Kwantitatieve analyse van celranddynamiek tijdens celspreiding

Het protocol dat in deze video wordt beschreven, definieert de experimentele procedures die nodig zijn voor de levensgrote beeldvorming van spreidcellen en het gebruik van een computationele tool die cellen kwantificeert die dynamiek op een onbevooroordeide en geautomatiseerde manier verspreiden. Het celverspreidende activum maakt het mogelijk om de beweging van de celrand en morfologische veranderingen tijdens het verspreiden van cellen continu bij te houden, wat een kenmerk is dat ontbreekt in de meeste bestaande celverspreidingstesten. Dit protocol implementeert ook het gebruik van geautomatiseerde computerverwerking en -analyse, met informatie over celcirculaire, gebieds- en uitsteekcycli van spreidcellen.

Een dergelijke geautomatiseerde verwerking vermindert bias in gegevensanalyse en biedt een robuuste methode voor het analyseren van celverspreidingsdynamiek voor een groot aantal cellen. In combinatie met medicamenteuze behandelingen of genwetenschap en -technieken is dit protocol vatbaar voor grootschalige snelheden van moleculaire spelers die celuitsteeksels reguleren. Voor het gegeven protocol, De gebruikte cellen zijn muis embryonale fibroblasten die ph-akt-GFP genetisch coderen, die de fluorescerende tagging van het plasmamembraan mogelijk maakt.

Vóór het begin van de celverspreidingstest, kweek een schaal van cellen tot 90%samenvloeiing. Zodra de cellen de juiste samenvloeiing hebben bereikt, vlam een 22 bij 22 millimeter afdekslip en plaats deze in een 35 millimeter celkweekschaal. Bedek de afdeklip met fibronectine dat in PBS is verdund tot een concentratie van 2,5 microgram per milliliter.

Plaats de schaal met de dekselslip een uur in een incubator van 37 graden. Na een uur aspireren de fibronectine ervoor te zorgen dat u de afdekslip niet aanraakt met de pipetpunt. Was de schaal met PBS door de afdekstrip twee tot drie keer voorzichtig rond de afdeklip te gieten.

Voor het zaaien van cellen begint u met het aspireren van de celkweekmedia uit de schaal van cellen. Was daarna de schaal met warme PBS. Voeg 650 microliter trypsine EDTA toe aan de schaal en kantel de schaal om het enzym gelijkmatig te verdelen.

Plaats de schaal met de trypsine een minuut in de incubator. Na incubatie moet u eerst 10 milliliter celkweekmedia toevoegen aan een centrifugebuis. Voeg vervolgens snel nog eens 10 milliliter media toe aan de schaal om de trypsine te doven.

Om de cellen die op de afdekstrook worden gezaaid te verdunnen, spuit u een milliliter van de inhoud van de schaal in de centrifugebuis. Pipetteer vanuit de buis ongeveer 500 tot 1.000 microliter verdunde cellen in de schaal met de afdekslip. Zorg ervoor dat de afdekstrook 10% samenvloeit of 50.000 cellen per milliliter en pas het volume verdunde cellen zo nodig aan.

Het doel van deze cellen is om een scherpstelvlak te creëren tijdens het verkrijgen van afbeeldingen. Met de resterende cellen in de schaal, passage een vijfde van de cellen in een kleine schaal per behandeling. Dit zijn de cellen die worden geanalyseerd voor het verspreiden van dynamiek.

Plaats de doorgangsschalen en de afdekschaal acht tot 24 uur in een incubator. Om het belang van Arp2/3 voor celverspreiding te testen, voegt u eerst vijf milliliter celkweekmedia toe aan een controle- en een behandelingscentrifugebuis. Voeg vervolgens 20 milliliter dmem zonder fenolrood toe aan elk van de twee grotere centrifugebuizen.

Pipetteer ofwel het medicijn CK-666 dat een remmer is van het Arp2/3-complex of de gecontroleerde behandeling zoals DMSO in de kleine en grote buizen. Om te beginnen met de farmacologische behandeling van de cellen, verwijdert u de passageschotels die 's nachts werden geïncubeerd. Aspireer de celkweekmedia uit alle gerechten en was de afwas met warme PBS.

Neem de kleine buisjes met CK-666 of bedien aangevulde media en voeg de inhoud van de betreffende buis toe aan elk van de passageschalen. Etiketeer elk van de gerechten met de juiste medicamenteuze behandeling en plaats de gerechten vervolgens een extra uur terug in de incubator Na een uur incubatie, aspireer het medicijn aangevulde media uit elk van de gerechten. Voeg vervolgens warme PBS toe aan alle gerechten om alle resterende fenolrode media grondig te verwijderen.

Voeg 230 microliter trypsine EDTA toe en doe de gerechten een minuut in een incubator. Verwijder de trypsinized gerechten uit de incubator en ga verder met het toevoegen van vijf milliliter van het medicijn aangevuld dmem dat fenolrood mist in een buis die is aangeduid als buis B.Voeg vervolgens nog eens vijf milliliter van hetzelfde medium toe aan de relevante schaal om de trypsine te doven. Pipetteer de media meerdere keren op en neer om alle cellen van de schaal los te maken.

Breng alle inhoud van de schaal over in een andere buis die al is aangewezen als buis A.In om een celverdunning te bereiden die geschikt is voor beeldvorming, breng een milliliter cellen over van buis A naar buis B.Herhaal alle verdunningsstappen voor elke behandeling. Plaats alle buizen gedurende 45 minuten in de incubator om cellen te laten herstellen van trypsinisatie. Zorg ervoor dat alle delen van een celmagnetische kamer die geschikt zijn voor een afdekkingsslip van 22 bij 22 millimeter voor gebruik grondig zijn gereinigd.

Verwijder de schaal met de afdekstrip uit de incubator. Aspireer de celkweekmedia en was de afdekstrip met warme PBS. Verwijder de afdekslip met een tang en leg de afdekstrip voorzichtig op de bodemplaat van de magneetkamer.

Pak vervolgens de siliconen pakking op en plaats deze bovenop de afdekslip. Bevestig het hoofdlichaam van de magnetische kamer op de bodemplaat. Voeg een milliliter dmem zonder fenolrood toe die overeenkomt met de relevante behandeling in de magnetische kamer.

Neem een pluisvrij weefsel en dep de behuizing voorzichtig tussen het hoofdlichaam en de bodemplaat om te controleren op eventuele lekken. Om de magnetische kamer te voltooien, laat u het transparante deksel op het hoofdlichaam zakken. Veeg ten slotte de bodem van de afdekstrip af met een tissue besproeid met water en een andere besproeid met 70% ethanol.

Verwarm de stage top incubator van een confocale microscoop voor op 37 graden. Plaats de magneetkamer bovenop het doel. Voordat u de spreaddynamiek verwerft, stelt u de focus op de reeds gepolariseerde cellen in het groene fluorescerende kanaal.

Dit zorgt ervoor dat de spreidcellen scherp zijn zodra ze zich aan de afdekstrip hechten. Verwijder het transparante deksel van de magnetische kamer en pipet 500 microliter uit buis B die uit de incubator is verwijderd. Plaats de transparante hoes er weer bovenop.

Om cellen te identificeren die ideaal zijn voor celverspreidingsanalyse, zoekt u naar groene halo's die cellen vertegenwoordigen die zich nog aan de afdekstrook moeten hechten of zich in de vroegste stadia van aanhechting bevinden. Verzamel afbeeldingen en sla de bestanden op. Nadat u de beeldverwerving van celverspreiding hebt voltooid, begint u met het uitvoeren van een compatibele Python IDE zoals Spyder.

Voor de berekeningsanalyse van de dynamiek van celverspreiding zoekt en opent u het GUI-bestand voor celverspreiding in de relevante scriptpakketten. Druk op de run-knop die het analyse-GUI-paneel op de achtergrond opent. De GUI bevat alle instellingen die nodig zijn voor analyse.

Als u het celgebied en de circulariteit wilt analyseren, voert u het acquisitiebestand en de benodigde instellingen in op het tabblad celspreidingsgebied. Aanpassingen moeten worden uitgevoerd afhankelijk van het celtype en de parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen. Nadat u op uitvoeren hebt gedrukt, wordt een celcirculaire en gebied versus tijdplot gemaakt voor alle spreidcellen.

Voor kymografische gegevens drukt u op de kymografische generator en het analysetabblad. Voor deze analyse moeten invoerbestanden worden bijgesneden met afbeeldingsstapels met één cel. Nadat alle instellingen zijn ingevoegd en op uitvoeren is gedrukt, maakt het script meerdere kymografieën voor de opgegeven cel.

Aan de linkerkant bevinden zich representatieve cellen van de DMSO- en CK-666-behandelingen, automatisch gesegmenteerd met behulp van het meegeleverde script. In tegenstelling tot de isotrope en zeer circulaire morfologie die door controlecellen wordt aangetoond, vertonen Arp2/3 geremde cellen een verminderde circulariteit. Bovendien bieden de automatisch gegenereerde kymografieën een tijdelijke resolutie die van cruciaal belang is voor het begrijpen van de dynamiek van uitsteeksels.

Controlecellen steken hardnekkig uit met weinig tot geen intrekingen. Arp2/3-remming verstoort daarentegen de stabiliteit van uitsteeksels, zoals blijkt uit de toename van retractiegebeurtenissen tijdens de verspreiding. Deze video's moeten u inzicht geven in hoe u cellen op de juiste manier kunt zaaien, farmacologische behandelingen kunt uitvoeren en beeldvormings- en rekentools kunt voorbereiden die nodig zijn voor de kwantificering van de celverspreidingsdynamiek.

Dit protocol kan verder worden gecombineerd met cytoskelet fluorescerende beeldvorming en migratietesten om de moleculaire spelers te identificeren die celuitsteeksels besturen. Bedankt voor het kijken en veel succes met je experimenten.