Analyse van motiliteitspatronen van stentor tijdens en na orale apparaatregeneratie met behulp van celtracking

Stentor coeruleus wordt al lang gebruikt als een modelorganisme om eencellige regeneratie te begrijpen. Hoewel de tijdlijn voor visuele morfologische regeneratie bekend is, blijft de tijdlijn voor functionele regeneratie onbekend. Deze test volgt de beweeglijkheid van de centrumpopulatie die gesynchroniseerde regeneratie ondergaat, zodat het herstel van de verliesfunctie kan worden gekwantificeerd.

Het kan worden aangepast voor gebruik met andere celtypen. Het ontbreken van een veilige afdichting van de beeldkamer zal ertoe leiden dat putten in elkaar lekken of dat er luchtbellen in de putten ontstaan. Voor onderzoekers die niet bekend zijn met het gebruik van siliconen afstandhouders raden we ten zeerste aan dat PSW of een ander schoon medium in elk van de putten wordt gepipetteerd om voor gebruik op lekkage te testen.

De constructie van de monsterkamers is gemakkelijker te tonen dan verbaal beschreven. Net als het proces voor het extraheren van motiliteitspatronen uit de verkregen videogegevens. Snijd om te beginnen een stuk van 250 micrometer dik siliconen afstandsblad dat iets kleiner is in zowel hoogte als breedte dan een microscoopglaasje.

Gebruik een hele pons om cirkelvormige putten te maken die voldoende ruimte tussen naburige putten laten om een goede afdichting te garanderen. Start regeneratie van orale apparatuur door stentor coeruleuscellen gedurende twee minuten in 10% sucrose of 2% uria te broeden. Daarna drie keer wassen met vers medium.

Pipetteer voorzichtig ongeveer 10 stentor in elke put. Zorg ervoor dat het monstervolume zo goed mogelijk wordt afgestemd op het putvolume. Sluit de putten door voorzichtig een stuk afdekglas over de putten te laten zakken vanaf één rand.

Gebruik een smal en enigszins flexibel voorwerp, zoals een pipetpunt van 10 microliter om op het afdekglas te drukken waar het contact maakt met het siliconenvel om een goede afdichting te garanderen. Plaats het monster op het microscooppodium en stel de microscoop in op de laagst beschikbare vergroting, zodat er een goed in het frame past. Begin met de timelapse en verkrijg een video van tien seconden met 30 frames per seconde van elke put op elk tijdstip.

Als u wilt kalibreren, krijgt u een duidelijk beeld van een kalibratiedia of een duidelijke liniaal met dezelfde vergrotingsinstellingen als de video's. Gebruik een willekeurig programma voor het weergeven van afbeeldingen om het aantal pixels te tellen tussen markeringen van een bekende fysieke afstand. Download de twee scripts, volg cellen en schone sporen naar een gemakkelijk te onthouden locatie op de computer en breng de gegevensvideo's ook over naar deze computer.

Organiseer de gegevensvideo's in mappen. Eén voor elk tijdstip. Gebruik de scripttrackcellen om geautomatiseerde celtracking in de gegevensvideo's uit te voeren door trackcellen te openen en het script Kies toevoegen aan pad uit te voeren "als daarom wordt gevraagd door een pop-upvenster dat meestal alleen gebeurt wanneer het script voor de eerste keer vanuit een bepaalde map wordt uitgevoerd.

Selecteer desgevraagd een of meer gegevensvideo's om tracking te starten. Navigeer naar de gegevensvideo's en eenmaal tevreden met de lijst met bestanden klikt u op openen"Om handmatig afwijkende of valse sporen te weigeren, opent u schone sporen in het MATLAB-editorvenster door op het bestand te dubbelklikken. Selecteer bij de prompt de uitvoer van gegevensmappen door trackcellen.

Navigeer naar een van de gemaakte mappen en selecteer deze. Wanneer u hierom wordt gevraagd, voert u er één in om het spoor te behouden en nul om het spoor te weigeren. Druk vervolgens op enter om door te gaan naar het volgende spoor.

Begin met het downloaden van het script met de titel spaghettiplots. Open en voer het script uit. Wanneer het bestandsbrowservenster verschijnt met de prompt, selecteert u de map die u wilt openen.

Navigeer naar de map van een van de tijdstippen. Wat is het aantal pixels per millimeter dat desgevraagd wordt kalibratie? Typ de kalibratiewaarde en druk op enter.

Pas de assen van de plot zo nodig aan door regel 55 van het script te wijzigen, die standaard is ingesteld op RR is gelijk aan vier. voor het opnemen van een straal van maximaal vier millimeter. Sla de plot op.

De resultaten tonen de collectieve beweeglijkheid van de stentorcelpopulatie na twee, drie, zeven en acht uur in het regeneratieproces van het orale apparaat. Deze plots tonen zowel de verwachte toename van het aantal beweeglijke individuen als de viervoudige toename van het bereik van de meest beweeglijke cellen binnen de populatie. De snelste zwemmende cellen, indien dicht bij de rand gestart, zijn beperkt om volledig in een rechte lijn te zwemmen en hun bewegingsbereik lijkt kleiner.

De tractuscellen werden ingedeeld in drie verschillende categorieën, niet-beweeglijk zonder zichtbare hold fast, niet-motiel met zichtbare hold fast en motiel. Het resultaat toonde een gestapeld histogram dat relatieve celtellingen in deze categorieën samenvatte als een functie van de onze in regeneratie. Op latere tijdstippen werd een aanzienlijk aantal cellen gevonden in kolonies met zichtbare hold-vasten die sterk suggereerden dat ze de omgeving hadden verkend en bij voorkeur in de buurt van anderen van hun soort waren gehecht.

Het is belangrijk om de afmetingen van de monsterput te selecteren die goed werken voor stentor coeruleus die ongeveer een millimeter groot zijn. Dit omvat siliconen afstandhouder dikte 5/16e inch in diameter, en 10 cellen per put. Deze getallen moeten worden aangepast bij het aanpassen van dit protocol voor andere celtypen.

Deze test kan worden uitgevoerd in combinatie met RNA-I om de regeneratie van verschillende stentorfenotypen te onderzoeken en te vergelijken.