Swabbing the Urban Environment - Een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs

Deze studie presenteert een nieuwe workflow om SARS-CoV-2 te detecteren op oppervlakken die zelden worden gereinigd in de stedelijke omgeving, zoals gaspompgrepen, speeltuinen en geldautomaten. In een pandemie zijn voorraden schaars. We gebruiken gemakkelijk verkrijgbare materialen en reagentia en apparatuur die beschikbaar zijn in basislaboratoriuminstellingen.

We gebruiken een extractiemethode die het RNA behoudt zonder koudeketen en een detectiemethode die bestand is tegen remmers. Dit protocol is van belang voor de volksgezondheid. Het biedt een kader voor de beoordeling van virale reservoirs voor het milieu voor de huidige COVID-19-pandemie en andere infectieuze agentia tijdens toekomstige wereldwijde uitbraken.

Rekruteer burgerwetenschappers met behulp van een directe en duidelijke call-to-action die is vrijgegeven via lokale en sociale media. Maak een handvat voor sociale media om het onderwerp te verbinden met inhoud op sociale media. Maak een koppeling naar het SMP en zorg voor een meertalige plug-in waarmee personen in meerdere talen kunnen navigeren om deel te nemen aan de milieubemonsteringsinspanning door bioveiligheidsgerelateerde vragen te beantwoorden die in een online formulier zijn gespecificeerd.

Neem in de steekproefsectie grafische en audiovisuele protocollen op in het Engels en Spaans. Visualiseer georuimtelijke gegevens met behulp van een georuimtelijke applicatieprogrammeringsinterface die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider. Sla de gegevens op die via het SMP bij het LIMS worden ingediend om gecentraliseerde opslag, het volgen van verwerkingsworkflows en het beheer van de logistiek te vergemakkelijken.

Informatie vooraf laden, zoals voorbeeldkit-ID, voorbeeld-ID, datum, tijd en globale positioneringssysteemcoördinaten om naleving van gegevenstypen mogelijk te maken en de fout te minimaliseren. Voeg een koppeling voor het ophalen van monsters toe voor de deelnemers, die ze kunnen gebruiken zodra ze alle monsters hebben verzameld. Bouw een kit die alle bemonsteringsbenodigdheden bevat, inclusief de benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals masker en handschoenen, een bemonsteringsprotocol en bioveiligheidsrelevante informatie.

Swab zelden gedesinfecteerde oppervlakken in huishoudens en de stedelijke omgeving door een vierkante polyester absorberende swab van één centimeter te bevochtigen met een wasmiddel en een oppervlak van 10 centimeter in het kwadraat uit te zwabberen. Onderdompel elk monsterdoekje met behulp van een tandenstoker in de voorgelabelde buis met 200 microliter guanidiniumthiocyanaat. Draag het meegeleverde masker en een nieuw paar handschoenen voor het verzamelen van elk monster om kruisbesmetting te voorkomen.

Gebruik na het beëindigen van de bemonstering het meegeleverde handdesinfecterend middel. Bewaar de buizen op vier graden Celsius totdat ze naar het laboratorium worden getransporteerd. Zodra de monsters in het laboratorium aankomen, bewaar ze op min 80 graden Celsius.

Om de snelheid van de screening te verhogen, verwerkt u de monsters in pools. Als een pool positief is, moet u het RNA van elk monster onafhankelijk extraheren. Combineer de monsters uit elke bemonsteringskit in twee groepen door 50 microliter van elk van de acht monsters in een microcentrifugebuis te bundelen en de resterende monsters op te slaan bij min 80 graden Celsius.

Voeg 80 microliter chloroform en vortex toe gedurende 15 seconden. Incubeer vervolgens 20 minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer op 13.000 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.

Breng de waterige laag over in een nieuwe microcentrifugebuis. Bewaar de resterende interface en roze vloeistof in de min 80 graden Celsius vriezer. Deze fracties bevatten DNA en eiwitten.

Extracteer RNA uit de teruggewonnen waterige laag met behulp van een op guanidinium thiocyanaat gebaseerd RNA-protocol voor ruwe extractie. Bereid de RT-LAMP reactiemix voor op kamertemperatuur met 10% overtollig volume om het pipetverlies te verklaren. Voeg vijf microliters RNA toe aan de monsterreactie en vijf microliters RNA plus 2,5 microliter synthetisch SARS-CoV-2 RNA aan de piekreactie.

Voeg 2,5 microliter synthetische SARS-CoV-2 RNA toe aan de positieve controle en vijf microliter water aan de negatieve controle. Meng goed en draai de reacties naar beneden. Voor colorimetrische waarneming wordt een negatief resultaat aangegeven door roze en een positief resultaat door geel.

Voer na RT-LAMP gelelektroforese uit. De verdeling van de sites voor het verzamelen van monsters wordt hier weergegeven. Een meerderheid van de kits was compleet en de bijbehorende gegevens werden geüpload naar het LIMS.

De detectielimiet bij een frequentie van 100% was 500 kopieën per 25 microliter reactie. In de colorimetrische RT-LAMP veranderden positieve monsters van kleur van roze naar geel als gevolg van een pH-verschuiving van acht naar 5,5. Bij lage kopieeraantallen werden monsters op een agarosegel uitgevoerd om de positieven te bevestigen met het resulterende ladderachtige patroon.

RT QPCR-methoden werden getest met milieumonsters. Alle mastermixen waren gevoelig voor remmers bij lage copy number concentraties van de positieve controle. Bij lage concentraties van de sjabloon vertoonden traditionele RT PCR-methoden valse positieven en valse negatieven.

Ten slotte ontdekte een techniek genaamd rolling circle amplification kleine hoeveelheden van de doelvolgorde. Het toonde echter versterking van de sonde bij afwezigheid van een RNA-sjabloon. Het is van vitaal belang om een oproep tot actie uit te brengen die alle sectoren van de gemeenschap bereikt, zodat de steekproef echt het risico van blootstelling van alle leden van die gemeenschap vertegenwoordigt.

Dit raamwerk detecteert SARS-CoV-2 genetisch materiaal. Studies om virale levensvatbaarheid te testen zijn de volgende stap.