Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)

Kleine signaalmoleculen richten zich op verschillende effectoreiwitten om bacteriële virulentie en menselijke biologie te beheersen. Deze effectoreiwitten zijn echter een uitdaging om te identificeren. Als systeembiologietool maakt DRaCALA een haalbare, snelle en zeer gevoelige identificatie van de onbekende effectoreiwitten mogelijk met behulp van een OVium-bibliotheek.

DRaCALA kan worden gebruikt om elk klein signaalmolecuul te bestuderen, zolang het kan worden gelabeld met radioactieve isotoop of fluorescerende kleurstoffen. Begin met het inenten van E.coli in 1,5 milliliter LB aangevuld met 25 microgram per milliliter chlooramfenicol in elke put van 96-put diepe putplaten voor een nachtelijke incubatie bij 30 graden Celsius en 160 rotaties per minuut. Behandel de volgende ochtend de overnachtingsculturen met 500 micromolar IPTG gedurende zes uur bij 30 graden Celsius om eiwitexpressie te induceren.

Aan het einde van de incubatie pellet de cellen door centrifugeren, verwijder het supernatant en vries de monsters in bij min 80 graden Celsius. Om de lysis te starten, resuspend de pellets in 150 microliter lysis buffer één per put voor een incubatie van 30 minuten bij min 80 graden Celsius voordat de cellen gedurende 20 minuten ontdooien bij 37 graden Celsius. Het lysaat moet dan voor gebruik bij min 80 graden Celsius worden bewaard.

Om de lysis van cellen met overexpressie-eiwitten te voltooien, resuspendeer de monsters in 40 milliliter ijskoude lysisbuffer twee en soniceer de monsters met een amplitude van 60% op twee seconden op vier seconden uit gedurende acht minuten, en wis vervolgens de lysaten door centrifugeren. Terwijl de monsters worden gecentrifugeerd, voegt u 500 microliters gehomogeniseerde nikkel-NTA-hars toe aan een staande polypropyleenchromatografiekolom. Was de bezinkte hars na 15 minuten twee keer met 15 milliliter ultrapure water en één keer met 15 milliliter lysisbuffer twee.

Aan het einde van de centrifugeer, laad de ontruimde lysaat supernatant op de kolom. Wanneer al het lysaat door de kolom is gestroomd, wast u de kolom met 30 milliliter wasbuffer. Om de eiwitten te elute, voeg 400 microliter volume van elutie buffer toe aan de kolom en herhaal elutie drie keer.

Nog eens 300 microliter volume van de elutie buffer om elutie drie keer te herhalen en de geëuteerde eiwitten te combineren in een eindvolume van 700 microliter. Voor gelfiltratie van het geëuteerde monster, na het wassen van een maatuitsluitingskolom met 25 milliliter vers bereide gelfiltratiebuffer, laadt u het volledige volume geëuteerde eiwitten op de kolom met behulp van een lus van 500 microliter. Voer 500 microliters per minuut uit en verzamel twee tot drie volumefracties van 500 microliter van de respectieve eiwitten.

Gebruik vervolgens individuele spinkolommen om elk eiwit te concentreren en gebruik de Bradford-testkit om de eiwitconcentraties volgens standaardprotocollen te meten. Om het fosfor 32 gelabelde guanosine pentafosfaat te synthetiseren, monteert u een kleinschalige Relseq-reactie in een schroefvormige buis zoals beschreven in de tabel en incubeert u de reactie in een ThermoMixer gedurende een uur bij 37 graden Celsius en vijf minuten bij 95 graden Celsius, gevolgd door vijf minuten op ijs. Draai aan het einde van de incubaties het neergeslagen eiwit door centrifugeren en breng het gesynthetiseerde fosfor 32 gelabeld guanosine pentafosfaat met supernatant over naar een nieuwe schroefgecapteerde buis.

Voeg voor fosfor 32 guanosinetetrafosfaatsynthese één micromolar GppA toe aan de helft van het fosfor 32 gelabelde guanosine pentafosfaatproduct in een nieuwe buis met schroefdop en incubeer de reactie gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius, vijf minuten bij 95 graden Celsius en vijf minuten op ijs. Draai aan het einde van de incubatie het neerslag door centrifugeren en breng het fosfor 32 gelabeld guanosinetetrafosfaat met supernatant over naar een nieuwe buis. Om de geïsoleerde doeleiwitten te analyseren, voert u één microliter van elk monster uit op een dunnelaagchromatografieplaat met 1,5 molair monopotassiumfosfaat als mobiele fase.

Plaats na de analyse de gedroogde plaat in een transparante plastic map en stel de plaat vijf minuten bloot aan een fosforscherm voordat u de gegevens op een fosforbeeldvisualisatie visualiseert en kwantificeert. Voeg voor DRaCALA-screening van de doeleiwitten 20 microliter van de ontdooide groothandelslysaten toe aan individuele putten van een 95-put V-bodem microtiterplaat en voeg 2,5 eenheden Serratia marcescens endonuclease toe aan elke put. Na 15 minuten bij 37 graden Celsius, zet de lysates 20 minuten op ijs.

Meng vervolgens gelijke hoeveelheden fosfor 32 met het label guanosine pentafosfaat en guanosinetetrafosfaat en voeg 1X lysisbuffer één toe aan het mengsel om een vier nanomolar guanosine pentafosfaatoplossing te verkrijgen. Meng met behulp van een meerkanaals pipet en gefilterde pipettips 10 microliters van het guanosine pentafosfaatmengsel met het cellysaat gedurende een incubatietijd van vijf minuten bij kamertemperatuur. Was aan het einde van de incubatie een 96X-pingereedschap drie keer in een 0,01% oplossing van niet-ionisch wasmiddel gedurende 30 seconden, gevolgd door 30 seconden drogen op een papieren handdoek per wasbeurt voordat u het pingereedschap in de 96-put monsterplaat plaatst.

Til het pengereedschap na 30 seconden recht omhoog en plaats het gedurende 30 seconden recht op een nitrocellulosemembraan. Plaats na vijf minuten drogen het nitrocellulosemembraan in een transparante plastic map voor blootstelling aan fosforscreening en visualisatie door fosforbeeldvorming zoals aangetoond. Om potentiële doeleiwitten te kwantificeren en te identificeren, opent u in de analysesoftware die is gekoppeld aan de fosforafbeelding het gelbestand van de gevisualiseerde platen.

Als u de te analyseren vlekken wilt definiëren, gebruikt u de functie matrixanalyse om een raster van 12 kolommen bij acht rijen in te stellen. Als u de buitenste rand van de gatvlekken wilt omsnijden, definieert u grote cirkels, exporteert u het volume plus de achtergrond en het gebied van de gedefinieerde grote cirkels naar een spreadsheet. Als u de kleine binnenste punten wilt omgrenzen, verkleint u de gedefinieerde cirkels, exporteert u het volume plus de achtergrond en het gebied van de gedefinieerde kleine cirkels en slaat u alle gegevens in het werkblad op.

Plaats cirkels om zo nodig te overlappen met vlekken, waarbij het formaat van de iets grotere dan werkelijke vlekken wordt wijzigen. Gebruik de vergelijking om de bindingsfracties in het werkblad te berekenen en de gegevens te plotten. Identificeer vervolgens de potentiële bindende eiwitten in de putten die hoge bindingsfracties vertonen in vergelijking met de meeste andere putten.

In deze representatieve analyse kan een plaat met relatief lage achtergrondbindingssignalen in de meeste putten worden waargenomen. Het positieve bindingssignaal in put H3 vertoonde een bindende fractie die veel hoger was dan die waargenomen voor de andere putten als gevolg van overexpressie van het guanosine pentafosfaatbindend eiwit Hpt. In de representatieve platen vertoonden verschillende putten een relatief hogere achtergrondbindingssignalen, zoals aangegeven door de relatief sterke binnenste stippen die in veel putten werden waargenomen, evenals de consistent hoge bindingsfracties die na kwantificering werden waargenomen.

Sommige doelen gaven met name ook variabele bindingsfracties, zoals de false positives. Om verder te verduidelijken, gebruikten onderzoekers gezuiverde eiwitten om de binding opnieuw te testen. Zodra de doeleiwitten zijn geïdentificeerd, kan men ze zuiveren tot homogeniteit en interactiesterkte en specificiteit bevestigen met behulp van DRaCALA, isotherme titratiecalorimetrie of andere methoden.

Het identificeren van de doeleiwitten van kleine signaalmoleculen maakt de weg vrij voor een diepgaand begrip van de rollen die voortkomen uit bacteriële virulentie tot menselijke biologie.