Monstervoorbereidings- en overdrachtsprotocol voor in-vacuüm kristallografie met lange golflengte op Beamline I23 bij Diamond Light Source

Macromoleculaire kristallografie met lange golflengte maakt gebruik van het afwijkende signaal van lichtatomen die van nature aanwezig zijn in eiwitten en nucleïnezuren. Deze techniek wordt gebruikt om het kristallografische gezichtsprobleem experimenteel op te lossen en de identiteit en locatie van deze elementen te bepalen. Beamline I23 bij Diamond Light Source is een uniek synchrotroninstrument dat is geoptimaliseerd voor experimenten op lange golflengten tot vijf angstrom.

Het biedt toegang tot de absorptieranden van elementen met een hoge biologische relevantie, zoals calcium, kalium, chloor, zwavel en fosfor. Vanwege de aanzienlijke absorptie van röntgenstralen door lucht in het langegolfregime, worden deze experimenten uitgevoerd in een vacuümomgeving. Om monsters bij cryogene temperaturen in de vacuümomgeving te houden, worden de kristallen gemonteerd op speciale, thermisch geleidende monsterhouders.

De cryogene monsteroverdracht van vloeibare stikstof naar het vacuümeindstation lijkt sterk op de technieken die worden gebruikt in cryo-elektronenmicroscopie. Dit protocol presenteert de procedure voor het overbrengen van kristallen in de vacuümomgeving met behulp van de gereedschappen en apparatuur die zijn ontwikkeld bij Diamond Light Source. Begin met het scheiden van het deksel van de basis van de CombiPuck, zodat de monsterhouders aan de basis blijven vastzitten en de injectieflacons in het deksel worden vastgehouden.

Dompel het deksel onder met injectieflacons in vloeibare stikstof, bevestig vervolgens een monsterhouder en adapter aan een magnetische staaf en oogst de kristallen. Spoel elk monster rechtstreeks in de CombiPuck en noteer de monsterpositie. Om de puck te sluiten, gebruik je een puck-toverstaf om de basis aan het deksel te bevestigen.

Breng de CombiPuck over van vloeibare stikstof naar de droge verzender of opslag. Plaats de basis van de blokpuck die al gevuld is met lege transferblokken op de steunbasis in een schuimcontainer en vul vervolgens met vloeibare stikstof. Plaats vervolgens de CombiPuck in de schuimcontainer gevuld met vloeibare stikstof en zorg ervoor dat de basis van de puck is bevestigd aan de magnetische houder in de schuimcontainer.

Koel alle benodigde gereedschappen voor in vloeibare stikstof. Scheid vervolgens het deksel van de basis met behulp van het puckscheidergereedschap op de hoge stand, zodat de basis aan de magnetische houder blijft bevestigd, waardoor de monsterhouders in vloeibare stikstof worden blootgesteld. Plaats de scheidingsstaaf over de monsterhouder en adapter zo ver mogelijk naar beneden en zorg ervoor dat de toverstaf verticaal is.

Beweeg de kleine hendel op de scheidingsstang naar beneden met uw duim totdat deze klikt om de monsterhouder binnenin vast te zetten en trek de monsterhouder uit de adapter. Laat de separator over de gewenste positie van het overdrachtsblok zakken en zorg ervoor dat een van de drie tanden in het centrale gat van het overdrachtsblok past. Laat de monsterhouder los door de hendel weer omhoog te bewegen.

Als u monsters in het volgende overdrachtsblok wilt laden, gebruikt u het gereedschap carrouselsleutel om een leeg overdrachtsblok in de horizontale positie te draaien. Zodra alle monsterhouders zijn overgebracht, sluit u de blokpuck door het deksel in vloeibare stikstof te plaatsen. Wacht tot de temperatuur in evenwicht is en plaats vervolgens het deksel over de basis en til voorzichtig op om uit de carrousel te komen.

Bevestig de shuttle aan het station. Open de stikstofgas- en luchtkleppen en zorg ervoor dat er gassen stromen. Schakel vervolgens de CTS in.

Koel zowel het bad als de shuttle met vloeibare stikstof. Plaats de meegeleverde trechter in de vulpoort op de shuttle en giet langzaam vloeibare stikstof in de trechter terwijl u het niveau op het scherm bewaakt. Stop wanneer de indicator van rood naar blauw verandert.

Vul het bad met vloeibare stikstof met behulp van de trechter. Breng een blokpuck van vloeibare stikstof over naar het CTS-bad met behulp van het bijgevoegde puckscheidergereedschap. Verwijder het deksel van de blokpuck en sluit het deksel van het CTS-bad.

Om een transferblok in de shuttle te introduceren, ontgrendelt u de shuttle-handgreep door 90 graden met de klok mee te draaien en deze naar het bad te verplaatsen, zodat de geleide baan op de hendel het juiste reispad afdwingt. Zodra de blokafdekking is afgekoeld, plaatst u de hendel om het blok in de shuttle te brengen. Om het transferblok op de shuttle te vergrendelen, draait u de hendel 180 graden met de klok mee.

Trek de hendel terug naar de oorspronkelijke rugpositie en vergrendel deze op zijn plaats door 90 graden tegen de klok in te draaien. Druk op Close Shuttle Valve Pump op het display om de evacuatie van de shuttle te starten. Zodra de berichten Shuttle klaar om te bewegen en Niet bewegen staaf, klep gesloten worden weergegeven op het aanraakscherm, druk op de hendel onder de shuttle en til deze voorzichtig op met behulp van het handvat aan de bovenkant.

Draag de shuttle rechtop naar de luchtsluis op het vacuümeindstation en bevestig deze. Selecteer een lege blokpositie in het vat door op de overeenkomstige knop op het aanraakscherm te drukken en het voorbeeldhotel naar de juiste laadpositie te verplaatsen. Zodra een voorbeeldhotel op zijn plaats is, drukt u op de knop Openen om de vacuümvergrendelingsvolgorde te starten.

Nadat de reeks is voltooid en de status verandert in Airlock open, blok in shuttle, draai de hendel 90 graden met de klok mee om de stang te ontgrendelen. Duw de hengel voorzichtig in het schip, zodat de geleide baan het juiste pad naar het monsterhotel afdwingt. Plaats het transferblok langzaam in het hotel met behulp van de videofeed die op het scherm wordt weergegeven voor begeleiding, zodat het blokpositiepictogram op het aanraakscherm is geactiveerd.

Eenmaal geactiveerd, draait u de hendel 180 graden tegen de klok in om het overdrachtsblok los te laten en de staaf uit het vat te trekken. Eenmaal volledig ingetrokken, draai je de hendel 90 graden tegen de klok in om de stang te vergrendelen. Druk op de knop Sluiten om de vacuümklep van het eindstation te sluiten en de ruimte tussen de shuttle en het vat te ontluchten tot atmosferische druk.

Verwijder de shuttle wanneer het luchtsluisdisplay de status OK weergeeft om los te maken. Breng de shuttle terug naar het CTS-bad en druk op Open Shuttle Valve om de shuttle te evacueren voordat het volgende monsterblok wordt geladen. Zodra het stoplicht groen is en het bericht OK to move rod verschijnt, kan het volgende transferblok aan de shuttle worden geïntroduceerd.

Om het volgende overdrachtsblok voor te bereiden, draait u de blokpuck in het bad. Duw de ingebouwde rotatiesleutel aan de bovenkant van het acryldeksel naar beneden in het slot in het midden van de blokpuck. Terwijl u het ingedrukt houdt, draait u de sleutel om het gewenste overdrachtsblok in de ophaalpositie te plaatsen.

Zodra alle blokken zijn overgedragen, controleert u of de shuttleklep open is, drukt u op de Bake-knop op het aanraakscherm, selecteert u zowel Bath als Shuttle en drukt u vervolgens op Start Bake. De lange golflengte macromoleculaire kristallografiebundellijn I23 bij Diamond Light Source heeft toegang tot de absorptieranden van elementen van hoog biologisch belang, zoals calcium, kalium, chloor, zwavel en fosfor, waardoor een verbeterd afwijkend signaal ontstaat dat kan worden gebruikt voor het faseren of lokaliseren van deze elementen in macromoleculen. Diffractiegegevens werden verzameld van een enkel thaumatinekristal met golflengte 2,75 angstrom, gekozen als een compromis tussen verhoogde abnormale signaal- en monsterabsorptie-effecten op langere golflengten.

De vacuümopstelling zorgt ervoor dat alleen röntgenstralen die door het monster worden verstrooid de detector bereiken, waardoor een lage achtergrond rond de Bragg-reflecties wordt geboden. De dataset leverde een zeer sterk afwijkend signaal op, waardoor de structuuroplossing door de automatische faseringspijplijn CRANK2 werd vergemakkelijkt. De hoge kwaliteit van de resulterende elektronendichtheidskaart maakte succesvolle automatische modelbouw mogelijk, met de juiste plaatsing voor 100% van de aminozuursequentie van thaumatine.

De 16 cysteïneresiduen in thaumatine vormen acht disulfidebruggen, die allemaal duidelijk zichtbaar zijn in de elektronendichtheidskaart. Omdat in-vacuüm lange golflengte eiwitkristallografie een nieuw veld is, hebben we nieuwe hulpmiddelen en apparatuur voor monsterbehandeling ontwikkeld. Dit protocol begeleidt gebruikers bij het veilig overbrengen van monsters naar het vacuümeindstation op beamline I23 bij Diamond Light Source.

De vacuümomgeving biedt unieke mogelijkheden om diffractie-experimenten uit te voeren in een golflengtebereik dat niet toegankelijk is bij andere bundellijnen. Röntgenkristallografie met lange golflengte maakt experimentele fasering van macromoleculen rechtstreeks uit inheemse kristallen mogelijk. Het maakt ook een ondubbelzinnige identificatie mogelijk van ionen die aan de moleculen zijn gebonden.