Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

Dit budgetvriendelijke magnetische dna-extractieprotocol op basis van kralen maakt een hoge doorvoer sequencing toegankelijk voor labs en studies met beperkte middelen. Dit protocol vereist geen dure apparatuur voor dna-extractie van hoge kwaliteit en kan nuttig zijn in bepaalde diagnostische of onderzoekssituaties waar het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid DNA met een kwaliteit voor hoge doorvoer sequencing een uitdaging is. Dit protocol is eenvoudig te repliceren met een eenmalige demonstratie.

Het moet eerst worden geprobeerd met een klein aantal voorbeelden om vertrouwd te raken met de workflow. Om te beginnen, hydrateren de muggenweefselmonsters opgeslagen in meer dan 70% alcohol door 100 microliter PCR-kwaliteit water toe te voegen en gedurende een uur te broeden bij vier graden Celsius om het weefsel te verzachten. Gooi na de incubatie het water weg en voeg 100 microliters Proteinase K bufferenzymmix toe.

Gebruik vervolgens een microcentrifugebuis stamper om het weefsel te homogeniseren. Centrifugeer na homogenisatie het weefsellysaat en incubeer gedurende twee tot drie uur bij 56 graden Celsius. Om DNA te extraheren, pipeteert u 100 microliters van het weefsellysaat in een nieuwe schone microcentrifugebuis.

Voeg vervolgens 215 microliters van de magnetische kraal master mix toe. Meng met behulp van een pipet het lysaat en het magnetische kralenmengsel gedurende 10 tot 20 seconden en laat het vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur staan. Schud tijdens de incubatie de buis af en toe voorzichtig om de binding van het DNA aan de magnetische kralen te maximaliseren.

Plaats vervolgens de buis op de magnetische kraalafscheider totdat de oplossing duidelijk wordt. Vervolgens met behulp van een pipet, voorzichtig aspireren de vloeistof uit de buis zonder het verstoren van de magnetische kralen die het DNA. Verplaats de buis uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en was de kralen door 325 microliters wasbuffer één toe te voegen.

Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende één minuut op kamertemperatuur. Plaats na de incubatie de buis op de magnetische kraalafscheider en verwijder het supernatant zoals eerder aangetoond, verplaats vervolgens de buis weg van de magnetische kraalafscheider en was de kralen eenmaal met wasbuffer één. Was na de tweede wasbeurt met buffer één de kralen twee keer met 250 microliter wasbuffer twee op dezelfde manier.

Verplaats na de laatste wasbeurt de buis uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 100 microliter elutiebuffer toe. Meng grondig door de buis te pipetten en incubeer de buis vervolgens gedurende twee minuten op kamertemperatuur voordat u deze weer op de magneetscheider plaatst. Wanneer de oplossing duidelijk wordt, breng het supernatant over in een nieuwe, schone microcentrifugebuis van 0,5 milliliter en bewaar het op de juiste manier.

Hier weergegeven als een typische microvolume fluorometer meting van het DNA van de mug in een elutiebuffer met 0,5 millimol EDTA. De gemiddelde absorptieverhouding van 260 tot 280 nanometer is 2,3. Deze tabel toont de kosten en het aantal monsters dat in één werkdag is verwerkt voor verschillende extractiemethoden.

De typische reagens- en verbruikskosten voor een extractie volgens dit protocol bedragen ongeveer 9,50 per monster. Deze kosten zijn gelijk aan elke typische magnetische afzuigmethode op basis van kraal. Het grote kostenvoordeel van dit protocol komt door het niet vereisen van het geautomatiseerde DNA-extractie-instrument.

Zorg ervoor dat u pipetpunten tussen monsters verwisselt om kruisbesmetting van DNA te voorkomen bij het werken met meerdere monsters. We gebruiken het hoogwaardige DNA dat met deze methode wordt geëxtraheerd voor hele genoomsequencing. We gebruiken momenteel de sequencinggegevens om nieuwe mutaties in insecticideresistentie of immuungenen te identificeren die van belang zijn voor de volksgezondheid en ziektebestrijding.

Het hebben van betaalbare oplossingen voor sequencing met hoge doorvoer opent spannende deuren voor populatiegenomica en landschapsgenomica gericht op het begrijpen van muggendispersie en genstroom die het succes van veel nieuwe genetische controlestrategieën beïnvloedt.