Ganglioside extractie, zuivering en profilering

Gangliosiden komen tot expressie op alle gewervelde celoppervlakken en zijn vooral overvloedig aanwezig op zenuwcellen. Ze reguleren celsignalering en celcelherkenning. Dit protocol introduceert ganglioside isolatie en analyse.

De technieken werden geselecteerd om de gangliosideopbrengsten op grote en kleine schaal te maximaliseren en tegelijkertijd de zuivering te stroomlijnen. We beschrijven ook methoden om relatief snel kwalitatieve en semikwantitatieve ganglioside analyses uit te voeren. Onderzoek naar lipiden, vooral polaire lipiden zoals gangliosiden, vereist andere hulpmiddelen en technieken dan het werken met eiwitten of nucleïnezuren.

Deze video maakt je vertrouwd met hoe je met deze moleculen kunt werken. Omdat oplosmiddelen zoals chloroform en tetrahydrofuran veel voorkomende kunststoffen oplossen, gebruiken we glazen flessen en flacons met met teflon beklede doppen, glazen pipetten, glas, roestvrijstalen microsyringes en teflonglashomogenisatoren tijdens deze procedures. Als u dit niet doet, resulteert dit in plastic polymeren in de producten die de analyses kunnen verstoren.

Voeg om te beginnen 4,1 milliliter water per gram weefsel nat gewicht toe en homogeniseer het met 10 slagen. Voeg 13 milliliter methanol per gram weefsel toe. Breng het over naar een omgevingstemperatuur van 22 graden Celsius en meng.

Breng het weefsel over naar een dikwandige, glazen buis met schroefdeksel met een PTFE-gevoerde schroefdop en meng grondig. Voeg 6,5 milliliter chloroform per gram weefsel toe, dop het af en meng grondig. Centrifugeer op 450 maal g gedurende 15 minuten.

Breng vervolgens het heldere supernatant over naar een verse buis met schroefdeksel en meet het volume als teruggewonnen extractvolume. Voeg voor partitionering 0,173 keer het teruggewonnen extractvolume water toe aan het heldere supernatant. Sluit het dan af.

Vortex krachtig. Centrifugeer op 450 maal g gedurende 15 minuten. Breng de bovenste fase, die de gangliosiden bevat, over in een verse, glazen buis met een met PTFE beklede schroefdop.

Als u reverse-phase cartridge chromatography wilt uitvoeren, gebruikt u een glazen spuit van vijf milliliter om een tC18 vastefasige extractiecartridge te wassen met drie milliliter methanol. Voeg vervolgens drie milliliter chloroform-methanol-water toe in een verhouding van twee tot 43 tot 55. Laad de bovenste fase van de vorige stap op de tC18-patroon door dezelfde glazen spuit.

Verzamel de doorstroming en laad deze opnieuw op de kolom om de adsorptie te optimaliseren. Was de patroon met drie milliliter chloroform-methanol-water en vervolgens met drie milliliter methanol-water. Eluteer de gangliosiden met drie milliliter methanol in een verse buis met schroefdeksel.

Verdamp tot een droge onder een zachte stroom stikstof bij een temperatuur lager dan of gelijk aan 45 graden Celsius. Los op in methanol met één milliliter per gram oorspronkelijk weefsel nat gewicht. Doe 100 gram grijze stof in de hersenen in een blender en voeg een milliliter per gram hersenvochtig gewicht gekoelde, 10-millimolar kaliumfosfaatbuffer van pH 6,8 toe.

Homogeneer vervolgens gedurende 20 seconden op laag. Voeg acht milliliter tetrahydrofuraan per gram hersenvochtig gewicht toe en homogeniseer gedurende 10 seconden op laag. Decanteer in glazen centrifugeflessen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 5.000 maal g.

Verzamel het supernatant, meet het volume en breng het vervolgens over naar een glazen scheidingstrechter. Voeg 0,3 milliliter ethylether per milliliter van het supernatant toe. Schud krachtig.

Laat het vervolgens 30 minuten ongestoord zitten, waarbij twee fasen, een bovenste etherfase en een lagere waterige fase, zich scheiden. Verzamel de onderste fase, die de gangliosiden bevat, in een glazen fles met een ptfe-gevoerde dop. Voeg aan de bovenste etherfase die in de separatortrechter overblijft 0,1 milliliter water per milliliter oorspronkelijk supernatant uit de vorige stap toe.

Schud krachtig. Laat fasen scheiden. Verzamel vervolgens de onderste waterige fase en combineer deze met de eerder verzamelde lagere fase.

Verdamp de gecombineerde onderste fasen tot een droog poeder en weeg het. Om omgekeerde fasechromatografie uit te voeren, moet u een grootschalige tC18 vastefasige extractiepatroon voorspoelen door 50 milliliter oplosmiddelen door de kolom te laten gaan met behulp van vacuüm of druk gedurende minder dan één minuut per wasbeurt. Belast de bovenste fase van de scheiding na verzepingsfase op de kolom door vacuüm of druk.

Verzamel vervolgens de doorstroming, laad deze opnieuw en verzamel de doorstroming opnieuw voor latere analyse. Was de kolom met elk 30 milliliter chloroform-methanol-water, gevolgd door methanol-water. Elueer vervolgens de gangliosiden met 50 milliliter methanol en dan weer met 10 milliliter methanol.

Verzamel elke was en elutie afzonderlijk. Gebruik dunnelaagchromatografie, of TLC, om te bevestigen dat gangliosiden afwezig zijn in de doorstroom en wassingen en geëlueerd in de eerste elutie van methanol. Verdamp de geëlueerde gangliosiden tot een droog poeder en weeg ze.

Om TLC uit te voeren, giet u het oplosmiddel in een glazen TLC-kamer van 10 bij 10 centimeter met een roestvrijstalen deksel, zodat de oplosmiddeldiepte 0,5 centimeter is. Bedek de kamer en laat deze ongeveer 10 minuten in evenwicht blijven. Was een Hamilton-spuit van 10 microliter met een afgeschuinde naald met methanol.

Trek één microliter methanol in een glazen spuit om het naalddoodvolume te vullen en vervolgens één microliter monster of standaard. Plaats het monster gelijkmatig op de vooraf gemarkeerde lijnen van vijf millimeter totdat er minder dan één microliter methanoloplosmiddel in de spuit achterblijft. Laat de plaat drogen bij 22 graden Celsius nadat alle monsters zijn gespot.

Plaats de gevlekte en gedroogde plaat op de voorgebalanceerde TLC-kamer met de onderrand ondergedompeld in het oplosmiddel. Laat het lopende oplosmiddel door capillaire werking de plaat opschuiven totdat de voorkant van het oplosmiddel binnen een centimeter van de bovenkant van de plaat komt. Verwijder en markeer de voorkant van het oplosmiddel aan de rand van de plaat met een potlood.

Laat de oplosmiddelen volledig ongestoord of onder een milde luchtstroom verdampen. Plaats in een chemische zuurkast de TLC-plaat met de opgeloste gangliosidenoorsprong ondersteboven in een weggesneden kartonnen doos om de wanden van de kap te beschermen tegen zure spray. Plaats resorcinol spray reagens in een glazen TLC sproeier.

Bevestig het aan een bron van stikstof onder druk en spuit de plaat licht diagonaal in de verticale en horizontale richting. Bedek de plaat onmiddellijk met een schone, droge, glazen afdekplaat van dezelfde afmetingen en bevestig de afdekplaat op zijn plaats met bindmiddelclips. Verwarm de afgedekte plaat gedurende 20 minuten op 125 graden Celsius.

Gangliosiden zien er donkerpaars uit tegen een witte achtergrond. Om lipidekleuring uit te voeren, dompelt u de TLC-plaat met de opgeloste gangliosidenoorsprong naar beneden in een bekerglas met de anisaldehydekleuring. Dompel je iets meer dan twee seconden onder naar het lopende front.

Laat het dan uitlekken. Verwarm de TLC-plaat op een hete plaat op een lage temperatuur om zich te ontwikkelen. Dit protocol biedt gangliosiden in voldoende hoeveelheid en zuiverheid voor kwalitatieve en kwantitatieve bepaling.

TLC-resolutie van één microliter biedt voldoende materiaal voor resorcinoldetectie en lost alle belangrijke hersengangliosiden op voor wildtype en genetisch gemodificeerde muizen. Hoewel de bereide gemengde gangliosiden niet vrij zijn van andere belangrijke lipiden, zijn ze van voldoende zuiverheid voor massaspectrometrische bepaling, hetzij als inheemse gezuiverde gangliosiden in negatieve modus of na pre-methylatie in positieve modus. Grootschalige zuivering omvat extractie, verzeping en HPLC-resolutie om gezuiverde belangrijke hersengangliosiden te bieden die geschikt zijn voor biologische experimenten en voor verdere chemische en enzymatische modificaties.

Een voorbeeldig HPLC-profiel en daaropvolgende TLC-analyse worden getoond. Alkalibehandeling, of verzeping, is noodzakelijk om verontreinigende fosfolipiden te hydrolyseren en te verwijderen, maar zal ook natuurlijke modificaties van gangliosiden zoals O-geacetyleerde siaalzuren hydrolyseren, wat in sommige contexten belangrijk kan zijn. Nauwkeurige oplosmiddelverhoudingen voor extractie, oplosmiddelverdeling en TLC-resolutie zijn van cruciaal belang om het herstel, de zuiverheid en analyses te verbeteren.

Van kanker tot metabolisme tot hersenfunctie, gangliosiden zijn fysiologische modifiers en therapeutische doelen. Ganglioside-isolatie, zuivering en analyses zijn hoekstenen voor biomedische ontdekking en therapeutische ontwikkeling.