Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

Dit is een nieuw, lithografievrij protocol voor het modelleren van een 3D-skin-on-chip met behulp van microgemachineerde, zelfklevende vinyllagen en een parallelstroommethodologie voor het genereren van dermale compartimenten. Micromachined vinyl biedt meer eenvoud in het fabricageproces en veelzijdigheid in de lay-out van het apparaat, waarbij enkele van de beperkingen van PDMS en traditionele lithografiebenaderingen worden overwonnen. Deze meerlagige skin-on-a-chip kan worden gebruikt voor medicijn- en cosmetische testbenaderingen, omdat het screening met hoge doorvoer tegen lagere kosten mogelijk maakt en kan worden gebruikt om verschillende ziekten te modelleren.

Begin met het ontwerpen van een microfluïdische chip met behulp van Brother Canvas Workspace-software. Maak een werkruimte van 30 bij 30 centimeter en vul deze met de ontwerppatronen voor de verschillende lagen van de chip voordat u deze opslaat in een svg-bestand. Snijd de vinylplaten van 30 bij 30 centimeter.

Plak het op een kleefmat met een lage kleefkracht en verwijder indien nodig alle luchtbellen. Upload met behulp van een USB-station het svg-bestand naar de randplotter en stel de snijparameters in als snijdruk op niveau nul, snijmes op niveau drie en niveau één voor de snijsnelheid. Wanneer de parameters zijn ingesteld, plaatst u de lijmmat met het vinyl in de plotter en begint u met het snijden van de kanaalpatronen op 95 micrometer dik vinyl.

Monteer het hele apparaat met behulp van een aligner voor de juiste afstelkanalen, inlaten en uitgangen. Stapel op voor vinyllagen met een bijbehorend micromachineontwerp voor het monteren van het onderste kanaal, waarbij de afdektape van de onderste laag behouden blijft om te voorkomen dat deze aan de aligner blijft plakken. Snijd en plaats het polycarbonaat poreuze membraan bovenop het onderste kanaal zonder de inlaten te bedekken.

Voeg 10 vinyllagen toe met het ontwerp van de bovenste kamer en plak er een dubbelzijdige tape-laatste laag op. Verwijder de chip uit de aligner om deze op de glasplaat te plakken. Leg een twee millimeter dik PDMS-vel bovenop de dubbelzijdige tape vinyllaag.

Om ervoor te zorgen dat de chip volledig waterdicht is, laat u een gewicht een nacht op de chip liggen. Steriliseer de chip de volgende dag door deze vijf minuten te spoelen met 70% ethanol, gevolgd door een wasbeurt met gedestilleerd water. Sluit pomp één en pomp twee aan op respectievelijk de inlaat van de bovenste kamer en de inlaat van de bovenste kamer twee.

Sluit pomp drie aan op de inlaat van de onderste kamer en sluit vervolgens de uitlaatopeningen van de bovenste kamer en de onderste kamer aan op een afvalkuip. Sluit de spuiten aan op elke inlaat met behulp van PTFE-buizen en roestvrijstalen connectoren van 18 gauge. Pomp PBS met pomp drie door de inlaat van de onderste kamer met 50 microliter per minuut en met pomp twee door de inlaat van de bovenste kamer twee met 100 microliter per minuut.

Laad vervolgens de spuit met de fibrinogeen pre-gel, plaats deze onmiddellijk in pomp één en laat hem met 200 microliter per minuut draaien. Zodra de pre-gel de uitlaat van de bovenste kamer verlaat, stopt u de pomp één en twee en laat u vervolgens, zonder de slang te verwijderen, de chip gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius in stand. Na gelatie blokkeert u de inlaat van de bovenste kamer met een dop en pompt u het kweekmedium door de inlaat van de bovenste kamer twee met pomp drie met 50 microliter per uur gedurende de nacht.

Controleer 24 uur na het genereren van het dermale compartiment of menselijke primaire fibroblastcellen in de assemblage zijn verspreid en introduceer vervolgens vijf keer 10 tot de 6 HKCs per milliliter door de bovenste kanaalinlaat twee met 40 microliter per minuut gedurende één minuut. Voor celbevestiging plaatst u de chip 's nachts op 37 graden Celsius in een met vochtigheid verzadigde incubator. Begin met het pompen van vers kweekmedium met pomp drie alleen door de inlaat van de onderste kamer met 50 microliter per minuut.

In de representatieve analyse wordt de hoogte van de hydrogel langs de bovenste kamer van de assemblage weergegeven. Een gemiddelde hoogte van 550 micrometer was optimaal voor de werking van de gel bij de stroomsnelheden van respectievelijk 100 en 200 microliter per minuut voor de opofferende PBS en de pre-gel. Het niet doorspoelen van PBS door het onderste kanaal leidde tot discrepanties tussen de theoretische hoogte van de gel en de gemeten, met een verschil van 40%Na 24 uur na de start van het parallelstroomprotocol bleken de menselijke primaire fibroblasten met succes te worden verspreid in de fibrinegel in de bovenste kamer van de assemblage, waarna groene fluorescerende eiwit-tot expressie brengende HKCs effectief bovenop de hydrogel kunnen worden gezaaid.

Verwijdering van buizen zonder het systeem 's nachts gesloten te houden om de HKCS in staat te stellen te sedimenteren, resulteerde in een niet-uniforme, confluente monolaag van cellen. 3D confocale analyse van het ongedifferentieerde huidmodel in de microfluïdische chip toonde duidelijk het oppervlak van de hydrogel die HKCs aan de bovenkant scheidt van de fibroblast die aan de onderkant is ingebed. De gegenereerde huid kan worden blootgesteld aan de lucht / vloeistof-interface om een rijpe en gedifferentieerde epidermis te verkrijgen en verder worden gekarakteriseerd met behulp van verschillende dermale en epidermale markers.

Deze techniek zorgt voor een snellere en goedkopere fabricage van apparaten en het genereren van meerlagige huid met behulp van microfluïdica, wat een meer realistische benadering biedt voor het testen van geneesmiddelen en cosmetica.