Name: Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Leer een kosteneffectief magnetische-kraal-DNA-extractieprotocol voor individuele Aedes aegypti-muggen. Deze methode levert hoogwaardig DNA voor whole genome sequencing zonder dure apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen de financiering van het Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, gefinancierd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC-subsidie NU50CK000420-04-04, het USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch-project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) De bevindingen en conclusies in dit artikel zijn die van de auteur(s) en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de U.S. Fish and Wildlife Service.

1. Algemene monsteropslag en preparaten voorafgaand aan DNA-extractie
<ol><li>Hydrateer het monster gedurende 1 uur (of 's nachts) bij 4 °C in 100 μL PCR-water als het monster is opgeslagen in >70% alcohol om het weefsel te verzachten.</li>
</ol>2. Voorbeeld verstoring
<ol><li>Zet een incubator of schudwarmteblok op 56 °C.</li>
	<li>Maak proteinase K (PK) buffer/enzymmix. 2 μL Proteïnase K (100 mg/ml) en 98 μL Proteinase K Buffer (totaal 100 μL) is vereist voor elke individuele muggenextractie. Om een mastermix voor meerdere specimens voor te bereiden, verhoogt u de totale hoeveelheid (gecombineerd voor alle afzonderlijke specimens) met ~ 15% om de beschikbaarheid van voldoende volume te garanderen.</li>
	<li>Als de monsters vóór de extractie zijn gehydrateerd, gooi dan water uit elke monsterbuis.</li>
	<li>Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met muggenweefsel 100 μL PK buffer/enzymmix toe.</li>
	<li>Homogeniseer het weefsel met behulp van microcentrifugebuis stamper.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters gedurende 1 min bij 9.600 x g bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer het monster gedurende 2-3 uur bij 56 °C.</li>
	<li>Bereid tijdens de incubatie de andere reagentia voor met behulp van de DNA-extractiestap (stap 3).</li>
</ol>3. DNA-extractie
<ol><li>Maak een magnetische kraal master mix. Meng voor elk monster 100 μL lysisbuffer, 100 μL Isopropanol en 15 μL magnetische kralen (totaal 215 μL). Om een mastermix voor meerdere reacties voor te bereiden, verhoogt u de totale hoeveelheid (gecombineerd voor alle afzonderlijke exemplaren) met ~ 20% om de beschikbaarheid van voldoende volume te garanderen.</li>
	<li>Breng na de incubatietijd (stap 2.7) elk lysaat over naar een schone microcentrifugebuis of een microplaatput met behulp van pipet.</li>
	<li>Voeg 100 μL lysaat en 215 μL van de magnetische kraal master mix toe aan elk monster.</li>
	<li>Gebruik een pipet om het goed te mengen voor 10-20 s en laat het vervolgens 10 minuten staan op kamertemperatuur. Schud de buis af en toe om de binding van magnetische kralen en DNA te maximaliseren.</li>
	<li>Plaats de buis/plaat op de magnetische kraalafscheider en wacht tot de oplossing helder is.</li>
	<li>Gooi de vloeistof met behulp van een pipet uit de buis/plaat. Probeer bij het verwijderen van het supernatant de magnetische kralen die het DNA vasthouden niet aan te raken of te verstoren.</li>
	<li>Beweeg de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 325 μL wasbuffer 1 toe aan elke put.</li>
	<li>Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal stap 3.5-3.6.</li>
	<li>Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 1 toe aan elke put.</li>
	<li>Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal stap 3.5-3.6.</li>
	<li>Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 2 toe aan elk monster.</li>
	<li>Meng grondig en incubeer gedurende 1 min op kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal stap 3.5-3.6.</li>
	<li>Verplaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 2 toe aan elke put.</li>
	<li>Meng grondig en incubeer gedurende 1 min op kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal stap 3.5-3.6.</li>
	<li>Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 100 μL elutiebuffer toe aan elke put.</li>
	<li>Meng grondig en incubeer gedurende 2 minuten op kamertemperatuur.</li>
	<li>Beweeg de buis/plaat over de magnetische kraalafscheider en wacht tot de oplossing helder is.</li>
	<li>Pipetteer de supernatant in een nieuwe schone 0,5 microcentrifugebuis of microplaatput.</li>
	<li>Bewaar DNA-monsters bij 4 °C (tot 1 week) of -80 °C.  Als een microplaat wordt gebruikt, bedek deze dan met parafilm.</li>
	<li>Bepaal de DNA-opbrengsten met behulp van een geschikte methode. OPMERKING: In deze studie werd gebruik gemaakt van DNA-fluorometermeting en absorptie bij 260/280 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314(2015).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473(2019).</li>
<li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li>
<li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).</li>
<li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211(2016).</li>
<li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S%C3%A3o+Tom%C3%A9+island%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li>
<li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+%28Howardina%29+busckii+and+Aedes+%28Ochlerotatus%29+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li>
<li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Het hier beschreven protocol kan worden aangepast voor andere insectensoorten. De oorspronkelijke versie van het protocol geïntroduceerd in Nieman et al.1 is getest op meerdere soorten, waaronder Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An....

Recente ontwikkeling van een verbeterd DNA-extractieprotocol1 heeft veel downstreamstudies met een hoge impact mogelijk gemaakt met hele genoomsequencing2,3,4,5,6. Dit magnetische dna-extractieprotocol op basis van kralen biedt een betrouwbare DNA-opbrengst van individuele muggenmonsters, wat op zijn beurt de kosten en tijd vermindert die gepaard gaan met het verkrijgen van een voldoende aantal monsters uit veldcollecties.
Recente vooruitgang in populatie- en landschapsgenomica is direct gecorreleerd met dalende kosten van hele genoomsequencing. Hoewel het vorige DNA-extractieprotocol1 de efficiëntie verhoogt die gepaard gaat met sequencing met hoge doorvoer, kunnen kleinere laboratoria / studies zonder de fondsen zich afmelden voor het gebruik van deze nieuwe krachtige landschaps- en populatiegenomicatools vanwege de kosten van de implementatie van het protocol (bijv. kosten van gespecialiseerde instrumenten).
Hier wordt een aangepast DNA-extractieprotocol gepresenteerd dat een vergelijkbare magnetische kraalextractiestap gebruikt als Neiman et al.1 om DNA met een hoge zuiverheid te verkrijgen, maar niet afhankelijk is van dure instrumenten voor weefsellysis en DNA-extractie. Dit protocol is geschikt voor experimenten waarbij >10 ng hoogwaardig DNA nodig is.

```html
<table><tbody><tr><td>AE Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19077</td><td>Elutiebuffer</td></tr><tr><td>AL Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td>Lysebuffer</td></tr><tr><td>AW1 Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19081</td><td>Wasbuffer 1</td></tr><tr><td>AW2 Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19072</td><td>Wasbuffer 2</td></tr><tr><td>MagAttract Suspension G</td><td>Qiagen</td><td>1026901</td><td>magnetische kraal</td></tr><tr><td>Magnetic bead separator</td><td>Epigentek</td><td>Q10002-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td>microvolume spectrofotometer</td></tr><tr><td>PK Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>4489111</td><td>Proteinase K buffer</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher</td><td>A25561</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>fluorometer</td></tr></tbody></table>
```

een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-dna-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Een onlangs gepubliceerd DNA-extractieprotocol met behulp van magnetische kralen en een geautomatiseerd DNA-extractie-instrument suggereerde dat het mogelijk is om DNA van hoge kwaliteit en kwantiteit te extraheren uit een goed bewaarde individuele mug die voldoende is voor downstream hele genoomsequencing. Vertrouwen op een duur geautomatiseerd DNA-extractie-instrument kan echter voor veel laboratoria onbetaalbaar zijn. Hier biedt de studie een budgetvriendelijk dna-extractieprotocol op basis van magnetische kraal, dat geschikt is voor lage tot gemiddelde doorvoer. Het hier beschreven protocol is met succes getest met behulp van individuele Aedes aegypti muggenmonsters. De lagere kosten in verband met dna-extractie van hoge kwaliteit zullen de toepassing van hoge doorvoer sequencing op resource beperkte laboratoria en studies verhogen.

De gemiddelde DNA-opbrengst per individuele muggenkop/thoraxweefsel was 4,121 ng/μL (N = 92, standaardafwijking 3,513) gemeten met behulp van een fluorometer bij elutie met 100 μL elutiebuffer. Dit is voldoende voor de 10-30 ng genomische DNA-inputvereisten die nodig zijn voor de constructie van de gehele genoombibliotheek1,7. De hoeveelheid DNA kan variëren tussen 0,3-29,7 ng/μL, afhankelijk van de lichaamsgrootte en conserveringsomstandigheden van de mug. Een d...

Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Dit budgetvriendelijke magnetische dna-extractieprotocol op basis van kralen maakt een hoge doorvoer sequencing toegankelijk voor labs en studies met beperkte middelen. Dit protocol vereist geen dure apparatuur voor dna-extractie van hoge kwaliteit en kan nuttig zijn in bepaalde diagnostische of onderzoekssituaties waar het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid DNA met een kwaliteit voor hoge doorvoer sequencing een uitdaging is. Dit protocol is eenvoudig te repliceren met een eenmalige demonstratie.Het moet eerst worden geprobeerd met een klein aantal voorbeelden om vertrouwd te raken met de workflow. Om te beginnen, hydrateren de muggenweefselmonsters opgeslagen in meer dan 70% alcohol door 100 microliter PCR-kwaliteit water toe te voegen en gedurende een uur te broeden bij vier graden Celsius om het weefsel te verzachten. Gooi na de incubatie het water weg en voeg 100 microliters Proteinase K bufferenzymmix toe.Gebruik vervolgens een microcentrifugebuis stamper om het weefsel te homogeniseren. Centrifugeer na homogenisatie het weefsellysaat en incubeer gedurende twee tot drie uur bij 56 graden Celsius. Om DNA te extraheren, pipeteert u 100 microliters van het weefsellysaat in een nieuwe schone microcentrifugebuis.Voeg vervolgens 215 microliters van de magnetische kraal master mix toe. Meng met behulp van een pipet het lysaat en het magnetische kralenmengsel gedurende 10 tot 20 seconden en laat het vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur staan. Schud tijdens de incubatie de buis af en toe voorzichtig om de binding van het DNA aan de magnetische kralen te maximaliseren.Plaats vervolgens de buis op de magnetische kraalafscheider totdat de oplossing duidelijk wordt. Vervolgens met behulp van een pipet, voorzichtig aspireren de vloeistof uit de buis zonder het verstoren van de magnetische kralen die het DNA. Verplaats de buis uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en was de kralen door 325 microliters wasbuffer één toe te voegen.Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende één minuut op kamertemperatuur. Plaats na de incubatie de buis op de magnetische kraalafscheider en verwijder het supernatant zoals eerder aangetoond, verplaats vervolgens de buis weg van de magnetische kraalafscheider en was de kralen eenmaal met wasbuffer één. Was na de tweede wasbeurt met buffer één de kralen twee keer met 250 microliter wasbuffer twee op dezelfde manier.Verplaats na de laatste wasbeurt de buis uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 100 microliter elutiebuffer toe. Meng grondig door de buis te pipetten en incubeer de buis vervolgens gedurende twee minuten op kamertemperatuur voordat u deze weer op de magneetscheider plaatst. Wanneer de oplossing duidelijk wordt, breng het supernatant over in een nieuwe, schone microcentrifugebuis van 0,5 milliliter en bewaar het op de juiste manier.Hier weergegeven als een typische microvolume fluorometer meting van het DNA van de mug in een elutiebuffer met 0,5 millimol EDTA. De gemiddelde absorptieverhouding van 260 tot 280 nanometer is 2,3. Deze tabel toont de kosten en het aantal monsters dat in één werkdag is verwerkt voor verschillende extractiemethoden.De typische reagens- en verbruikskosten voor een extractie volgens dit protocol bedragen ongeveer 9,50 per monster. Deze kosten zijn gelijk aan elke typische magnetische afzuigmethode op basis van kraal. Het grote kostenvoordeel van dit protocol komt door het niet vereisen van het geautomatiseerde DNA-extractie-instrument.Zorg ervoor dat u pipetpunten tussen monsters verwisselt om kruisbesmetting van DNA te voorkomen bij het werken met meerdere monsters. We gebruiken het hoogwaardige DNA dat met deze methode wordt geëxtraheerd voor hele genoomsequencing. We gebruiken momenteel de sequencinggegevens om nieuwe mutaties in insecticideresistentie of immuungenen te identificeren die van belang zijn voor de volksgezondheid en ziektebestrijding.Het hebben van betaalbare oplossingen voor sequencing met hoge doorvoer opent spannende deuren voor populatiegenomica en landschapsgenomica gericht op het begrijpen van muggendispersie en genstroom die het succes van veel nieuwe genetische controlestrategieën beïnvloedt.

a-magnetic-bead-based-mosquito-dna-extraction-protocol-for-next

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle en betaalbare manier om de kwaliteit malariaparasiet en vector-DNA extraheren uit mug exemplaren beschreven. Voortbouwend op chelerende eigenschappen van Chelex hars, maakt de eenvoudige methode genotypering van malariaparasieten in mug mid-darmkanaal en speekselklier fasen en moleculaire identificatie van...

Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Een ribosomaal RNA (rRNA) uitputting protocol werd ontwikkeld om messenger RNA (mRNA) voor RNA-seq van de mug darm metatranscriptome verrijken. Voorbeeld specifieke rRNA probes die werden gebruikt om rRNA verwijderen via aftrekcircuit werden gemaakt van de mug en gut microben. Uitvoering van het protocol kan resulteren in de verwijdering van ongeveer 90-99% van rRNA.

Uitputting van ribosomaal RNA voor Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen heeft brede toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van ziekteverwekkers, voedsel veiligheid controle genomic analyse, metagenomic milieumonitoring en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica. In dit artikel wordt de procedure voor het rangschikken van het DNA van de bodem van het metagenomic voor soorten identificatie met behulp van de technologie van het rangschikken nanopore aangetoond.

Nanopore DNA rangschikkend voor Metagenomic bodemanalyse

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.

Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.

Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti

Dit protocol toont aan dat het slaan van kralen in combinatie met het zuiveren van DNA-afvangkralen een snelle en consistente methode biedt voor het extraheren van DNA uit Mycobacterium tuberculosis-monsters , waardoor het een effectieve keuze is voor sequencing-toepassingen van de volgende generatie.

Mycobacteriële DNA-extractie met behulp van kralen kloppen in aangepaste buffer gevolgd door NGS-workflow

We presenteren een geoptimaliseerde methode voor DNA-extractie uit ontsmet sputum met behulp van een matrix-gebaseerde extractiemethode in combinatie met een magnetische parelzuivering voor downstream gerichte next-generation sequencing van Mycobacterium tuberculosis.

Matrix-gebaseerde DNA-extractie voor gerichte sequencing van de volgende generatie op ontsmette sputummonsters

Leer een kosteneffectief magnetische-kraal-DNA-extractieprotocol voor individuele Aedes aegypti-muggen. Deze methode levert hoogwaardig DNA voor whole genome sequencing zonder dure apparatuur.

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

Meer video's verkennen