Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Dit protocol schetst de bereiding van glasvochtlamellen van met Plasmodium-falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen voor cryo-elektronentomografie. Dit maakt directe observatie van gedetailleerde structurele informatie mogelijk over hoe de parasiet malaria veroorzaakt. Cryo-elektronentomografie registreert informatie met hoge resolutie over de binnenkant van cellen.

Het is krachtig genoeg om afzonderlijke eiwitcomplexen in situ te observeren, die computationeel kunnen worden geëxtraheerd en gemiddeld om driedimensionale structurele informatie over eiwitten te onthullen. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende celtypen en kan een startpunt zijn voor iemand die nieuw is in het produceren van glasvochtlamellen voor cryo-elektronentomografie. Dit is Alejandra Carbajal, die het protocol vandaag zal uitvoeren.

Om te beginnen, zeef de bevroren koperen roosters met behulp van een CryoStage voor een lichtmicroscoop met bijzondere aandacht voor de gradiënt van ijs over het raster. Controleer individuele rastervierkanten voor celdekking in de dunnere gebieden van ijs. Gebruik een zwarte onuitwisbare marker om de voorkant en de andere kant van Cryo-FIB-SEM-specifieke Autogrid-velgen te markeren.

Laad het geknipte raster in de Cryo-FIB-SEM-shuttle met de koolstofzijde naar boven en breng een vier nanometer dikke koolstof- of platina e-beam roterende laag aan op het oppervlak van de cellen. Laad de shuttle in de Cryo-FIB-SEM en beoordeel de celverdeling op elk net per SEM op vijf kilovolt. Neem een overzicht van lage vergrotingen bij 100 vermogen om ijsgradiënten over het raster te bekijken.

Maak vervolgens afbeeldingen met een hogere vergroting met een vermogen van 5.000 om naar afzonderlijke rastervierkanten te kijken. Breng een organoplatinumlaag van twee micrometer aan op het oppervlak van elk rooster door de naald van het gasinjectiesysteem in de kamer boven het rooster te steken en de organoplatinum-bron gedurende een bepaalde tijd tot een ingestelde temperatuur te verwarmen om een dampstroom te produceren. Om het monster te observeren, kantelt u het monster zodat het vlak van het raster zich ongeveer 10 graden van de invalshoek van de ionenbundel bevindt en verplaatst u het midden van een geschikt rastervierkant dat te zien is in zowel de SEM- als de FIB-afbeeldingen.

met behulp van de ionenbundel bij lage stroom, Onderzoek het raster met een hoge vergroting om de cellen in het midden van een rastervierkant te visualiseren. Markeer twee rechthoekige patronen om te frezen, één boven en één onder een drie micrometer dik beschermd gebied. Kies vervolgens de bundelinstellingen en corrigeer astigmatisme door de helderheid en het contrast aan te passen.

nadat de installatie is voltooid, begint u met frezen met een stroom van 300 picoampères terwijl u de live voortgang in de ionenbundelweergave en met tussenpozen door SEM bewaakt. Het monster wordt gecontroleerd in de SEM-weergave en na het eerste frezen, Als de ionenbundel niet door het monster boven en onder het beschermde gebied is gebroken, verwijdert u meer materiaal door de hoogte van de rechthoekige patronen te vergroten. Stop met frezen wanneer het oppervlak boven en onder de lamellen volledig glad is in het zicht van de ionenbundel.

Herhaal het freesproces stapsgewijs, waarbij de ionenstraalstroom elke keer wordt verminderd totdat een dikte van 300 nanometer is bereikt. Noteer de X Y Z-positie van elke lamellen. Om de lamellen aan het einde van het experiment te polijsten, gebruikt u een SEM-overzicht met lage vergroting om een groep lamellen te selecteren die moet worden gepolijst en de polijstwortel te markeren.

Zodra de polijstwortel is gemarkeerd, vermindert u de ruimte tussen de twee rechthoekige patronen tot 100 tot 200 nanometer en begint u met het polijsten bij een ionenbundelstroom van 30 picoampère. Bewaak de voortgang door SEM op twee tot drie kilovolt. Stop met polijsten wanneer het contrast in de lamellen verloren gaat door SEM of wanneer de organoplatinum vacht of de lamellen zelf integriteit beginnen te verliezen.

Verkrijg en bewaar SEM-beelden met lage vergroting van elke lamellen. Na voltooiing van het experiment verwijdert u de shuttle uit de microscoop. Verwijder de roosters met lamellen en bewaar ze onder vloeibare stikstof.

Ga voorzichtig om met de roosters. Om de morfologie te bestuderen, werden de schizonten in verschillende stadia van uitgang vastgelopen met behulp van verbinding twee in E-64-remmers. In aanwezigheid van verbinding twee was de grens tussen de parasitofore membranen en het omringende hemoglobine in de rode bloedcel van de gastheer goed gedefinieerd.

De intacte parasitofore vacuole, of PV's, zaten vol met merozoïeten in een enkele cluster van hemozoïnekristallen. Toen verbinding twee gesynchroniseerde schizonten in E-64 werden gewassen, werd het PV-membraan gescheurd en verspreidden de merozoïeten zich binnen de RBC. Een typisch voorbeeld van goede celverdeling op een koperen rooster toont grote rode bloedcellen met een goed gedefinieerde periferie en een intact vacuole membraan.

Binnen een gedeeltelijk ingeklapte rode bloedcel van de gastheer werden de individuele merozoïeten gevisualiseerd als kleine celclusters. Elke schizont had een zwarte vlek in het midden die de positie van de hemozoïnekristallen aangaf. Na het frezen werden de roosters in de TEM geladen om de posities van de lamellen te identificeren en geschikte gebieden te vinden om door tomografie te targeten.

In de monstermicrograaf is een RBC te zien die onlangs was binnengedrongen door een merozoiet. Het merozoiet omgeven door het van gastheercellen afgeleide membraan was te zien binnen de grens van de RBC. Aan het apicale uiteinde van het merozoliet waren de twee membranen rond de cel en vier membranen gestapeld in de top van het merozoiet geassocieerd met een elektrondicht paddestoelvormig kenmerk duidelijk zichtbaar.

Binnen het cytoplasma van het merozoiet werd een fusiegebeurtenis tussen het merozoietplasmamembraan en een meerlagig blaasje geïdentificeerd. In een aanvullende TEM-analyse van een 230 nanometer dikke lamellen werd de typische morfologie van een volwassen merozoiet behandeld met E-64 waargenomen. Binnen het membraan van de rode bloedcellen kan het membraan van merozietplasma worden gezien met organellen zoals het binnenmembraancomplex, polaire ringen, micronemen, roptries en de nucleaire envelop.

Het belangrijkste onderdeel van deze techniek is het optimaliseren van de roosters om reproduceerbare en efficiënte productie van dunne lamellen mogelijk te maken. Verdere ontwikkeling van deze techniek zal onderzoekers in staat stellen om enkelvoudige eiwitmoleculen in malariaparasieten te visualiseren en hun rol in malaria-uitgang te bepalen.