><td></td><td>ultrapure water</td></tr><tr><td>multichannel pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661110</td><td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>BR0014G</td><td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td></tr><tr><td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td><td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>SIGMA</td><td>93482</td><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td></tr><tr><td>Phosphor-imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td></tr><tr><td>Pipette Tips, filtered</td><td>Thermo Scientific</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12.5 &mu;l nonsterile</td></tr><tr><td>Poly-Prep Chromatography column</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>polypropylene chromatography column</td></tr><tr><td>Protease inhibitor Mini</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td>Tablets, EDTA-free</td></tr><tr><td>screw cap tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>3488</td><td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td></tr><tr><td>SLS 96-deep Well plates</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td></tr><tr><td>spin column</td><td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer C</td></tr><tr><td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td><td>Merck Millipore</td><td>105579</td><td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>Tris Base for Molecular Biology</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>viscous non-ionic detergent</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>99% (GC/titration)</td></tr></tbody></table>

identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (dracala)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Het afgelopen decennium heeft enorme vooruitgang geboekt in het begrijpen van kleine signaalmoleculen in de bacteriële fysiologie. Met name de doeleiwitten van verschillende nucleotide-afgeleide secundaire boodschappers (NSM's) zijn systematisch geïdentificeerd en bestudeerd in modelorganismen. Deze prestaties zijn voornamelijk te danken aan de ontwikkeling van verschillende nieuwe technieken, waaronder de capture compound-techniek en de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA), die werden gebruikt om systematisch doeleiwitten van deze kleine moleculen te identificeren. Dit artikel beschrijft het gebruik van de NSM's, guanosine penta- en tetrafosfaten (p)ppGpp, als voorbeeld en videodemonstratie van de DRaCALA-techniek. Met behulp van DRaCALA werden 9 van de 20 bekende en 12 nieuwe doeleiwitten van (p)ppGpp geïdentificeerd in het modelorganisme Escherichia coli K-12, wat de kracht van deze test aantoont. In principe kan DRaCALA worden gebruikt voor het bestuderen van kleine liganden die kunnen worden geëtiketteerd door radioactieve isotopen of fluorescerende kleurstoffen. De kritische stappen, voor- en nadelen van DRaCALA worden hier besproken voor verdere toepassing van deze techniek.

Het volgen van het hierboven beschreven protocol levert doorgaans twee soorten resultaten op (figuur 3).
Figuur 3A toont een plaat met relatief lage achtergrondbindingssignalen (bindingsfracties < 0,025) uit de meeste putten. Het positieve bindingssignaal van de put H3 geeft een bindende fractie van ~0,35 die veel hoger is dan die waargenomen voor de andere putten. Zelfs zonder kwantificering is goed H3 opmerkelijk, wat suggereert dat...

De differentiële radiale capillaire werking van Ligand Assay (DRaCALA) kan worden gebruikt om kleine ligandbindende eiwitten van een organisme te identificeren met behulp van een ORFeome-bibliotheek.

Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Kleine signaalmoleculen richten zich op verschillende effectoreiwitten om bacteriële virulentie en menselijke biologie te beheersen. Deze effectoreiwitten zijn echter een uitdaging om te identificeren. Als systeembiologietool maakt DRaCALA een haalbare, snelle en zeer gevoelige identificatie van de onbekende effectoreiwitten mogelijk met behulp van een OVium-bibliotheek.DRaCALA kan worden gebruikt om elk klein signaalmolecuul te bestuderen, zolang het kan worden gelabeld met radioactieve isotoop of fluorescerende kleurstoffen. Begin met het inenten van E.coli in 1,5 milliliter LB aangevuld met 25 microgram per milliliter chlooramfenicol in elke put van 96-put diepe putplaten voor een nachtelijke incubatie bij 30 graden Celsius en 160 rotaties per minuut. Behandel de volgende ochtend de overnachtingsculturen met 500 micromolar IPTG gedurende zes uur bij 30 graden Celsius om eiwitexpressie te induceren.Aan het einde van de incubatie pellet de cellen door centrifugeren, verwijder het supernatant en vries de monsters in bij min 80 graden Celsius. Om de lysis te starten, resuspend de pellets in 150 microliter lysis buffer één per put voor een incubatie van 30 minuten bij min 80 graden Celsius voordat de cellen gedurende 20 minuten ontdooien bij 37 graden Celsius. Het lysaat moet dan voor gebruik bij min 80 graden Celsius worden bewaard.Om de lysis van cellen met overexpressie-eiwitten te voltooien, resuspendeer de monsters in 40 milliliter ijskoude lysisbuffer twee en soniceer de monsters met een amplitude van 60% op twee seconden op vier seconden uit gedurende acht minuten, en wis vervolgens de lysaten door centrifugeren. Terwijl de monsters worden gecentrifugeerd, voegt u 500 microliters gehomogeniseerde nikkel-NTA-hars toe aan een staande polypropyleenchromatografiekolom. Was de bezinkte hars na 15 minuten twee keer met 15 milliliter ultrapure water en één keer met 15 milliliter lysisbuffer twee.Aan het einde van de centrifugeer, laad de ontruimde lysaat supernatant op de kolom. Wanneer al het lysaat door de kolom is gestroomd, wast u de kolom met 30 milliliter wasbuffer. Om de eiwitten te elute, voeg 400 microliter volume van elutie buffer toe aan de kolom en herhaal elutie drie keer.Nog eens 300 microliter volume van de elutie buffer om elutie drie keer te herhalen en de geëuteerde eiwitten te combineren in een eindvolume van 700 microliter. Voor gelfiltratie van het geëuteerde monster, na het wassen van een maatuitsluitingskolom met 25 milliliter vers bereide gelfiltratiebuffer, laadt u het volledige volume geëuteerde eiwitten op de kolom met behulp van een lus van 500 microliter. Voer 500 microliters per minuut uit en verzamel twee tot drie volumefracties van 500 microliter van de respectieve eiwitten.Gebruik vervolgens individuele spinkolommen om elk eiwit te concentreren en gebruik de Bradford-testkit om de eiwitconcentraties volgens standaardprotocollen te meten. Om het fosfor 32 gelabelde guanosine pentafosfaat te synthetiseren, monteert u een kleinschalige Relseq-reactie in een schroefvormige buis zoals beschreven in de tabel en incubeert u de reactie in een ThermoMixer gedurende een uur bij 37 graden Celsius en vijf minuten bij 95 graden Celsius, gevolgd door vijf minuten op ijs. Draai aan het einde van de incubaties het neergeslagen eiwit door centrifugeren en breng het gesynthetiseerde fosfor 32 gelabeld guanosine pentafosfaat met supernatant over naar een nieuwe schroefgecapteerde buis.Voeg voor fosfor 32 guanosinetetrafosfaatsynthese één micromolar GppA toe aan de helft van het fosfor 32 gelabelde guanosine pentafosfaatproduct in een nieuwe buis met schroefdop en incubeer de reactie gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius, vijf minuten bij 95 graden Celsius en vijf minuten op ijs. Draai aan het einde van de incubatie het neerslag door centrifugeren en breng het fosfor 32 gelabeld guanosinetetrafosfaat met supernatant over naar een nieuwe buis. Om de geïsoleerde doeleiwitten te analyseren, voert u één microliter van elk monster uit op een dunnelaagchromatografieplaat met 1,5 molair monopotassiumfosfaat als mobiele fase.Plaats na de analyse de gedroogde plaat in een transparante plastic map en stel de plaat vijf minuten bloot aan een fosforscherm voordat u de gegevens op een fosforbeeldvisualisatie visualiseert en kwantificeert. Voeg voor DRaCALA-screening van de doeleiwitten 20 microliter van de ontdooide groothandelslysaten toe aan individuele putten van een 95-put V-bodem microtiterplaat en voeg 2,5 eenheden Serratia marcescens endonuclease toe aan elke put. Na 15 minuten bij 37 graden Celsius, zet de lysates 20 minuten op ijs.Meng vervolgens gelijke hoeveelheden fosfor 32 met het label guanosine pentafosfaat en guanosinetetrafosfaat en voeg 1X lysisbuffer één toe aan het mengsel om een vier nanomolar guanosine pentafosfaatoplossing te verkrijgen. Meng met behulp van een meerkanaals pipet en gefilterde pipettips 10 microliters van het guanosine pentafosfaatmengsel met het cellysaat gedurende een incubatietijd van vijf minuten bij kamertemperatuur. Was aan het einde van de incubatie een 96X-pingereedschap drie keer in een 0,01% oplossing van niet-ionisch wasmiddel gedurende 30 seconden, gevolgd door 30 seconden drogen op een papieren handdoek per wasbeurt voordat u het pingereedschap in de 96-put monsterplaat plaatst.Til het pengereedschap na 30 seconden recht omhoog en plaats het gedurende 30 seconden recht op een nitrocellulosemembraan. Plaats na vijf minuten drogen het nitrocellulosemembraan in een transparante plastic map voor blootstelling aan fosforscreening en visualisatie door fosforbeeldvorming zoals aangetoond. Om potentiële doeleiwitten te kwantificeren en te identificeren, opent u in de analysesoftware die is gekoppeld aan de fosforafbeelding het gelbestand van de gevisualiseerde platen.Als u de te analyseren vlekken wilt definiëren, gebruikt u de functie matrixanalyse om een raster van 12 kolommen bij acht rijen in te stellen. Als u de buitenste rand van de gatvlekken wilt omsnijden, definieert u grote cirkels, exporteert u het volume plus de achtergrond en het gebied van de gedefinieerde grote cirkels naar een spreadsheet. Als u de kleine binnenste punten wilt omgrenzen, verkleint u de gedefinieerde cirkels, exporteert u het volume plus de achtergrond en het gebied van de gedefinieerde kleine cirkels en slaat u alle gegevens in het werkblad op.Plaats cirkels om zo nodig te overlappen met vlekken, waarbij het formaat van de iets grotere dan werkelijke vlekken wordt wijzigen. Gebruik de vergelijking om de bindingsfracties in het werkblad te berekenen en de gegevens te plotten. Identificeer vervolgens de potentiële bindende eiwitten in de putten die hoge bindingsfracties vertonen in vergelijking met de meeste andere putten.In deze representatieve analyse kan een plaat met relatief lage achtergrondbindingssignalen in de meeste putten worden waargenomen. Het positieve bindingssignaal in put H3 vertoonde een bindende fractie die veel hoger was dan die waargenomen voor de andere putten als gevolg van overexpressie van het guanosine pentafosfaatbindend eiwit Hpt. In de representatieve platen vertoonden verschillende putten een relatief hogere achtergrondbindingssignalen, zoals aangegeven door de relatief sterke binnenste stippen die in veel putten werden waargenomen, evenals de consistent hoge bindingsfracties die na kwantificering werden waargenomen.Sommige doelen gaven met name ook variabele bindingsfracties, zoals de false positives. Om verder te verduidelijken, gebruikten onderzoekers gezuiverde eiwitten om de binding opnieuw te testen. Zodra de doeleiwitten zijn geïdentificeerd, kan men ze zuiveren tot homogeniteit en interactiesterkte en specificiteit bevestigen met behulp van DRaCALA, isotherme titratiecalorimetrie of andere methoden.Het identificeren van de doeleiwitten van kleine signaalmoleculen maakt de weg vrij voor een diepgaand begrip van de rollen die voortkomen uit bacteriële virulentie tot menselijke biologie.

identifying-binding-proteins-small-ligands-with-differential-radial

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes the method to analyze protein-ligand interaction by mobility-shift affinity capillary electrophoresis. This method can be used for characterizing the binding behavior of a protein with various charged ligands.

Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis: A Method to Analyze Sample-Ligand Interactions Depending on Differential Migration of Protein-Ligand Complexes

This video demonstrates the differential radial capillary action of ligand assay — a technique for systematic high-throughput screening of intracellular nucleotide second messenger-binding proteins. This technique allows for direct binding of the messengers to the overexpressed target protein in the cell lysate — bypassing the need for protein purification.

Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay: A High-Throughput Technique to Identify Bacterial Nucleotide Second Messenger-Binding Intracellular Proteins

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

De gepresenteerde protocollen beschrijven twee op enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) gebaseerde technieken voor de snelle onderzoeking van ligand-receptor interacties: De eerste test stelt de bepaling van constante disassociatie tussen ligand en receptor mogelijk. De tweede test maakt een snelle screening van blokkerende peptiden voor ligand-receptor interacties mogelijk.

Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Het protocol hier beschrijft de interacties van gezuiverde hEAG1 ion kanaal eiwit met de kleine molecuul lipide ligand phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). De meting toont aan dat BLI zou een mogelijke methode voor nieuwe kleine-molecuul ion kanaal ligand screening.

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

Een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een titratie ELISA wordt beschreven. Bovendien wordt een nieuw algoritme te evalueren van de titratie ELISAs en te verkrijgen van een dissociatieconstante van binding van een oplosbare ligand aan een receptor microtiterplaat plaat-geïmmobiliseerd gepresenteerd.

Titratie ELISA als een methode om te bepalen van de dissociatieconstante van Receptor-Ligand interactie

Hier presenteren we een protocol voor de productie en zuivering van eiwitten die zijn gemarkeerd met stabiele isotopen, en verdere karakterisering van eiwit-eiwitinteractie met behulp nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en MicroScale Thermophoresis (MST) experimenten.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.

Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

Leer hoe je met DRaCALA eiwitdoelen van kleine signaalmoleculen identificeert in Escherichia coli. Deze methode maakt snelle, gevoelige screening van eiwit-ligand interacties mogelijk voor bacteriële fysiologie onderzoek.

Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA) (Video) | JoVE Journal

Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)

Meer video's verkennen