Natural Killer (NK) en CAR-NK-celuitbreidingsmethode met behulp van membraangebonden-IL-21-gemodificeerde B-cellijn

Dit protocol kan de uitbreiding van functionele, niet-uitputtende, geheugenachtige NK-cellen ex vivo aanzienlijk verbeteren in vergelijking met andere feedercellen op basis van een expansiesysteem. Dit is een eenvoudigere methode in vergelijking met andere protocollen met feedercellen waarin we de NK-celisolatiestap overslaan voorafgaand aan NK-celexpansie. Dit protocol kan een voldoende aantal NK-cellen en CAR-NK leveren voor immunotherapie.

Deze techniek is zeer reproduceerbaar. Het gebruik van verse, nieuwe uitgangsmaterialen en het niet verstoren van de NK-cellen tijdens de eerste paar dagen van expansie is echter cruciaal. Begin met het identificeren en doorsnijden van de levensvatbare weefselgebieden met behulp van steriele chirurgische apparatuur om lymfocyten te verkrijgen.

Plaats vervolgens de doorsneden weefsels in 30 milliliter HBSS zonder calcium of magnesium en houd het weefsel op ijs totdat het klaar is voor isolatie. Werk in een bioveiligheidskast en gehakt het weefsel in blokjes van minder dan 0,5 centimeter met steriele scheermesjes en tangen. Plaats de gehakte stukjes weefsel, niet meer dan 4 gram, in de weefseldissociatorbuizen en voeg 10 milliliter collagenase IV toe aan de weefselstukken.

Om het weefsel grondig te hakken, behandelt u de weefseldissociatorbuizen in een weefseldissociator bij 37 graden Celsius. Nadat u de buisjes uit de weefseldissociator hebt verwijderd, triturateert u het gehakte weefsel door een nylon celzeef van 40 micron met behulp van de achterkant van een spuit van 5 milliliter. Gooi de grote onverteerde fragmenten weg.

Spin het verzamelde eluent op 400G gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en aspirateer het supernatant voordat de celpellets worden geresuspendeerd in 30% polyvinylpyrrolidon-gecoat silica om de vetcellen te verwijderen. Spin de cellen zoals beschreven voor het resuspenderen van de celpellet in 9 milliliter R-10 media. Om lymfocyten te scheiden van rode bloedcellen en polymorfonucleaire cellen, moet u de celsuspensie zorgvuldig over 4 milliliter Ficoll- of lymfocytenscheidingsmedia leggen.

Scheid de lagen door centrifugeren op 400G gedurende 23 minuten bij kamertemperatuur met de acceleratie en remmen uit. Decanteer vervolgens voorzichtig de bovenste-middellange laag en oogst de interfase met weefselinfiltrerende lymfocyten. Spoel de cellen met 10 milliliter media en ga verder voor analyse of primaire natuurlijke killer, of NK, celuitbreidingsprotocol.

Was de perifere bloedmononucleaire cellen, of PBMC's, en 100 gamma-bestraalde 221-mIL-21 cellen afzonderlijk door centrifugatie bij 400G gedurende 5 minuten met 10 milliliter R-10 media. Bewaar na centrifugatie 1 x 10 tot de 6e PBMC's voor flowcytometrie en meng 5 x 10 tot de 6e PBMC's met 10 x 10 tot de 6e 100 gamma-bestraalde 221-mIL-21 cellen in een speciale 6-well plaat. Voeg 30 milliliter R-10 media aangevuld met menselijk interleukine-2 en menselijk interleukine-15 toe aan dezelfde 6-wellsplaat en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide, waarbij de media elke 3 tot 4 dagen worden vervangen.

Terwijl u in incubatie bent, registreert u de totale perifere natuurlijke bloeddoder, of PBNK, levensvatbaarheid van het celnummer en voert u elke 3 tot 4 dagen flowcytometrie uit om de NK-celexpansiesnelheid te berekenen. Voeg 1,8 x 10 toe aan de 6e 293T-cellen in 11 milliliter van de D-10-media per behandelde 100 millimeterplaat en incubeer 293T-cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Meng in een buis van 1,70 milliliter 470 microliter van de gereduceerde serummedia met 30 microliter van het transfectiereagens.

Voeg in een aparte buis van 1,70 milliliter 2,5 microgram pRDF-plasmide, 3,75 microgram Pegpam3-plasmide en 2,5 microgram CAR-construct in SFG-vector toe aan de gereduceerde serummedia om het uiteindelijke volume van 500 microliter te maken. Meng de inhoud van de buis met de eerder op druppelsgewijze wijze bereide buis van 1,70 milliliter. Voeg na 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur 1 milliliter van het mengsel uit de buis toe aan de 293T-celplaat op een druppelsgewijze manier en plaats de plaat op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 48 tot 72 uur.

Verdun het retronectine-eiwit met PBS tot een eindconcentratie van 50 tot 100 microgram per milliliter. Voeg 500 microliter van de verdunde retronectine toe aan elk putje van een onbehandelde 24-wellsplaat. Sluit vervolgens de plaat af met parafilm en incubeer de plaat 's nachts op 4 graden Celsius.

Centrifugeer de volgende dag de retronectineplaat op 2, 103G gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius en gooi het supernatant weg. Na het blokkeren van elke put van de 24-well plaat met 1 milliliter R-10 medium, incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 1 uur. Filter de eerder getransfecteerde 293T-cellen met behulp van een filter van 0,45 micron om het retrovirus-supernatant te verzamelen.

Aliquot 2 milliliter van het gefilterde retrovirus supernatant in elk putje van de 24-well retronectineplaat. Centrifugeer de 24-well retronectineplaat op 2, 103G gedurende 2 uur in een voorverwarmde centrifuge bij 32 graden Celsius. Terwijl de platen worden gecentrifugeerd, verzamelt u de uitgebreide PBNK-cellen vanaf dag 0 en telt u de cellen met Trypan Blue.

Verdun de geëxpandeerde PBNK-cellen met R-10 media aangevuld met interleukine-2 en interleukine-15 tot de concentratie van 2,5 x 10 tot de 5e tot 5 x 10 tot de 5e cellen per milliliter. Na centrifugatie van de 24-well retronectineplaat, aspirateer het retrovirus supernatant gedeeltelijk uit elke put. Voeg vervolgens 2 milliliter van de verdunde geëxpandeerde PBNK-cellen toe aan elke put.

Centrifugeer de plaat op 600G gedurende 10 minuten bij 32 graden Celsius voordat u de plaat gedurende 48 tot 72 uur bij 37 graden Celsius incubeert met 5% koolstofdioxide. Breng de cellen van de 24-wells plaat over in een centrifugebuis van 50 milliliter om de buis gedurende 5 minuten op 400G te centrifugeren. Breng na resuspendatie van de pellet met 1 milliliter R-10-media de geresuspendeerde cellen over naar een speciale 6-wellsplaat met 30 milliliter R-10-media aangevuld met interleukine-2 en interleukine-15.

Incubeer de speciale 6-well plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met verfrissende media en bereken de NK-celexpansiesnelheid elke 3 tot 4 dagen. De PBNK-cellen die met 221-mIL-21 werden uitgebreid, bleken bijna 5 x 10 tot de 4e vouwen uit te breiden. En de NK-celzuiverheid werd gedurende de 21-daagse expansie op ongeveer 85% gehandhaafd.

Voorafgaand aan de uitbreiding werd de robuustheid van het 221-mIL-21 expansiesysteem onderzocht door PBMC's te kleuren voor anti-CD56 en anti-CD3, die een celzuiverheid van 7,09% voor NK-cellen en een hoog percentage T-cellen vertoonden. Op dag 4 van PBMC's en 221-mIL-21 cocultuur werd de NK-zuiverheid gecontroleerd vóór car-nk-transductie. De CAR-NK-cellen gekleurd voor anti-CD56, anti-CD3 en anti-human-IgG vertoonden een hoge NK-celpopulatie op dag 7 en een hoge CAR-transductie-efficiëntie van ongeveer 70% werd waargenomen.

Op de 18e dag werd de CAR-expressie in verschillende subgroepen gecontroleerd met flowcytometrie. Na NK-celexpansie kunnen cellen worden gebruikt voor in-vitro functionele assays of voor in-vivo experimenten. Onderzoekers kunnen dit protocol gebruiken om NK en CAR-NK uit te breiden voor patiënten met functionele NK-deficiëntie en andere soorten, zoals honden.