Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

Dit protocol stelt iedereen in staat om single-molecule FRET-experimenten uit te voeren om nauwkeurige absolute afstanden binnen biomoleculen te meten met behulp van de smfBox, een goedkoop, robuust, open-source instrument. met smFRET kun je naar één molecuul tegelijk kijken, in plaats van de gemiddelde vele miljarden moleculen, zodat je de verschillende conformaties die ze aannemen kunt karakteriseren. Het mooie van deze methode is dat het kan worden gebruikt om licht te werpen op de structuur en dynamiek van veel biomoleculaire systemen.

Bijvoorbeeld eiwitvouwing, eiwit-DNA-interacties en DNA-allosterie. Voordat u met een analyse begint, start u het lasercontrolecentrum en bevestigt u dat de continue golfwisselaar constante stroommodus is geselecteerd. Schakel beide lasers in.

Start smOTTER-acquisitiesoftware en controleer of elk instrument correct is geconfigureerd. Om het emissiepad uit te lijnen, plaatst u een druppel dompelolie op het objectief en plaatst u voorzichtig een schoon afdekglas op de objectieflens, waarbij u onder een hoek met de olie laat zakken om te voorkomen dat luchtbellen tussen het afdekglas en het objectief worden opgevangen. Voeg vervolgens 10 microliter 100 nanomolaire Cy3B-kleurstof toe aan het midden van het afdekglas.

Stel in het deelvenster voor laser duty cycles de donorlaser in op nul uit, 45 aan en 55 uit. Stel de acceptorlaser in op 50 uit, 45 aan en vijf uit. Stel de wisselende laserexcitatie of ALEX-periode in op 100 microseconden.

Open het tabblad Z-focus. Schakel in het acquisitiepaneel de lasers naar live en start de camera. Pas de belichting aan zodat een heldere vlek centraal wordt weergegeven, omringd door een zwarte achtergrond.

Begin vanuit een lage Z-positie en verhoog de hoogte totdat de heldere vlek zijn minimale grootte bereikt. Verhoog vervolgens de hoogte tot nog eens 20 micrometer om de laser in het monster boven de olie te richten en het glas af te dekken. Wanneer het monster scherp komt te staan, stopt u de camera.

Verlaag in het controlecentrum van omicron het groene laservermogen terwijl u de y-asschaal bewaakt in het uitlijningstabblad van smOTTER totdat de uitlezing van beide detectoren wordt waargenomen, waarbij de schaal indien nodig wordt gewijzigd. Schroef vervolgens de vier schroeven aan de voorkant van de smfBox los om het voorpaneel te verwijderen. Om het pinhole uit te lijnen, draait u aan de X-knop op de pinhole positioner terwijl u het signaal op het uitlijningstabblad bekijkt om het signaal in groen en rood te vergroten.

Draai aan de Y-knop om het gaatje in de andere richting uit te lijnen en keer vervolgens terug naar de X-knop om te controleren op een verdere toename van het signaal. Om de pinhole-lens uit te lijnen, draait u de X-knop van de lens in één richting om het signaal te verlagen en draait u vervolgens de pinhole X-knop in dezelfde richting om het signaal terug te brengen naar het oorspronkelijke niveau. Als het nieuwe max-signaal hoger is dan voorheen, blijf dan zowel het pinhole als de lensknoppen iteratief in die richting bewegen.

Als het signaal lager is dan voorheen, beweegt u de knoppen iteratief in de tegenovergestelde richting en herhaalt u de uitlijning met behulp van de pinhole- en lens Y-knoppen. Voor de uitlijning van de lawinefotodiodelens, te beginnen met de groene lawinefotodiode, beweegt u de X-knop totdat het groene signaal maximaal is. Herhaal de signaalaanpassing voor de Y-knop.

Keer terug naar de X-knop en beweeg heen en weer om de drempelpunten te vinden waarop het signaal begint te vallen. Laat het signaal op een positie halverwege deze twee punten staan. Zoek de tussenpositie voor de Y-knop en herhaal de uitlijning voor de rode lawinefotodiode.

Voordat u het eerste monster analyseert, reinigt u het podium met methanol doordrenkt lensreinigingsweefsel, veegt u voorzichtig over het objectief van het ene uiteinde naar het andere en brengt u drie tot vier druppels onderdompelingsolie aan op het midden van het objectief. Voeg 10 microliter ultrapuur water van het type één toe aan het midden van een schoon afdekglas en controleer het waterspoor om te bevestigen dat er geen fluorescerende signalen worden waargenomen. Gebruik vervolgens een pincet met rubberen uiteinde om het afdekglas voorzichtig te verwijderen en de dompelolie indien nodig aan te vullen.

Om ervoor te zorgen dat gegevens met één molecuul worden verkregen, selecteert u na verdunning van het monster een concentratie waarbij één tot vijf uitbarstingen per seconde worden waargenomen in het live trace panel. Wanneer de juiste concentratie is bepaald, drukt u siliconenisolatoren met een diameter van acht tot negen millimeter op het midden van een nieuw afdekglas en voegt u voorzichtig 10 microliter monster toe aan het midden, waarbij contact met de siliconen wordt vermeden. Plaats het tweede dekglas stevig op de isolatoren totdat een afdichting is gevormd.

Controleer het live stoichiometrie versus FRET-efficiëntiehistogram om te observeren of het monster zich gedraagt zoals verwacht. Voer in het deelvenster Instellingen opslaan de informatie in voor de naam en details van het monster, donor- en acceptorlabels, buffer-, donor- en acceptorexcitatiegolflengten, detectiegolflengten en laservermogen, eindgebruiker en gebruikersrelatie. Voer in het acquisitiepaneel de experimentlengte in minuten in en selecteer een geschikt opslaginterval om mogelijk gegevensverlies in het geval van een fout te beperken.

Selecteer indien nodig laservermogens opslaan en klik vervolgens op Start om te beginnen met het verzamelen van de gegevens. Bij een positief resultaat wordt tussen de vijf en één burst per seconde verkregen. Bij een negatief resultaat zullen te veel of te weinig uitbarstingen binnen hetzelfde tijdsbestek worden waargenomen.

Na verzameling en analyse moet de afwisselingsplot overeenkomen met de ALEX-periode van de experimentele opstelling. Het tijdsspoor wordt gebruikt om kwalitatief te beoordelen of de monsterconcentratie redelijk is. De achtergrondplot toont de verdeling van de inter-fotonvertragingsperioden met een lineaire aanpassing aan de langere tijden om de achtergrondsnelheid te schatten.

Het achtergrondspoor kan worden gebruikt om te bepalen of er gedurende de duur van het experiment veranderingen in het monster zijn opgetreden. Stoichiometrie versus FRET-efficiëntie histogrammen worden gegenereerd, waarbij wordt geselecteerd voor alle soorten en dubbel gelabelde soorten. Een 1D FRET-efficiëntiehistogram wordt gegenereerd met Gaussiaanse aanpassing van de gegevens.

Dus de concentratie van het monster hier is de sleutel. Als het te hoog is, doe je geen experiment met één molecuul meer, terwijl als het te laag is, het te lang duurt om de gegevens te krijgen. Het heeft de bepaling van structuren van dynamische biomoleculen mogelijk gemaakt, die niet konden worden bepaald door andere methoden zoals NMR of kristallografie.