Name: Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer lamellen bereiden van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde erytrocyten voor cryo-elektronentomografie. Deze methode maakt hoge-resolutie structurele analyse van malariaparasieten in rode bloedcellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd geheel of gedeeltelijk gefinancierd door de Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Met het oog op open toegang heeft de auteur een CC BY publieke auteursrechtlicentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortvloeit uit deze inzending.
Dit project waarvoor deze methode werd ontwikkeld, werd gefinancierd door een Medical Research Council-subsidie MR / P010288 / 1 toegekend aan Helen R. Saibil, Roland A. Fleck en Michael J. Blackman. Culturen van P. falciparum werden gekweekt in het Francis Crick Institute, met de steun van leden van de groep van Michael J. Blackman. De auteurs willen Dr. Ser Ying (Michele) Tan bedanken voor het verstrekken van de afbeeldingen van met verbinding 2 en E64 behandelde schizonten in dunne bloeduitstrijkjes. De meeste lamellen werden geproduceerd met ondersteuning van het personeel van eBIC en we zijn dankbaar voor de toegang tot de Scios dual-beam cryoFIB-SEM op onderzoeksvoorstel NT21004. De auteurs erkennen ook de steun van het Royal Society Industry Fellowship-programma (INF \ R2 \ 202061) bij het voortzetten van de ontwikkeling van de FIB-freestechniek binnen de CUI. De auteurs willen ook Helen R. Saibil bedanken voor de nuttige discussies met betrekking tot dit methodedocument en het begeleiden van het project.

Menselijk bloed werd verkregen van geanonimiseerde donoren via de Britse National Blood and Transplant service en wordt binnen 2 weken na ontvangst gebruikt. Er is geen ethische goedkeuring vereist voor het gebruik ervan.
1. Bereiding en ondervriezing van met Plasmodium falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen
<ol><li>Isoleer volwassen schizonts door centrifugatie (1.580 x g) over een 70% (v/v) isotone dichtheidsgradiëntmedium (voor standaardprocedures voor het kweken van ongeslachtelijke bloedstadia van 3D7 Plasmodium falciparum in menselijke erytrocyten zie Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>Bevestig de aan de lucht gedroogde dunne bloedfilms op een glasglaasje met 100% methanol om de morfologische homogeniteit van de schizonten te controleren voordat u kleurt met 10% Giemsa-vlek in 6,7 mM fosfaatbuffer, pH 7,1. OPMERKING: Om de voorbereiding voor schizonts die vastlopen op specifieke punten van uitgang te verrijken, kunnen schizonts verder worden gesynchroniseerd met samengestelde 2- en E64-remmers (zie Representatieve resultaten en Figuur 1 voor een uitleg van het effect van deze remmers). LET OP: Plasmodium falciparum is een pathogeen voor de mens en mag alleen worden behandeld in een geschikte inperkingsfaciliteit volgens de lokale gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen.</li>
	<li>Centrifugeer schizonts (240 x g) voorzichtig om ze te pelleteren en resuspendien in 2x volume van de celpellet van RPMI-media, wat resulteert in een 50% hematocrietsuspensie.</li>
	<li>Breng op een handmatige duikvriesinstallatie 2,5 μL schizonts aan op de koolstofzijde van een gloeiontladen (gebruik instellingen van de gloeiontladingseenheid van 60 s, 30 mA in lucht, waarbij alleen de koolstofzijde van het rooster wordt behandeld) 200 mesh koperen rooster met een 2/4 gatachtige koolstoffilm en dep gedurende ~ 20 s vanaf de achterkant van het rooster met behulp van filterpapier van klasse 1 met een gescheurde rand. Duik in vloeibaar stikstofgekoeld vloeibaar ethaan en breng de roosters over naar opslag (zie tabel met materialen voor apparatuur die in dit onderzoek wordt gebruikt). OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd en rasters kunnen voor onbepaalde tijd onder vloeibare stikstof worden opgeslagen. LET OP: Vloeibare stikstof is een verstikkend middel en veroorzaakt bevriezing; Ga voorzichtig om in een geschikte omgeving met zuurstofbewaking. LET OP: Vloeibaar ethaan veroorzaakt ernstige brandwonden en is ontvlambaar; Gebruik in een zuurkast uit de buurt van ontstekingsbronnen. OPMERKING: Diepgevroren schizonts zijn niet langer levensvatbaar. Dit werd bepaald door menselijk bloed te incuberen met verschillende gouden roosters van lucht-ontdooide diepgevroren schizonts en geen parasietgroei na enkele dagen te observeren, in vergelijking met niet-bevroren controles. Bevroren roosters van schizonts zijn daarom veilig te hanteren buiten de containmentfaciliteiten met behulp van normale veiligheids- en decontaminatieprocedures (handschoenen, sterilisatie van oppervlakken / gereedschappen met >70% ethanol en verwijdering van roosters in >70% ethanol).</li>
	<li>Schermrasters met behulp van een cryo-trap voor een lichtmicroscoop, met bijzondere aandacht voor de gradiënt van ijs over het raster. Controleer in de dunnere delen van ijs individuele rastervierkanten op celdekking. OPMERKING: De beste vierkanten moeten één cel dik zijn in het midden van het rastervierkant (figuur 2). Dit zorgt ervoor dat een lamellen over het midden van het vierkant gefreesd kunnen worden zonder het dikkere ijs aan de randen tegen de roosterbalken te raken. Het experiment kan hier worden gepauzeerd en roosters kunnen voor onbepaalde tijd onder vloeibare stikstof worden opgeslagen. Als cellen een fluorescerende marker dragen, kunnen roosters ook worden gescreend door cryoCLEM om X / Y-posities van belang te lokaliseren, die kunnen worden gecorreleerd met rasterlocaties in de cryoFIB-SEM om direct te frezen.</li>
</ol>2. On-grid FIB-frezen van diepgevroren cellen
<ol><li>Markeer de voorkant van cryoFIB-specifieke autogrid-velgen met een zwarte onuitwisbare markeerstift om het midden van het weggesneden gedeelte en de andere kant van de velg aan te geven (figuur 3). Stel het knipstation in en knip de rasters in de gemarkeerde ringen met de carbon kant naar beneden.</li>
	<li>Laad roosters in de cryoFIB-SEM shuttle (meestal 2 roosters, afhankelijk van de shuttle) koolstofzijde naar boven en breng een platina sputterlaag aan in een argonatmosfeer (5 x 10-2 mbar) (5 mA voor 60 s - dikte is variabel) of een koolstof / platina e-beam roterende laag (~ 4 nm dikte) op het oppervlak van de cellen. OPMERKING: Beide soorten coatings helpen de ladingsdispersie tijdens SEM-beeldvorming. Het voordeel van de e-beam roterende coater is dat de exacte dikte van de coating kan worden gespecificeerd.</li>
	<li>Laad de shuttle in de cryoFIB-SEM en beoordeel de celverdeling op elk rooster door SEM bij 5 kV (13 pA of 25 pA). Neem een overzicht van lage vergrotingen (~ 100x) om ijsgradiënten over het raster te bekijken. Maak vervolgens afbeeldingen met een hogere vergroting (~ 5.000x) om naar individuele rastervierkanten te kijken en de gebieden van het raster te identificeren met zichtbare cellulaire kenmerken en lage oppervlakteverontreiniging om te frezen.</li>
	<li>Breng een organoplatinumlaag van >2 μm aan op het oppervlak van elk rooster met behulp van het gasinjectiesysteem (GIS). Om dit te doen, steekt u de GIS-naald in de kamer boven het rooster en verwarmt u de organoplatinum-bron tot een ingestelde temperatuur gedurende een ingestelde tijd (bijvoorbeeld ~ 27 ° C voor 3-10 s) om een dampstroom te produceren. OPMERKING: De aanbrenghoek, temperatuur en timing van de organoplatinum-laag via de GIS-naald moeten worden geoptimaliseerd om een gelijkmatige coating te maximaliseren. Dit is afhankelijk van de specifieke cryoFIB-SEM die wordt gebruikt (zie Representatieve resultaten voor verdere uitleg).</li>
	<li>Kantel het monster zodat het vlak van het raster ~10° is ten opzichte van de invalshoek van de ionenbundel en verplaats het midden van een geschikt rastervierkant dat te zien is in zowel de SEM- als de FIB-afbeeldingen.</li>
	<li>Onderzoek het raster met behulp van de ionenbundel bij lage stroom (nominaal 1,5 pA, 30 kV) en ga naar een voldoende hoge vergroting (~ 7.000x) om de cellen in het midden van een rastervierkant te visualiseren. Breng het monster in beeld bij de eerste maalstroom (300 pA) en corrigeer voor astigmatisme. Pas de helderheid en het contrast aan en markeer vervolgens twee rechthoekige patronen om te frezen, een boven en een onder een 3 μm dik beschermd gebied, waarvan het midden de gewenste locatie van de uiteindelijke lamellen is. OPMERKING: De gekozen breedte van de patronen is afhankelijk van de topografie van de omringende cellaag en de celgrootte. 7-20 μm is een geschikte breedte voor schizonts, maar bredere lamellen doen er langer over om te frezen. De gekozen hoogte van de patronen voor de eerste freesstap is afhankelijk van de dikte van het monster, beginnend rond 6 μm; Dit kan tijdens het frezen moeten worden aangepast. Frezen wordt gericht uitgevoerd vanaf de buitenste boven- en onderrand van de patronen naar het gezicht van de lamellen. Dit kan parallel worden gedaan, waarbij beide patronen gelijktijdig of sequentieel worden gefreesd, waarbij eerst materiaal van boven de lamellen en vervolgens van onderaf wordt verwijderd.</li>
	<li>Begin met frezen bij de eerste stroom; bewaak de live voortgang in de ionenbundelweergave en met tussenpozen via SEM (5 kV, 13 of 25 pA). Controleer of de ionenbundel door het monster boven en onder het beschermde gebied is gebroken. Zo niet, verhoog dan de hoogte van de rechthoekige patronen om meer materiaal te verwijderen. Stop wanneer het oppervlak boven en onder de lamellen volledig glad is in het zicht van de ionenbundel. OPMERKING: De ionenbundel is door het monster boven en onder het beschermde gebied gebroken wanneer de binnenkant van de rechthoekige patronen geen kenmerken in het brandpuntsvlak bevat. Sommige functies, zoals rasterbalken, zijn mogelijk onscherp zichtbaar op de achtergrond.</li>
	<li>Overschakelen naar de volgende freesstroom (100 pA); scherpstellen en de helderheid/het contrast aanpassen. Verklein de ruimte tussen de twee rechthoekige patronen tot 1,5 μm en verlaag de patroonhoogte om alleen het niet-gefreesde materiaal te bedekken. Begin met frezen bij de nieuwe stroom totdat het oppervlak boven en onder de lamellen volledig glad is.</li>
	<li>Herhaal dit proces stapsgewijs totdat een dikte van 0,3 μm is bereikt, waarbij de ionenbundelstroom telkens wordt verminderd volgens het freesschema in tabel 1.</li>
	<li>Fres verschillende lamellen (de hoeveelheid is afhankelijk van de dikte van het monster en de beschikbare tijd) op een of beide roosters tot een dikte van 0,3 μm, noteer de X/Y/Z-positie van elke lamellen en reserveer ~1-2 uur aan het einde van de sessie om de lamellen tot hun uiteindelijke dikte (60-200 nm) te polijsten.</li>
	<li>Neem een SEM-overzicht met lage vergroting van het hele raster en plan een polijstroute vanaf lamellen aan de voorkant van het rooster (dichter bij de ionenbundelbron) tot lamellen aan de achterkant van het raster (het verst verwijderd van de ionenbundelbron) (figuur 5). OPMERKING: Dit vermindert de herplaatsing van geableerd materiaal terug op het oppervlak van gepolijste lamellen.</li>
	<li>Verklein de ruimte tussen de twee rechthoekige patronen tot 100-200 nm en begin met de laatste polijststap bij een ionenbundelstroom van 30 pA. Bewaak de voortgang door SEM bij 2-3 kV (13 pA, verblijf = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s voor een volledig frame) en stop met polijsten wanneer het contrast verloren gaat in de lamellen door SEM of wanneer de organoplatinum laag van de lamellen zelf integriteit begint te verliezen.</li>
	<li>Voordat u de rasters verwijdert, verkrijgt u een SEM-afbeelding met lage vergroting van het hele raster en slaat u afbeeldingen van elke lamellen op. Gebruik ze om het raster later in de TEM te controleren. Pauzeer het experiment hier en bewaar de roosters met lamellen onder vloeibare stikstof - behandel het met zorg. OPMERKING: Rasters kunnen licht sputteren bij verwijdering van de cryoFIB-SEM, wat kan helpen bij het beperken van drift en opladen in de TEM bij hoge vergroting, maar dit moet voorzichtig worden gedaan omdat te veel sputtercoating de biologische inhoud in de lamellen kan verbergen. Het is mogelijk om lamellen in dit stadium te screenen op fluorescentie; Het verkrijgen van voldoende signaal hangt echter af van de overvloed van het gelabelde eiwit binnen de dikte van de lamellen. Er moet grote zorg worden besteed aan het omgaan met de roosters om schade aan de lamellen te beperken en oppervlakteverontreiniging te voorkomen.</li>
</ol>3. Tilt-serie acquisitie en algemeen overzicht van gegevensverwerking
<ol><li>Laad de roosters in de TEM en lijn de freesrichting loodrecht op de kantelas van het podium uit. OPMERKING: Het uitlijnen van de roosters gebeurt met het oog met behulp van de markeringen op de autogrid-velg. Een foutmarge van ~10° is acceptabel, anders kunnen de wanden van de geul aan weerszijden van de lamellen de lamellen verduisteren als het rooster wordt gekanteld.</li>
	<li>Verkrijg een kaart met lage vergroting (~ 150x) van het hele raster en lokaliseer de lamellen; Verkrijg vervolgens een middelgrote vergrotingskaart (~ 1.500x, afhankelijk van de lamellengrootte) van elke lamellen en lokaliseer de interessegebieden.</li>
	<li>Kantel het rooster ±10° om het vlak van de lamellen (niet het rooster) loodrecht op de optische as te maken OPMERKING: De richting van de voorkanteling kan worden bepaald door de positie van de voorrand van de lamellen (op zoek naar de overgebleven organoplatinum-laag) in de lage en gemiddelde vergrotingskaarten. Voor de TEM die hier wordt gebruikt, vereisen rasters een +10 ° voorkanteling als de voorranden van de lamellen omhoog wijzen in de kaarten en vereisen een -10 ° voorkanteling als ze naar beneden wijzen. Elk raster kan anders zijn vanwege de manier waarop ze zijn opgepikt en in de autoloader zijn geplaatst.</li>
	<li>Verkrijg dosissymmetrische tilt-serie38 (bijvoorbeeld -54° tot +54° met een toename van 3-5°) bij een pixelgrootte die zowel het gezichtsveld als de resolutie mogelijk maakt die vereist zijn voor het betreffende gebied. Gebruik een bereik van onscherptewaarden tussen -2 en -5 μm. Verzamel films met 3-10 frames bij elke stap en pas hiervoor deze parameters aan afhankelijk van de pixelgrootte om een totale dosis van ~ 150 e-/Å2 (voor een TEM van 300 kV) te accumuleren. OPMERKING: Scheuren in de lamellen moeten worden vermeden omdat deze regio's kunnen afdrijven. Oppervlakteverontreiniging moet ook worden vermeden, omdat dit het interessegebied of het focusgebied bij hoge kanteling kan verduisteren.</li>
	<li>Corrigeer de films met een programma zoals MotionCor239. Pas een dosiswegingsfilter toe op de gecorrigeerde afbeeldingen (geaccumuleerde e-/afbeelding)40 en schat de onscherpte van elke afbeelding met behulp van een programma zoals CTFFIND441.</li>
	<li>Gebruik fiduciele-loze uitlijning (patch tracking) in een programma zoals at etomo (IMOD)42 om de uitlijning en hoekrelatie van de beelden in tilt-series te berekenen.</li>
	<li>Voer de uitlijnings- en rotatiegegevens samen met de onscherptewaarden in een programma in dat driedimensionale CTF-correctie kan toepassen, bijvoorbeeld NovaCTF43. Bereken een gecorrigeerd tomogram om outputtomogrammen te krijgen met binningfactoren die relevant zijn voor downstream-analyse.</li>
	<li>Analyseer de reconstructies en bereid u voor op eventuele downstream-verwerking, bijvoorbeeld filtering, segmentatie of sub-tomogrammiddeling.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Terwijl cryoFIB-frezen steeds routineuzer wordt, is de voorbereiding van optimale monsters voor het frezen dat niet; daarom vinden de meeste kritieke stappen in dit protocol plaats voordat het monster de cryoFIB-SEM bereikt. Monsteroptimalisatie door meerdere rondes celvoorbereiding, dompelbevriezing en screening door licht- en elektronenmicroscopie zijn vereist om het best mogelijke monster te produceren voordat het frezen wordt geprobeerd. Het hebben van de best mogelijke steekproef verhoogt niet alleen de kans op succes, maar optimaliseert ook het gebruik van de apparatuur. Om deze reden vereisen de meeste nationale faciliteiten bewijs dat er voldoende optimalisatie is uitgevoerd voordat tijd op hun machines wordt toegekend. Eenmaal in de cryoFIB-SEM is het maximaliseren van de effectiviteit van de organoplatinum-laag van cruciaal belang om uniform dunne lamellen te produceren. Ten slotte is geduld en een goede monsterbehandeling een vereiste vaardigheid van de gebruiker, die meerdere dagen moet zitten om roosters met delicate lamellen te produceren en vervolgens over te brengen. Dit kan veranderen met de introductie van geautomatiseerde freesstrategieën47,48, maar vooralsnog is het hele freesproces bij de meeste faciliteiten nog grotendeels handmatig.
Hoewel het werk zich uitsluitend richtte op P. falciparum schizonts, kon de hier gepresenteerde methode gemakkelijk worden aangepast om de rastervoorbereiding en het frezen voor andere celtypen te optimaliseren. Belangrijke factoren om te overwegen zijn de dichtheid van de cellen die op het rooster worden toegepast, het rastertype (koper is giftig voor sommige cellen), de grootte en afstand van gaten in de koolstoffilm, de blottingtijd en de methode van blotting (enkel/ dubbelzijdig, handmatig of geautomatiseerd). Bovendien, als de cellen worden gekweekt op de roosters (meestal gouden roosters met een gatachtige koolstoffilm), kan de samenvloeiing worden gecontroleerd door lichtmicroscopie voordat ze worden gevlekt en bevroren. De freesstrategie hangt af van hoe de cellen op het rooster worden afgezet. Voor met malaria geïnfecteerde rode bloedcellen is het rooster in wezen bedekt met een ononderbroken laag cellen, dikker in sommige gebieden en dunner in andere gebieden. Het frezen wordt uitgevoerd op meerdere punten op één gebied langs deze gradiënt waar de ijsdikte lamellen genereert die een geschikte grootte hebben voor tomografie. Deze aanpak werkt goed voor kleinere cellen, omdat je lamellen kunt produceren die een plak door meerdere cellen bevatten. Voor grotere cellen of klonten cellen kan het zijn dat één cel of celklomp één lamellen kan produceren.
Rasterverwerking en monsteroverdracht blijven een van de belangrijkste uitdagingen van deze workflow. Lamellen kunnen verloren gaan als gevolg van breuken of scheuren, gordijnartefacten die de biologie verduisteren, overmatige oppervlakteverontreiniging, evenals rasteroriëntatieproblemen binnen de TEM, waardoor een extra handlingstap nodig is om het raster te herpositioneren. De mate van verliezen varieert van dag tot dag en van net-tot-net, maar het wordt verbeterd door oefening en hanteringservaring in de loop van de tijd. In deze studie bleek dat de roosters meerdere keren zorgvuldig kunnen worden geheroriënteerd in de autoloader zonder lamellen te vernietigen en dit heeft soms het voordeel van het afwassen van oppervlakte-ijs. Een andere belangrijke beperking van deze workflow is de tijd die nodig is om lamellen te produceren. Omdat de productie traag is, is het van cruciaal belang om een goed geoptimaliseerd monster te hebben, waardoor het frezen zo efficiënt mogelijk is.
Onlangs zijn een aantal aanpassingen aan het FIB-malen van glasvochtmonsters ingevoerd. Een game-changer is de implementatie van cryogeen gekoelde lift-out tools in de cryoFIB-SEM-kamer waarmee grotere blokken materiaal kunnen worden gefreesd uit hogedrukbevroren monsters. De blokken kunnen aan een metalen staaf worden bevestigd of in een grijper worden opgepakt en naar een tweede monsterpositie worden verplaatst, met een speciaal aangepast EM-rooster. De blokken kunnen vervolgens worden gecoat met organoplatinum en gemalen om lamellen te genereren. De mogelijkheid om lamellen te frezen uit hogedruk bevroren materiaal betekent dat veel grotere cellen en weefsels kunnen worden verwerkt, specifiek gericht op gebieden door correlatieve fluorescentiemicroscopie12. Andere recente aanpassingen aan de FIB-freesmethode omvatten het verminderen van gordijnartefacten door het voorfrezen van het monster16, microfluïdische cryofixatie49 en foto-micropatterning van elektronenmicroscopieroosters om de celdistributiete verbeteren 50. Ook is aangetoond dat het frezen van micro-expansieopeningen aan weerszijden van een lamellen de compressie door het omringende monster kan verlichten als het zijn uiteindelijke dunheid bereikt51. Dit kan met name nuttig zijn bij het frezen van continue cellagen, zoals het monster in dit onderzoek, waar soms buiging van lamellen wordt gezien tijdens de laatste polijststap.
De toekomst van elektronenmicroscopie zal waarschijnlijk de bepaling van in situ moleculaire structuren zijn door sub-tomogram middeling en FIB-frezen is een belangrijk hulpmiddel dat de productie van glasvocht biologische monsters voor dit soort workflows zal vergemakkelijken. Terwijl FIB-frezen nog in de kinderschoenen staat voor biologische toepassingen, vindt de ontwikkeling van methoden in een snel tempo plaats dankzij het harde werk van onderzoekers, zowel academische als nationale faciliteiten, plus commerciële investeringen in de ontwikkeling van cryoFIB-SEM-technologie om onderzoek te ondersteunen.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Alleen de cellulaire inhoud van biologische monsters < 500 nm dik kan effectief worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) bij cryogene temperaturen, waardoor het bereik van monsters wordt beperkt tot virussen, prokaryoten, eenvoudige eencellige organismen en dunnere gebieden van grotere eukaryote cellen1. On-grid focused ion beam (FIB)-frezen maakt het mogelijk om dikkere diepgevroren biologische monsters te verdund tot elektronentransparante lamellen bij cryogene temperaturen (< -150 °C). De resulterende lamellen worden vervolgens overgebracht naar een TEM voor visualisatie en tomografische gegevensverzameling, waardoor 3D-reconstructies met hoge resolutie van de cellulaire en moleculaire kenmerken in cellen mogelijk worden (voor beoordelingen zie Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 en Wagner et al., 20204).
FIB-frezen is voortgekomen uit het veld van de materiaalwetenschappen, waar monsters routinematig worden verdund om ze voor te bereiden op downstream-analyse5. Het wordt uitgevoerd in een scanning elektronenmicroscoop (SEM), die twee optische kolommen heeft: conventionele scanning elektronenmicroscoopoptica en een tweede kolom met optica die in staat is om een gefocusseerde ionenbundel (FIB) te genereren en fijn te regelen - een FIB-SEM genoemd. Hierdoor kan een specifiek deel van het monster worden geablateerd door ionen die worden gegenereerd door een galliumbron, waardoor overtollig materiaal wordt verwijderd en een lamellen6 achterblijven. Het freesproces wordt geleid door SEM-beeldvorming van de topografie van het monster, die wordt gebruikt om interessante gebieden te lokaliseren en de voortgang van het frezen te volgen. Voor biologische toepassingen is de basisopstelling grotendeels hetzelfde, maar het frezen wordt uitgevoerd bij cryogene temperaturen. Dit vereiste dat standaard FIB-SEM's werden aangepast om cryogekoelde trappen te hebben die constante temperaturen en lage oppervlakteverontreinigingssnelheden handhaven, evenals luchtsluizen om monsteroverdracht te vergemakkelijken zonder afwijking of verontreiniging. Sample shuttles zijn ook aangepast om een reeks verschillende dragers in de cryoFIB-SEM te kunnen monteren, waaronder TEM-roosters, planchettes en haarvaten. Verschillende belangrijke groepen onderzoekers hebben centraal gestaan bij de ontwikkeling van deze methoden en de voortdurende technologische vooruitgang op dit gebied 7,8,9,10,11,12. Commerciële oplossingen zijn nu op grotere schaal beschikbaar voor biologisch FIB-frezen bij cryogene temperatuur en on-grid frezen van lamellen wordt steeds routineuzer, gegeven een geoptimaliseerd monster.
Een reeks kamertemperatuur- en cryoEM-technieken kan worden gebruikt om cellulaire informatie over alle schalen van het leven te visualiseren, van hele meercellige organismen met een bescheiden resolutie tot het begrijpen van de context van complexe processen op cellulair niveau en in nog meer detail, tot de bepaling van in situ moleculaire structuren13,14,15,16,17,18,19. Klassieke kamertemperatuurtechnieken omvatten secties gefixeerd en gekleurd, hars ingebedde cellen en weefsels door ultramicrotomie voor analyse van cellulaire morfologie door TEM (voor beoordeling zie Studer et al., 200820). Er zijn alternatieve technieken ontwikkeld die gebruik maken van secundaire elektronenverstrooiing door SEM om het oppervlak van blokken geconserveerde cellen in beeld te brengen, voordat materiaal geleidelijk wordt verwijderd met een mes (seriële blokgezichtsbeeldvorming) of een gerichte ionenbundel21,22,23. Deze techniek is ook met succes geïmplementeerd bij cryogene temperaturen (aangeduid als cryo-volume imaging) met een cryoFIB-SEM op glasachtige, niet-gekleurde blokken cellen of weefsels24. Als alternatief kunnen dikkere lamellen (~ 15 μm dik) worden gefreesd en bestudeerd door STEM-beeldvorming25. Met behulp van deze technieken kunnen hele blokken met veel cellen in beeld worden gebracht om populatie-informatie te verzamelen of kan een heel orgaan / organisme in 3D worden afgebeeld en gereconstrueerd. Om toegang te krijgen tot moleculaire informatie met hoge resolutie van cellen, moeten monsters echter worden bewaard in een bijna inheemse, bevroren gehydrateerde toestand en moeten daarom worden bereid onder cryogene omstandigheden. Cryo-elektronenmicroscopie van glasvochtsecties (CEMOVIS) is een techniek waarbij hogedruk bevroren blokken biologisch materiaal onder cryogene omstandigheden worden doorsneden met een ultramicrotoom. Dit levert linten van cryo-secties op (40-100 nm dik)26, die zijn bevestigd aan een EM-raster en worden afgebeeld in de TEM. De fysieke interactie van het mes met het glasvochtmonster veroorzaakt echter crevassing- en compressieartefacten die de cellulaire structuur ernstig kunnen verstoren27,28,29,30. Dikkere secties zijn meer vatbaar voor deze artefacten, waardoor het onpraktisch is om secties dikker dan ~ 70 nm te gebruiken26. Deze beperking beperkt de 3D-weergave van de biologische structuur in het tomogram aanzienlijk. FIB-frezen bij cryogene temperaturen ondervindt deze problemen niet, maar heeft zijn eigen artefacten veroorzaakt door differentiële freessnelheden over delen van het monster, wat leidt tot variabele diktes binnen een lamellen - gordijnen genoemd. Dit probleem wordt verzacht door het aanbrengen van een organoplatinum laag aangebracht via een gasinjectiesysteem (GIS), dat de voorrand van de lamellen beschermt tijdens het frezen31. De bovengrens van de monsterdikte voor on-grid FIB-frezen wordt bepaald door de mogelijkheid om het monster te bevriezen terwijl het glasachtig blijft32, hoewel, met de introductie van cryo lift-out technieken en aangepaste monsterdragers voor biologische monsters, FIB-frezen ook kan worden gebruikt om hogedruk bevroren monsters te verwerken31,33,34,35. Bovendien mogen diepvriesmonsters niet te dun zijn, omdat er voldoende biologisch materiaal moet zijn om een redelijk grote lamellen te genereren die voldoende oppervlak bieden om kantelseries bij de vereiste vergroting te verzamelen. Dit probleem kan worden verlicht door klonten van kleinere cellen, zoals bacteriën of gisten, te malen. De uiteindelijke lamellendikte (~ 100-300 nm) wordt meestal bepaald door de integriteit van het monster en de freesstrategie. Dunnere lamellen zijn beter voor structureel werk met hoge resolutie, zoals sub-tomogrammiddeling, maar dikkere lamellen bevatten veel grotere cellulaire volumes dan kan worden bereikt door CEMOVIS, waardoor meer cellulaire context wordt geboden in een bijna tot native bewaard monster. FIB-frezen kan ook worden gebruikt om diepgevroren eiwitkristallen te verdunnen voor elektronendiffractiestudies36.
FIB-frezen van glasvochtcellen is de tijd en moeite waard om uit te voeren als de wetenschappelijke vraag moleculaire details met hoge resolutie van near-native specimens in situ vereist. Met toegang tot meer faciliteiten voor de routinematige productie van lamellen, is de snelheidsbeperkende stap vaak de optimalisatie van het monster voorafgaand aan het malen, waarbij de tijd moet worden genomen om ervoor te zorgen dat het monster glasachtig is en een geschikte dikte heeft om robuuste en gelijkmatig dunne lamellen te produceren. Hier wordt de monsteroptimalisatie beschreven voor FIB-frezen van diepgevroren menselijke rode bloedcellen die zijn geïnfecteerd met Plasmodium falciparum-parasieten , de veroorzaker van malaria, maar deze aanpak kan voor elk bepaald monster worden aangepast.

<table><tbody><tr><td>c-clips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Clipping station</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Direct citaat van Thermo</td></tr><tr><td>Clipping station</td><td>Sub-angstrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Compound 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Gesynthetiseerd door Dr. Simon A. Osborne, LifeArc</td></tr><tr><td>Cryo-FIB specifieke autogrid randen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1205101</td><td></td></tr><tr><td>E64</td><td>Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K100X gloedontladingseenheid</td><td>Quorum</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633012</td><td>Formulering die wordt gebruikt voor cultivering is op maat gemaakt (REF 041-91762 A) en bevat Albumax, glutamine, HEPES en hypoxanthine supplementen</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>VWR International</td><td>350864X</td><td></td></tr><tr><td>Glazend glas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11562203</td><td></td></tr><tr><td>Grid boxes</td><td>Sub-angstrom</td><td>PB</td><td>Voor geknipte grids</td></tr><tr><td>Grid boxes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Voor geknipte grids - direct citaat van Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Grid boxes</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3727</td><td></td></tr><tr><td>Zelfgebouwde handmatige dompelvriesinstallatie</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Met een geïsoleerde eethaan pot (high-density schuim) en vloeibare stikstof bad (polystyreen) op een werkblad in een beveiligde faciliteit.</td></tr><tr><td>Menselijk bloed</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>UK National Blood and Transplant service</td></tr><tr><td>JEOL 4700F Z JSM met een Leica VCT500 stage koelsysteem</td><td>JEOL</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 met een VCT500 cryostage</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>sputtering coater</td></tr><tr><td>Leica EM ACE900</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>e-beam roterende coater. In een kamer met gecontroleerde vochtigheid.</td></tr><tr><td>Linkam cryo-stage voor lichtmicroscoop</td><td>Linkam</td><td>Model No. CMS196</td><td>Cassettes voor geknipte en ongeknipte grids. In een kamer met gecontroleerde vochtigheid.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E200 lichtmicroscoop</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>met Linkam cryo-stage in een kamer met gecontroleerde vochtigheid.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR International</td><td>17-0891-01</td><td>Oplossing voor percoll kussen is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media en 315 ml Percoll</td></tr><tr><td>Quantifoil koper 200 mesh 2/4 gaatjes carbon EM Finder grids</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCuH2-01</td><td>100 pack</td></tr><tr><td>Quantifoil koper 200 mesh 2/4 gaatjes carbon EM grids</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCu20-01</td><td>100 pack</td></tr><tr><td>Quorum PP3010 prep-kamer</td><td>Quorum</td><td>n/a</td><td>sputtering coater</td></tr><tr><td>Scios dual beam uitgerust met een Quorum PP3010 transfer stage.</td><td>FEI</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Staedtler Lumocolor fijne zwarte permanente marker</td><td>Viking Direct</td><td>ND538522</td><td></td></tr><tr><td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>TEM uitgerust met een K2 of K3 camera.</td></tr><tr><td>Whatmann grade 1 filterpapier</td><td>Sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Scope A1 lichtmicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>met Linkam cryo-stage in een kamer met gecontroleerde vochtigheid.</td></tr></tbody></table>

lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bereiden van cryo-lamellen uit diepgevroren roosters van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde menselijke erytrocyten, die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor andere biologische monsters. De basisprincipes voor het voorbereiden van monsters, het frezen en bekijken van lamellen zijn gemeenschappelijk voor alle instrumenten en het protocol kan worden gevolgd als een algemene gids voor cryo-lamellenpreparatie op het rooster voor cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) en cryo-elektronentomografie (cryoET). Elektronenmicroscopieroosters die de cellen ondersteunen, worden met behulp van een handmatige of geautomatiseerde duikvriezer ondergedompeld in vloeibaar stikstofgekoeld vloeibaar ethaan en vervolgens gescreend op een lichtmicroscoop uitgerust met een cryotrap. Bevroren roosters worden overgebracht naar een cryo-scanning elektronenmicroscoop uitgerust met een gefocusseerde ionenbundel (cryoFIB-SEM). Roosters worden routinematig gesputterd voorafgaand aan het frezen, wat de verspreiding van ladingsopbouw tijdens het frezen bevordert. Als alternatief kan een e-beam roterende coater worden gebruikt om een laag koolstof-platina op de roosters aan te brengen, waarvan de exacte dikte nauwkeuriger kan worden geregeld. Eenmaal in de cryoFIB-SEM wordt een extra coating van een organoplatinumverbinding op het oppervlak van het net aangebracht via een gasinjectiesysteem (GIS). Deze laag beschermt de voorrand van de lamellen terwijl deze wordt gefreesd, waarvan de integriteit van cruciaal belang is voor het bereiken van gelijkmatig dunne lamellen. Gebieden van belang worden geïdentificeerd via SEM en het frezen wordt stapsgewijs uitgevoerd, waardoor de stroom van de ionenbundel wordt verminderd naarmate de lamellen elektronentransparantie bereiken, om overmatige warmteontwikkeling te voorkomen. Een rooster met meerdere lamellen wordt vervolgens overgebracht naar een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) onder cryogene omstandigheden voor tilt-serie acquisitie. Een robuuste en contaminatievrije workflow voor lamellenpreparatie is een essentiële stap voor downstream-technieken, waaronder cellulaire cryoEM, cryoET en subtomogrammiddeling. De ontwikkeling van deze technieken, met name voor het optillen en frezen van hogedrukbevroren monsters, heeft in het veld een hoge prioriteit.

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Dit protocol schetst de bereiding van glasvochtlamellen van met Plasmodium-falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen voor cryo-elektronentomografie. Dit maakt directe observatie van gedetailleerde structurele informatie mogelijk over hoe de parasiet malaria veroorzaakt. Cryo-elektronentomografie registreert informatie met hoge resolutie over de binnenkant van cellen.Het is krachtig genoeg om afzonderlijke eiwitcomplexen in situ te observeren, die computationeel kunnen worden geëxtraheerd en gemiddeld om driedimensionale structurele informatie over eiwitten te onthullen. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende celtypen en kan een startpunt zijn voor iemand die nieuw is in het produceren van glasvochtlamellen voor cryo-elektronentomografie. Dit is Alejandra Carbajal, die het protocol vandaag zal uitvoeren.Om te beginnen, zeef de bevroren koperen roosters met behulp van een CryoStage voor een lichtmicroscoop met bijzondere aandacht voor de gradiënt van ijs over het raster. Controleer individuele rastervierkanten voor celdekking in de dunnere gebieden van ijs. Gebruik een zwarte onuitwisbare marker om de voorkant en de andere kant van Cryo-FIB-SEM-specifieke Autogrid-velgen te markeren.Laad het geknipte raster in de Cryo-FIB-SEM-shuttle met de koolstofzijde naar boven en breng een vier nanometer dikke koolstof- of platina e-beam roterende laag aan op het oppervlak van de cellen. Laad de shuttle in de Cryo-FIB-SEM en beoordeel de celverdeling op elk net per SEM op vijf kilovolt. Neem een overzicht van lage vergrotingen bij 100 vermogen om ijsgradiënten over het raster te bekijken.Maak vervolgens afbeeldingen met een hogere vergroting met een vermogen van 5.000 om naar afzonderlijke rastervierkanten te kijken. Breng een organoplatinumlaag van twee micrometer aan op het oppervlak van elk rooster door de naald van het gasinjectiesysteem in de kamer boven het rooster te steken en de organoplatinum-bron gedurende een bepaalde tijd tot een ingestelde temperatuur te verwarmen om een dampstroom te produceren. Om het monster te observeren, kantelt u het monster zodat het vlak van het raster zich ongeveer 10 graden van de invalshoek van de ionenbundel bevindt en verplaatst u het midden van een geschikt rastervierkant dat te zien is in zowel de SEM- als de FIB-afbeeldingen.met behulp van de ionenbundel bij lage stroom, Onderzoek het raster met een hoge vergroting om de cellen in het midden van een rastervierkant te visualiseren. Markeer twee rechthoekige patronen om te frezen, één boven en één onder een drie micrometer dik beschermd gebied. Kies vervolgens de bundelinstellingen en corrigeer astigmatisme door de helderheid en het contrast aan te passen.nadat de installatie is voltooid, begint u met frezen met een stroom van 300 picoampères terwijl u de live voortgang in de ionenbundelweergave en met tussenpozen door SEM bewaakt. Het monster wordt gecontroleerd in de SEM-weergave en na het eerste frezen, Als de ionenbundel niet door het monster boven en onder het beschermde gebied is gebroken, verwijdert u meer materiaal door de hoogte van de rechthoekige patronen te vergroten. Stop met frezen wanneer het oppervlak boven en onder de lamellen volledig glad is in het zicht van de ionenbundel.Herhaal het freesproces stapsgewijs, waarbij de ionenstraalstroom elke keer wordt verminderd totdat een dikte van 300 nanometer is bereikt. Noteer de X Y Z-positie van elke lamellen. Om de lamellen aan het einde van het experiment te polijsten, gebruikt u een SEM-overzicht met lage vergroting om een groep lamellen te selecteren die moet worden gepolijst en de polijstwortel te markeren.Zodra de polijstwortel is gemarkeerd, vermindert u de ruimte tussen de twee rechthoekige patronen tot 100 tot 200 nanometer en begint u met het polijsten bij een ionenbundelstroom van 30 picoampère. Bewaak de voortgang door SEM op twee tot drie kilovolt. Stop met polijsten wanneer het contrast in de lamellen verloren gaat door SEM of wanneer de organoplatinum vacht of de lamellen zelf integriteit beginnen te verliezen.Verkrijg en bewaar SEM-beelden met lage vergroting van elke lamellen. Na voltooiing van het experiment verwijdert u de shuttle uit de microscoop. Verwijder de roosters met lamellen en bewaar ze onder vloeibare stikstof.Ga voorzichtig om met de roosters. Om de morfologie te bestuderen, werden de schizonten in verschillende stadia van uitgang vastgelopen met behulp van verbinding twee in E-64-remmers. In aanwezigheid van verbinding twee was de grens tussen de parasitofore membranen en het omringende hemoglobine in de rode bloedcel van de gastheer goed gedefinieerd.De intacte parasitofore vacuole, of PV's, zaten vol met merozoïeten in een enkele cluster van hemozoïnekristallen. Toen verbinding twee gesynchroniseerde schizonten in E-64 werden gewassen, werd het PV-membraan gescheurd en verspreidden de merozoïeten zich binnen de RBC. Een typisch voorbeeld van goede celverdeling op een koperen rooster toont grote rode bloedcellen met een goed gedefinieerde periferie en een intact vacuole membraan.Binnen een gedeeltelijk ingeklapte rode bloedcel van de gastheer werden de individuele merozoïeten gevisualiseerd als kleine celclusters. Elke schizont had een zwarte vlek in het midden die de positie van de hemozoïnekristallen aangaf. Na het frezen werden de roosters in de TEM geladen om de posities van de lamellen te identificeren en geschikte gebieden te vinden om door tomografie te targeten.In de monstermicrograaf is een RBC te zien die onlangs was binnengedrongen door een merozoiet. Het merozoiet omgeven door het van gastheercellen afgeleide membraan was te zien binnen de grens van de RBC. Aan het apicale uiteinde van het merozoliet waren de twee membranen rond de cel en vier membranen gestapeld in de top van het merozoiet geassocieerd met een elektrondicht paddestoelvormig kenmerk duidelijk zichtbaar.Binnen het cytoplasma van het merozoiet werd een fusiegebeurtenis tussen het merozoietplasmamembraan en een meerlagig blaasje geïdentificeerd. In een aanvullende TEM-analyse van een 230 nanometer dikke lamellen werd de typische morfologie van een volwassen merozoiet behandeld met E-64 waargenomen. Binnen het membraan van de rode bloedcellen kan het membraan van merozietplasma worden gezien met organellen zoals het binnenmembraancomplex, polaire ringen, micronemen, roptries en de nucleaire envelop.Het belangrijkste onderdeel van deze techniek is het optimaliseren van de roosters om reproduceerbare en efficiënte productie van dunne lamellen mogelijk te maken. Verdere ontwikkeling van deze techniek zal onderzoekers in staat stellen om enkelvoudige eiwitmoleculen in malariaparasieten te visualiseren en hun rol in malaria-uitgang te bepalen.

preparing-lamellae-from-vitreous-biological-samples-using-dual-beam

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

Cryo elektronenmicroscopen, ofwel Scanning (SEM) of Transmission (TEM), worden op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van biologische monsters of andere materialen met een hoog watergehalte 1. Een SEM / focused ion beam (FIB) wordt gebruikt om kenmerken van belang in monsters identificeren en extract een dun, elektron-transparante lamellen overbrenging op een cryo-TEM.

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.

Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

Dit rapport beschrijft een monstervoorbereidingsprotocol en specifieke beeldvormingscondities voor het uitvoeren van schuifende transmissie-elektronentomografie van dikke biologische monsters.

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

De toenemende vraag naar grootschalige gegevensverzameling in cryogene elektronentomografie vereist routines voor beeldverwerving met hoge doorvoer. Hier wordt een protocol beschreven dat de recente ontwikkelingen van geavanceerde acquisitiestrategieën implementeert die gericht zijn op het maximaliseren van de tijdsefficiëntie en doorvoer van tomografische gegevensverzameling.

Strategieën voor optimalisatie van cryogene elektronentomografiegegevensverwerving

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Deze workflow maakt lamellenproductie mogelijk die gericht is op fluorescerend gelabelde biologische structuren die klein (&lt;1 μm in axiale omvang) en zeldzaam (1 kopie per cel) zijn met behulp van een cryogeen tri-samenvallend beeldvormingsplatform. Dit platform integreert fluorescentiemicroscopie, gefocusseerd ionenbundelfrezen en scanning-elektronenmicroscopie op een enkele brandpuntspositie en maakt gelijktijdige fluorescentiemicroscopie tijdens het malen mogelijk.

Workflow met behulp van een cryogene samenvallende fluorescentie-, elektronen- en ionenbundelmicroscoop voor het gericht frezen van cellen

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Dit protocol standaardiseert cryo-elektrontomografie (cryo-ET) voor dik weefsel door hogedrukbevriezing (HPF) te integreren met de wafelmethode, cryogene focus ion beam (cryo-FIB) lift-out en dosissymmetrische, parallelle acquisitie, waardoor uniform dunne lamellen en gevitrificeerde monsters worden opgeleverd voor reproduceerbare in situ-analyse in de hippocampus van de muis.

Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

Leer lamellen bereiden van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde erytrocyten voor cryo-elektronentomografie. Deze methode maakt hoge-resolutie structurele analyse van malariaparasieten in rode bloedcellen mogelijk.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie (Video) | JoVE Journal

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Meer video's verkennen