Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

Om de biologische aspecten van bruin vetweefsel te onderzoeken, is het essentieel om de grootte van gezuiverde bruine vetweefsel te verwijderen. Momenteel kwam er geen bruine vetgrootte zuivering en de massa's zijn beschikbaar. In deze studie hebben we een eenvoudig protocol ontwikkeld om dit probleem aan te pakken.

Nu is één vaardigheid vereist voor dit protocol. Het heeft veel minder studiemateriaal nodig dan andere methoden en de gezuiverde bruine vetgrootte kan direct worden gebruikt voor gen- en eiwitexpressieanalyse. Dit protocol biedt een nieuwe methode voor het bestuderen van de biologie van de klassieke bruine vetgrootte.

Het kan ook worden toegepast om het bruiningsproces van witte adipocyten te bestuderen. De procedure wordt gedemonstreerd door Amanda, een onderzoeksassistente van mijn laboratorium. Begin met het plaatsen van de kolf met BAT en de digestieoplossing op een magneetroerder met 60 omwentelingen per minuut in een incubator van 35 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Gebruik een pipet van één milliliter om de geaggregeerde weefselklompen van BAT-plakjes rond de roerstaaf te verstoren. Plaats na de vertering een zeeffilter van 70 micrometer bovenop een schone centrifugebuis van 50 milliliter en pipet ongeveer vier milliliter celsuspensie door de zeef. Was het vervolgens met vier milliliter 12% iodixanoloplossing.

Pipetteer op en neer om de cellen te mengen met iodixanoloplossing en breng het celmengsel vervolgens over in twee heldere vijf milliliter polystyreen reageerbuizen. Plaats de polystyreenbuizen met het celmengsel gedurende een uur op ijs, waardoor de BA's een laag aan de bovenkant vormen. Verwijder 20 microliter van de geïsoleerde BA's voor microscooponderzoek.

Pipetteer voor RNA- en eiwitisolatie de BA-laag in twee 1,7 milliliter microcenterfuge-buizen. Verwijder vervolgens voorzichtig de overmatige jododixale oplossing zonder de BA-laag te verstoren. Voeg vervolgens een milliliter TRIzol toe aan de celoplossing om tegelijkertijd RNA, DNA en eiwit te isoleren en voldoende te mengen om de cellen te lyceren.

Om de fasen te scheiden, voegt u 200 microliter chloroform en centrifugeer aan de buis bij 9, 981 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gebruik na centrifugatie de waterige fase voor RNA-isolatie. Breng 300 microliter van de organische fase over in een microcentrifugebuis van twee milliliter en voeg 750 microliter 100% ethanol toe.

Voeg na 10 seconden vortexen 200 microliter 1-broom-3-chloorpropaan en vortex opnieuw toe gedurende 10 seconden. Voeg 600 microliter dubbel gedestilleerd water toe voordat u gedurende 10 seconden vortext. Laat de gemengde oplossing 10 minuten op kamertemperatuur staan.

Voeg na centrifugeren 9.981 G toe gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. De fasen worden gescheiden met de eiwitfase gelokaliseerd in de middelste laag. Verwijder de bovenste waterige oplossing en voeg een milliliter 100% ethanol toe aan de resterende oplossing.

Na centrifugeren bij 9, 981 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, gooit u het supernatant weg en wast u de pellet met één milliliter 100% ethanol. Centrifugeer bij 9. 981 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van het supernatant droogt u de pellet gedurende 10 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur en meet u het gewicht van de natte pellet.

Voeg 1% SDS-oplossing toe in een verhouding van 20 microliter per milligram pellet. Los de pellet volledig op door de buis gedurende vijf tot 10 minuten in een verwarmde shaker van 55 graden Celsius en 11 G te doen. In het protocol werd PBS met 3% BSA gebruikt om BA's van BBT te scheiden.

De geïsoleerde cellen waren framboosvormig met multiloculaire lipidedruppeltjes erin en waren tdTom-positief, wat bevestigt dat ze BA's waren. Eiwit werd geïsoleerd uit de BA's met een verbeterd GTPC-protocol en werd vervolgens onderzocht met een SDS-PAGE-gel. Een dominante band geassocieerd met BSA werd waargenomen in het BA-monster, wat wijst op de interferentie ervan in eiwitextractie.

Om BSA-interferentie te voorkomen, werd een 6% jodoxineale oplossing gebruikt voor de isolatie van BA's, die een typische frambozenvorm hadden en multiloculaire lipidedruppels bevatten. Eiwitten geëxtraheerd uit deze BA's werden goed gescheiden in de SDS-PAGE gel. Deze cellen bleken tdTomato-positief te zijn, terwijl cellen die uit de pellet werden teruggevonden tdTomato-negatief waren zonder duidelijke lipidedruppels, wat een efficiënte scheiding van de BA's van de niet-vetcellen suggereert.

In genexpressieanalyse waren de mRNA-niveaus van UCP1 en PDGFA significant hoger in de geïsoleerde BA's. Maar het mRNA van PDGFRA werd alleen gedetecteerd in BAT. UCP1-eiwit werd verrijkt aangetroffen in geïsoleerde BA's.

EDGFR-alfa werd gedetecteerd in BBT, maar niet in geïsoleerde BA's. Deze resultaten bevestigen de efficiëntie van de methode voor het isoleren van BA's en tonen aan dat de geïsoleerde BA's geschikt zijn voor gen- en eiwitexpressiestudies. Gebruik bij het proberen van dit protocol een verse verteringsbuffer om bruin vetweefsel te dissociëren en weefselklompvorming tijdens de spijsverteringsperiode te voorkomen.

Deze nieuwe methode maakt het gemakkelijk om de biologie van bruin vetweefsel op een enkelcellig tapniveau te onderzoeken. Door deze methode toe te passen, kan men GN- en eiwitexpressiestudies uitvoeren met zuiver bruine adipocyten die precies het genexpressieprogramma van bruine adipocyten ontleden, zonder zich zorgen te maken over besmetting die oorspronkelijk afkomstig is van vetvrije cellen.