Name: Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel met behulp van enzymatische digestie en iodixanol-gebaseerde dichtheidsscheiding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z. Lin werd ondersteund door national institutes of health HL138454-01 en masonic medical research institute fondsen.

Alle muizen werden in pathogeenvrije omstandigheden gehouden en alle procedures werden goedgekeurd door Masonic Medical research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 en Rosa 26tdTomato muizen lijnen13 werden eerder gemeld. Alle muizen werden op kamertemperatuur gehouden met een licht/donker cyclus van 12 uur.
1. Voorbereiding van de oplossingen en bruin vetweefsel (BBT)
<ol><li>Bereid de vergistingsoplossing en scheidingsoplossing in centrifugebuizen van 15 ml.</li>
	<li>10 ml BBT-verteringsoplossing: voeg aan 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 3,5 mg / ml Dispase II, 1 mg / ml Collagenase II en 10 mM CaCl2 toe om BAT-verteringsoplossing te maken.</li>
	<li>10 ml 12% iodixanoloplossing (scheidingsoplossing): Meng 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% iodixanol, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 6,865 ml ddH2O om 12% iodixanol te verkrijgen.</li>
	<li>Euthanaseer één volwassen muis met een overdosis CO2 . Kortom, vul de muizenkooi met 100% CO2 met een verplaatsingssnelheid van 10-30% kooivolume per minuut. 5 minuten later, bevestig de dood door te controleren op de afwezigheid van zichtbaar ademhalen.</li>
	<li>Ontleed het dier en verzamel interscapulaire BBT. Verwijder WAT en spierlagen onder een stereomicroscoop.</li>
	<li>Om voldoende vertering te hebben, snijdt u elke BAT-kwab in ~ 3 mm3 delen en plaatst u ze in een schone kolf van 50 ml met een metalen roerstaaf en 5 ml digestieoplossing. Voordat u met de spijsvertering begint, laat u de kolf met BAT en de digestiebuffer 1 uur op ijs staan. OPMERKING: In de volgende stappen werd ongeveer 80 mg BBT gebruikt voor de isolatie van bruine adipocyten.</li>
</ol>2. Ba's isolatieprocedure
<ol><li>Plaats de kolf op een magneetroerder die in een couveuse is ingesloten. Stel de roersnelheid in op respectievelijk 60 tpm en de temperatuur van de incubator op 35 °C. De spijsvertering duurt ongeveer 30 min. Als de BAT-plakjes tijdens de spijsvertering klonten rond de roerstaaf vormen, gebruik dan een pipetpunt van 1 ml om de geaggregeerde weefsels te verstoren.</li>
	<li>Plaats een zeeffilter van 70 μm bovenop een schone centrifugebuis van 50 ml. Pipetteer rond 4 ml celsuspensie door de zeef. Was de zeef met 4 ml 12% iodixanoloplossing. Pipetteer op en neer om de cellen en de iodixanoloplossing te mengen. Breng het celmengsel over in twee heldere polystyreentestbuizen van 5 ml. OPMERKING: Aan het einde van de spijsvertering moet de spijsverteringsoplossing troebel zijn, wat wijst op voldoende spijsvertering. Gebruik elke keer een verse verteringsoplossing. Eenmaal bereid, moet de verteeroplossing binnen 2 uur worden gebruikt.</li>
	<li>Herhaal stap 2.2 en 2.3 nogmaals als de spijsvertering niet voldoende is.</li>
	<li>Laat de heldere polystyreenbuizen met de scheidingsoplossing en BA's gedurende 1 uur op ijs staan. De BA's vormen een laag aan de bovenkant.</li>
	<li>Verwijder 20 μL van de geïsoleerde BA's voor microscooponderzoek.</li>
</ol>3. RNA- en eiwitisolatie van BA's
<ol><li>Pipetteer de BA-laag in twee microcentrifugebuizen van 1,7 ml voor RNA- en eiwitisolatie. Verwijder voorzichtig de overmatige iodixanol-oplossing zonder de BA-laag te verstoren.</li>
	<li>Voeg 1 ml Trizol toe om tegelijkertijd RNA, DNA en eiwit in de celoplossing te isoleren. Meng voldoende om de cellen te lyseren.</li>
	<li>Voeg 200 μL Chloroform toe om de fasen te scheiden.</li>
	<li>Centrifugeer de buis gedurende 9.981 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Gebruik na centrifugatie de waterige fase voor RNA-isolatie. In deze studie werd totaal RNA gebruikt voor reverse transcriptie en kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met Real-Time PCR. Primersequenties worden weergegeven in de tabel met materialen.</li>
	<li>Breng 300 μL van de organische fase over in een microcentrifugebuis van 2 ml.</li>
	<li>Voeg aan de organische fase 2,5 volume 100% ethanol en vortex toe gedurende 10 s.</li>
	<li>Voeg 200 μL 1-broom-3-chloorpropaan en vortex toe gedurende 10 s.</li>
	<li>Voeg 600 μL dubbel gedestilleerd water en vortex toe gedurende 10 s.</li>
	<li>Laat de gemengde oplossing 10 min op kamertemperatuur staan.</li>
	<li>Centrifugeer bij 9.981 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bij deze stap worden de fasen gescheiden. De eiwitfase is gelokaliseerd in de middelste laag.</li>
	<li>Verwijder de bovenste waterige oplossing. Voeg 1 ml 100% ethanol toe aan de resterende oplossing.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min, 9,981 x g, 4 °C. Na centrifugatie zal de eiwitpellet zich vormen. Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Was de pellet met 1 ml 100% ethanol.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min, 9981 x g, 4 °C. Bewaar de pellet en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Droog de pellet 10 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Meet het gewicht van de natte pellet. Voeg 1% SDS-oplossing toe in een verhouding van 20 μL/mg pellet.</li>
	<li>Los de pellet op door de buis in een verwarmde shaker te doen. Stel de temperatuur in op 55 °C en de snelheid op 11 x g. Het duurt meestal 5-10 minuten om de eiwitkorrel volledig op te lossen. OPMERKING: De concentratie van het opgeloste eiwit kan worden gemeten met BCA-test14.</li>
</ol>

<ol><li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+and+functional+diversity+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li>
<li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).</li>
<li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown%2C+beige%2Fbrite%3A+Different+adipose+cells+for+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+Leukotrienes+and+Essential+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li>
<li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li>
<li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li>
<li>Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li>
<li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Report%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li>
<li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol%3A+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li>
<li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+%28OptiPrep%29+density+gradient-based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674(2019).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li>
<li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELi+protocol%3A+Optimization+for+protein+extraction+from+white%2C+brown%2C+and+beige+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li>
<li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li>
<li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li>
</ol>

In deze studie werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het isoleren van BA's voor gen- en eiwitexpressieanalyse.
In een gepubliceerd BA-isolatieprotocol werd 3% BSA-oplossing gebruikt om BA's12 te verrijken. Niettemin konden de verrijkte BA's die door dit gepubliceerde protocol werden bereikt, niet direct worden gebruikt voor eiwitexpressieanalyse. Dit komt omdat de geconcentreerde BSA die in de BA-oplossing aanwezig is, interfereert met de daaropvolgende eiwitextractie...

Zowel muizen als mensen hebben twee soorten vetweefsel: wit vetweefsel (WAT) en bruin vetweefsel (BAT)1. WAT slaat energie op in de vorm van triglyceriden in witte adipocyten en de bruine adipocyten (BA's) van BAT dissiperen chemische energie als warmte2. Op basis van hun ontwikkelingsoorsprong worden BA's verder onderverdeeld in klassieke BA's (cBA's) die zijn gevormd tijdens de ontwikkeling van embryo's en witte adipocyten afgeleide BA's (beige / brite-cellen, omgezet uit witte adipocyten onder stressomstandigheden)3. BA's zijn multiloculair en drukken het thermogene eiwit ontkoppelingseiwit 1 (UCP1)4 uit. Interscapulair BBT (iBAT) depot is een van de primaire cBA's depots bij kleine zoogdieren5, terwijl beige cellen verspreid zijn binnen WAT6. 
Vanwege hun aard van het afvoeren van energie, hebben BA's veel aandacht gekregen als een therapeutisch doelwit voor het verminderen van obesitas7. Om BA's te exploiteren voor de behandeling van obesitas, is het essentieel om de moleculaire mechanismen te begrijpen die de functie, overleving en rekrutering van BA's beheersen. Vetweefsels, waaronder BAT en WAT, zijn heterogeen. Met uitzondering van adipocyten bevatten vetweefsels vele andere celtypen, zoals endotheelcellen, mesenchymale stamcellen en macrofagen8. Hoewel er genetische hulpmiddelen beschikbaar zijn om specifiek kandidaatgenen in muizen BA's uit te putten, zoals UCP1::Cre-lijn9, zijn technieken voor het zuiveren van BA's uit BAT of WAT beperkt, waardoor het moeilijk is om BA's op een eencellig type niveau te bestuderen. Bovendien zal de relatie tussen BA's en niet-BA's niet duidelijk worden afgebakend zonder het verkrijgen van zuivere BA's. Bloedplaatjes-afgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRα) is bijvoorbeeld gebruikt als marker voor ongedifferentieerde mesenchymale cellen en wordt uitgedrukt in de endotheel- en interstitiële cellen van BAT. In koud gestresste BBT geven PDGFRα-positieve voorlopercellen aanleiding tot nieuwe BA's10. PDGFRα wordt geactiveerd door zijn ligand PDGF, een groeifactor die de groei en proliferatie van mesenchymale cellen reguleert11; het is echter onduidelijk of BA's het gedrag van PDGFRα-positieve voorlopercellen beïnvloeden door PDGF uit te scheiden. 
Onlangs is een BAs-isolatieprotocol gepubliceerd, dat is gebaseerd op fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)12. In dit protocol werd 3% runderserumalbumine (BSA) -oplossing gebruikt om BA's van niet-BA's te scheiden, en de verrijkte BA's werden verder gezuiverd door FACS. De toepassing van dit protocol wordt beperkt door de vereiste van het FACS-proces, dat afhankelijk is van zowel apparatuur als FACS-bedieningservaringen. In deze studie werd een nieuw protocol ontwikkeld voor het isoleren van BA's van BBT. De BA's die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen direct worden gebruikt voor gen- en eiwitexpressiestudies. Bovendien suggereren gegevens uit deze studie dat BA's een belangrijke PDGF-bron zijn.

<table><tbody><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antigeen</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogus</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma;</td><td>LSBio</td><td>Ls-C368478</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRa</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-398206</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>R&amp;D systeem</td><td>IC6158P</td><td></td></tr><tr><td>Chemische producten en oplossingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collageenase, Type II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>1-Bromo-3-chloorpropaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B62404</td><td></td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumine (BSA)&nbsp;</td><td>Goldbio</td><td>A-421-10</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Bio Basic</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05040</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5693</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>EB0107</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15724</td><td></td></tr><tr><td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td><td>LifeSct</td><td>LS01131905Y</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride Hexahydraat</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-855</td><td></td></tr><tr><td>OneScrip Plus cDNA Synthese SuperMix</td><td>ABM</td><td>G454</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (Iodixanol)</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>AXS-1114542</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL07</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Eiwit Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-1435</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue safe Stain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagens</td><td>Life technoologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gennaam (Soort)&nbsp;</td><td>Voorwaarts</td><td>Omgekeerd</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfra (Muis)</td><td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td><td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfa (Muis)</td><td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td><td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td><td></td></tr><tr><td>36B4(Muis)</td><td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td><td>TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td><td></td></tr><tr><td>Ucp1</td><td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td><td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Toepassing</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700</td><td>Keyence</td><td>Beeldvorming bruine adipocyten</td><td></td></tr><tr><td>Magneetroerer</td><td>VWR</td><td>Dissocieer BAT</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systeem</td><td>Applied Biosystem</td><td>Kwantitatieve PCR</td><td></td></tr><tr><td>The Odyssey Fc Imaging systeem</td><td>LI-COR</td><td>Western blot beeldvorming</td><td></td></tr></tbody></table>

het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Bruin vetweefsel (BAT) is verantwoordelijk voor niet-rillende thermogenese bij zoogdieren en bruine adipocyten (BA's) zijn de functionele eenheden van BAT. BA's bevatten zowel multiloculaire lipidedruppeltjes als overvloedige mitochondriën, en ze drukken ontkoppelend eiwit 1 (UCP1) uit. BA's worden gecategoriseerd in twee subtypen op basis van hun oorsprong: embryo-afgeleide klassieke BA's (cBA's) en witte adipocyten afgeleide BA's. Vanwege hun relatief lage dichtheid kunnen BA's niet worden geïsoleerd van BBT met de traditionele centrifugatiemethode. In deze studie werd een nieuwe methode ontwikkeld om BA's van muizen te isoleren voor gen- en eiwitexpressieanalyse. In dit protocol werd interscapulair BBT van volwassen muizen verteerd met Collagenase en Dispase-oplossing en werden de gedissocieerde BA's verrijkt met 6% iodixanoloplossing. Geïsoleerde BA's werden vervolgens gelyseerd met Trizol-reagens voor gelijktijdige isolatie van RNA, DNA en eiwit. Na RNA-isolatie werd de organische fase van het lysaat gebruikt voor eiwitextractie. Onze gegevens toonden aan dat 6% iodixanol-oplossing BA's efficiënt verrijkte zonder te interfereren met follow-up gen- en eiwitexpressiestudies. Bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF) is een groeifactor die de groei en proliferatie van mesenchymale cellen reguleert. In vergelijking met het bruine vetweefsel hadden geïsoleerde BA's een significant hogere expressie van Pdgfa. Samenvattend biedt deze nieuwe methode een platform voor het bestuderen van de biologie van bruine adipocyten op een niveau van één celtype.

Bereiding van interacapulaire BBT voor isolatie van bruine adipocyten Het isolatieproces van bruine adipocyten (BA's) is weergegeven in figuur 1A. Het hele proces, van het voorbereiden van BBT- en verterings-/scheidingsoplossingen tot het verkrijgen van geïsoleerde BA's, duurt ongeveer 4 uur.
Bij volwassen muizen komt een overvloedige BAT voor in het interscapulaire gebied. Deze interscapulaire BAT (iBAT) is bedekt met spierlagen en WAT (<stron...

Deze studie beschrijft een nieuwe methode voor het isoleren van muizenbruine adipocyten voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Om de biologische aspecten van bruin vetweefsel te onderzoeken, is het essentieel om de grootte van gezuiverde bruine vetweefsel te verwijderen. Momenteel kwam er geen bruine vetgrootte zuivering en de massa's zijn beschikbaar. In deze studie hebben we een eenvoudig protocol ontwikkeld om dit probleem aan te pakken.Nu is één vaardigheid vereist voor dit protocol. Het heeft veel minder studiemateriaal nodig dan andere methoden en de gezuiverde bruine vetgrootte kan direct worden gebruikt voor gen- en eiwitexpressieanalyse. Dit protocol biedt een nieuwe methode voor het bestuderen van de biologie van de klassieke bruine vetgrootte.Het kan ook worden toegepast om het bruiningsproces van witte adipocyten te bestuderen. De procedure wordt gedemonstreerd door Amanda, een onderzoeksassistente van mijn laboratorium. Begin met het plaatsen van de kolf met BAT en de digestieoplossing op een magneetroerder met 60 omwentelingen per minuut in een incubator van 35 graden Celsius gedurende 30 minuten.Gebruik een pipet van één milliliter om de geaggregeerde weefselklompen van BAT-plakjes rond de roerstaaf te verstoren. Plaats na de vertering een zeeffilter van 70 micrometer bovenop een schone centrifugebuis van 50 milliliter en pipet ongeveer vier milliliter celsuspensie door de zeef. Was het vervolgens met vier milliliter 12% iodixanoloplossing.Pipetteer op en neer om de cellen te mengen met iodixanoloplossing en breng het celmengsel vervolgens over in twee heldere vijf milliliter polystyreen reageerbuizen. Plaats de polystyreenbuizen met het celmengsel gedurende een uur op ijs, waardoor de BA's een laag aan de bovenkant vormen. Verwijder 20 microliter van de geïsoleerde BA's voor microscooponderzoek.Pipetteer voor RNA- en eiwitisolatie de BA-laag in twee 1,7 milliliter microcenterfuge-buizen. Verwijder vervolgens voorzichtig de overmatige jododixale oplossing zonder de BA-laag te verstoren. Voeg vervolgens een milliliter TRIzol toe aan de celoplossing om tegelijkertijd RNA, DNA en eiwit te isoleren en voldoende te mengen om de cellen te lyceren.Om de fasen te scheiden, voegt u 200 microliter chloroform en centrifugeer aan de buis bij 9, 981 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gebruik na centrifugatie de waterige fase voor RNA-isolatie. Breng 300 microliter van de organische fase over in een microcentrifugebuis van twee milliliter en voeg 750 microliter 100% ethanol toe.Voeg na 10 seconden vortexen 200 microliter 1-broom-3-chloorpropaan en vortex opnieuw toe gedurende 10 seconden. Voeg 600 microliter dubbel gedestilleerd water toe voordat u gedurende 10 seconden vortext. Laat de gemengde oplossing 10 minuten op kamertemperatuur staan.Voeg na centrifugeren 9.981 G toe gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. De fasen worden gescheiden met de eiwitfase gelokaliseerd in de middelste laag. Verwijder de bovenste waterige oplossing en voeg een milliliter 100% ethanol toe aan de resterende oplossing.Na centrifugeren bij 9, 981 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, gooit u het supernatant weg en wast u de pellet met één milliliter 100% ethanol. Centrifugeer bij 9. 981 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van het supernatant droogt u de pellet gedurende 10 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur en meet u het gewicht van de natte pellet.Voeg 1% SDS-oplossing toe in een verhouding van 20 microliter per milligram pellet. Los de pellet volledig op door de buis gedurende vijf tot 10 minuten in een verwarmde shaker van 55 graden Celsius en 11 G te doen. In het protocol werd PBS met 3% BSA gebruikt om BA's van BBT te scheiden.De geïsoleerde cellen waren framboosvormig met multiloculaire lipidedruppeltjes erin en waren tdTom-positief, wat bevestigt dat ze BA's waren. Eiwit werd geïsoleerd uit de BA's met een verbeterd GTPC-protocol en werd vervolgens onderzocht met een SDS-PAGE-gel. Een dominante band geassocieerd met BSA werd waargenomen in het BA-monster, wat wijst op de interferentie ervan in eiwitextractie.Om BSA-interferentie te voorkomen, werd een 6% jodoxineale oplossing gebruikt voor de isolatie van BA's, die een typische frambozenvorm hadden en multiloculaire lipidedruppels bevatten. Eiwitten geëxtraheerd uit deze BA's werden goed gescheiden in de SDS-PAGE gel. Deze cellen bleken tdTomato-positief te zijn, terwijl cellen die uit de pellet werden teruggevonden tdTomato-negatief waren zonder duidelijke lipidedruppels, wat een efficiënte scheiding van de BA's van de niet-vetcellen suggereert.In genexpressieanalyse waren de mRNA-niveaus van UCP1 en PDGFA significant hoger in de geïsoleerde BA's. Maar het mRNA van PDGFRA werd alleen gedetecteerd in BAT. UCP1-eiwit werd verrijkt aangetroffen in geïsoleerde BA's.EDGFR-alfa werd gedetecteerd in BBT, maar niet in geïsoleerde BA's. Deze resultaten bevestigen de efficiëntie van de methode voor het isoleren van BA's en tonen aan dat de geïsoleerde BA's geschikt zijn voor gen- en eiwitexpressiestudies. Gebruik bij het proberen van dit protocol een verse verteringsbuffer om bruin vetweefsel te dissociëren en weefselklompvorming tijdens de spijsverteringsperiode te voorkomen.Deze nieuwe methode maakt het gemakkelijk om de biologie van bruin vetweefsel op een enkelcellig tapniveau te onderzoeken. Door deze methode toe te passen, kan men GN- en eiwitexpressiestudies uitvoeren met zuiver bruine adipocyten die precies het genexpressieprogramma van bruine adipocyten ontleden, zonder zich zorgen te maken over besmetting die oorspronkelijk afkomstig is van vetvrije cellen.

isolating-brown-adipocytes-from-murine-interscapular-brown-adipose

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van "bruinen" van wit vet te bestuderen.

Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

Als gevolg van de drastische en negatieve verband tussen obesitas en andere comorbiditeiten, onderzoek naar de rol vetweefsel speelt bij de ziekte en de algehele gezondheid gerechtvaardigd is. We presenteren een protocol voor isolatie en excisie van vet depots waardoor de studie van adipose gebruik in situ en in vitro methoden.

Lokalisatie, identificatie, en Excisie van Muriene Adipose Depots

Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door high-throughput DNA sequentiebepaling (ChIP-seq) van bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Dit protocol is geschikt voor zowel mapping histone modificaties en genoom-brede lokalisatie van niet-Histon proteïnen van belang in vivoonderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel

Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier bieden we een praktische procedure voor het ontleden en uitvoeren van histologische en genexpressie-analyses van supraclaviculair bruin vetweefsel bij muizen.

Dissectie, histologische verwerking en genexpressieanalyse van supraclaviculaire bruine vetweefsel bij muizen

Dit document beschrijft de methodologie om de chemotactische respons van leukocyten aan specifieke liganden bepalen en interacties tussen de receptoren op het celoppervlak en cytosolische eiwitten met behulp van live-cell imaging technieken.

Real-time beeldvorming van leukotriënen B 4 Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine

Leer een efficiënte methode voor het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel met behulp van enzymatische digestie en iodixanol-gebaseerde dichtheidsscheiding.

Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

Meer video's verkennen