Name: Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Leer een methode voor het evalueren van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en het identificeren van epitopen bij chronische hepatitis B-infectie. Deze aanpak combineert peptidestimulatie met flowcytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) en Chinese Key Project Gespecialiseerd voor Infectieziekten (2018ZX10723203).

Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt die in het onderzoek werd opgenomen. Het studieprotocol voldoet aan de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki van 1975, zoals weerspiegeld in a priori goedkeuring door de medisch-ethische commissie van het Southwest Hospital.
1. Ontwerp van de hbv-afgeleide peptidematrix
<ol><li>Download aminozuursequenties van het HBV-kernantigeen uit NCBI-databases (GenBank: AFY98989.1).</li>
	<li>Koop HBV-kernantigeen afgeleide peptiden (een panel van 35 15-mer peptiden overlappend door 10 residuen, zuiverheid > 90%, 4 mg / peptide) van een peptidesynthesedienstverlener.</li>
	<li>Stel een vierkante 6×6 peptidematrix in met elke positie in de matrix die slechts 1 peptide bevat. Er zijn 12 peptide pools: 6 rij peptide pools en 6 kolom peptide pools, 5-6 peptiden in elke pool16. De rijpeptidepools en de kolompeptidepools in de matrix vertegenwoordigen 2 afzonderlijke formaties van HBV-kernantigeen.</li>
	<li>Meng voor 3/4 van de gekochte peptiden peptiden in dezelfde rij /kolom van de matrix in 12 afzonderlijke peptidepools door ze samen op te lossen in dimethylsulfoxide (DMSO) (2 μg / μL voor elk peptide). Bewaren bij -80 °C voor analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen.</li>
	<li>Los de rest van de peptiden afzonderlijk op (10 μg/μL) en bewaar bij -80 °C voor epitoopidentificatie.</li>
</ol>2. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's)
<ol><li>Monster 5 ml veneus bloed van patiënten met chronische HBV-infectie. OPMERKING: Het bloedvolume moet ruwweg worden geschat op basis van het aantal peptidepools plus 1 achtergrondcontrole en 1 positieve controle. Analyse van 1 peptidepool heeft 3 x 105 PBMC's nodig. Gemiddeld konden 1 x 106 PBMC's worden verkregen uit 1 ml bloed.</li>
	<li>Isoleer PBMC's uit bloed met behulp van Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie (800 × g, 20 min) en cryopreserve geïsoleerde PBMC's in vloeibare stikstof voor later gebruik.</li>
	<li>Gebruik een Pasteur pipet om granulocyten te verzamelen tussen de heldere Ficoll-laag en de rode bloedcellaag. Extraheer genomisch DNA uit granulocyten met behulp van een genomische DNA-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Stuur het DNA-monster naar genotyperingsserviceproviders om het HLA-DRB1-genotype te bepalen.</li>
</ol>3. In vitro expansie van PBMC's met behulp van een HBV Peptide Matrix
<ol><li>Ontdooi PBMC's.<ol>
<li>Warme RPMI 1640 aangevuld met 1:10.000 benzonase (25 U/ml) tot 37 °C in een waterbad. OPMERKING: Benzonase helpt om celklonteren tijdens het ontdooien te beperken. Elk monster vereist 20 ml RPMI 1640 met benzonase. Bereken de hoeveelheid die nodig is om alle monsters te ontdooien en bereid een apart aliquot van media (37 °C) met 1:10.000 Benzonase (25 E/ml). Ontdooi niet meer dan 5 monsters tegelijk.</li>
		<li>Verwijder monsters van vloeibare stikstof en ontdooi bevroren injectieflacons snel in een waterbad (37 °C).</li>
		<li>Breng de ontdooide celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml. Voeg 1 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) druppelsgewijs toe aan de buis. Voeg langzaam 6 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) toe aan de centrifugebuis, spoel cryoviaal met nog eens 2 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) om alle cellen op te halen. Ga zo snel mogelijk verder met de rest van de monsters. OPMERKING: Langzame verdunning van gecryopreserveerde monsters is de sleutel tot het behoud van de levensvatbaarheid van ontdooide cellen.</li>
		<li>Centrifugeer (400 × g, 10 min), verwijder het supernatant en maak de pellet los door op de buis te tikken.</li>
		<li>Resuspend de pellet voorzichtig in 1 ml warme benzonase RPMI 1640. Meng voorzichtig en filter cellen door een celzeef van 70 μm indien nodig (d.w.z. als er een zichtbare klomp bestaat).</li>
		<li>Aliquot een suspensie van 10 μL en verdun in Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), voeg Trypan blauw (0,04%) toe, laad op een hemocytometer, wacht 1 minuut en tel het aantal levensvatbare cellen (heldere cellen).</li>
		<li>Voeg 9 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) toe aan de buis, centrifugeer (400 × g, 10 min), verwijder het supernatant en maak de pellet los door op de buis te tikken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend PBMC's in RPMI 1640 aangevuld met 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 10% humaan AB-serum (volledig kweekmedium). Pas de celdichtheid aan tot 1,5 x10 6 cellen/ml. Plaat PBMC's in 96-well platen (vlakke bodem) met een dichtheid van 3 x 105 cellen/put.</li>
	<li>Voeg HBV-afgeleide peptidepools (2 μg / ml voor elk afzonderlijk peptide) toe aan elke put. Voeg voor putjes van achtergrondcontrole en positieve controle dezelfde hoeveelheid oplosmiddel (DMSO, 1 μL/ml) toe. Voeg 10 U/ml IL-2 en 10 ng/ml IL-7 toe. Incuberen bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Vul op dag 3 het kweekmedium aan met 50 U/ml IL-2 en 10 ng/ml IL-7. OPMERKING: Gedurende dag 1 tot dag 3 zal er geen duidelijke T-celproliferatie worden waargenomen. Het totale celaantal zal meestal afnemen met 1/3 tot 1/2, als gevolg van de dood van niet-T-cellen zoals B-cellen, NK-cellen, NKT-cellen en monocyten.</li>
	<li>Vervang op dag 7 de helft van het kweekmedium door vers medium met peptiden (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) en IL-7 (20 ng/ml). OPMERKING: Om te voorkomen dat de cellen aan de onderkant worden verstoord, pipetteer u ongeveer 90 μL kweekmedium zorgvuldig vanaf de bovenkant van het medium. Gedurende dag 3 tot dag 7 zal robuuste T-celproliferatie worden waargenomen en prolifererende T-cellen aggregeren meestal om clusters te vormen.</li>
	<li>Pipetteer op dag 10 voorzichtig celkweek in elke put 7-9 keer om celclusters uit te splitsen, het aantal levensvatbare cellen te tellen en 2×105 cellen in elke put over te brengen naar een 96 putplaat (ronde bodem) voor HBV-specifieke CD4 T-celresponsanalyse.</li>
	<li>Ga door met het kweken van de rest van de cellen voor epitoopidentificatie op dag 12, pas het volume van het kweekmedium aan op 100 μL (waarbij overmatig medium wordt weggegooid) en vul de cultuur aan met 100 μL vers volledig kweekmedium met peptiden (4 μg / ml), IL-2 (100 U / ml) en IL-7 (20 ng / ml). OPMERKING: Gedurende dag 7 tot dag 10 blijven T-cellen zich krachtig vermenigvuldigen. Vervang het kweekmedium zoals in stap 3.5 als het medium geel wordt. Over het algemeen zal het celgetal op dag 10 hoger zijn dan 6×105. Elke put toont meestal een vergelijkbaar celnummer, telt het celnummer in 3 putten en gebruikt de gemiddelde waarde als schatting van het celnummer voor alle putten.</li>
</ol>4. Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen door intracellulaire flowcytometrie
<ol><li>Pbmc's stimuleren met peptidepools<ol>
<li>Voor de cellen overgebracht naar de 96 putplaat (ronde bodem), was 3 keer in een plaat (550 × g, 3 min). Gebruik 200 μL medium voor elke wasbeurt (RPMI 1640 voor de eerste 2 wasbeurten, compleet kweekmedium voor de laatste wasbeurt). Gooi de supernatanten weg. OPMERKING: Verwijdering van resterende cytokines in de kweek door herhaald wassen zou de achtergrond in intracellulaire flowcytometrie-analyse effectief kunnen verminderen.</li>
		<li>Voeg voor elke bron van cellen gestimuleerd met een specifieke peptidepool 200 μL volledig kweekmedium toe, aangevuld met dezelfde peptidepools (2 μg / ml voor elk afzonderlijk peptide). Voeg voor de bron van achtergrondcontrole een volledig kweekmedium toe, aangevuld met 1 μL/ml DMSO. Voeg voor de bron van positieve controle een volledig kweekmedium toe aangevuld met 1 μL / ml DMSO, 150 ng / ml phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en 1 μmol / l ionomycine. OPMERKING: Een hoge dosis DMSO blokkeert de cytokinesecretie van T-cellen (het meest significant voor TNF-α). Een dosis DMSO hoger dan 5 μL/ml wordt niet aanbevolen. Over het algemeen is de dosis DMSO in ons experiment niet hoger dan 1 μL / ml.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 6 uur.</li>
		<li>Voeg na 1 uur incubatie Monensin (1,37 μg/ml) toe aan de kweek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flowcytometrie<ol>
<li>Na 6 uur incubatie. Verwijder supernatant na centrifugeren (550 × g, 3 min), wascellen eenmaal met 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), vlekoppervlakmarkeringen (CD3, CD4 en CD8) en levensvatbaarheidsmarker (met fixable viability dye) in een koelkast van 4 °C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Eenmaal wassen met 200 μL DPBS (550 × g, 3 min). Fixeer en permeabiliseer cellen en kleur intracellulaire cytokines (TNF-α en IFN-γ) in een koelkast van 4 °C gedurende 45 minuten.</li>
		<li>Na de laatste wassing in intracellulaire kleuring, resuspend cellen in 150 μL flowcytometriebuffer (DPBS + 0,5% BSA).</li>
		<li>Verkrijg flowcytometriegegevens op een flowcytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse van flowcytometrieresultaten<ol>
<li>Definitie van positieve put: beschouw een put als positief als het een frequentie heeft van cytokine die T-cellen afscheidt ten minste twee keer van de achtergrondcontrole goed (Figuur 1).</li>
		<li>Bereken volgens de volgende formule het responspercentage voor elk geanalyseerd cytokine (figuur 2): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62387/62387eq01.jpg"> OPMERKING: De rijpeptidepool en de kolompeptidepools in de matrix vertegenwoordigen 2 verschillende formaties van HBV-kernantigeen, dus de uiteindelijke responssnelheid moet worden gedeeld door 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Identificatie van HBV-specifieke HLA-DR Restricted CD4 T-cell Epitopen
<ol><li>Ontdooi en onderhoud allogene B-lymfoblastoïde cellijnen (BLCLs) in T-75-kolf (5-20 ×106 cellen, 20 ml volledig kweekmedium). OPMERKING: Om de goede toestand van BLCLs te garanderen, moet deze stap 2 weken voor het ontdooien van de PBMC's van patiënten worden gestart. BLCLs moeten homozygoot zijn in HLA-DRB1-allel. Volgens het genotyperingsresultaat moeten patiënten hetzelfde HLA-DRB1-allel delen als BLCLs.</li>
	<li>Screening van kandidaat-peptiden voor identificatie (Figuur 3)<ol>
<li>Volgens de resultaten van het T-celresponspercentage op dag 10, screen 2 peptidepools met het hoogste responspercentage (1 rij peptidepool en 1 kolompeptidepool).</li>
		<li>Stel het peptide in die 2 pools in als kandidaat-peptide als de andere peptidepool die dit peptide bevat ook een positief resultaat laat zien in T-celresponsanalyse. Gebruik de PBMC's uitgebreid met de andere peptidepool voor epitoopidentificatie later.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulserende BLCLs met peptide<ol>
<li>Tel op dag 12 het aantal levensvatbare BLCLs, breng cellen over naar 15 ml centrifugebuizen, centrifugeer (350 × g, 10 min) en verwijder het supernatant. Resuspend de celkorrel in volledig kweekmedium en aliquot BLCLs op een 96-well plaat (ronde bodem) bij 4×104 cellen/put in 80 μL volledig kweekmedium.</li>
		<li>Voeg een enkel peptide (10 μg/ml) toe, incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 uur. Set 2 achtergrondcontrole: peptidepulsing met HLA-DR-blokkering (voorbehandeling met anti-HLA-DR (10 μg /ml) gedurende 1 uur); DMSO (1 μL/ml) pulserend. Het uiteindelijke volume van het volledige kweekmedium in elke put is 100 μL.</li>
		<li>Voeg mitomycine C (100 μg/ml) toe, incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.</li>
		<li>Was 3 keer met 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in een plaat om niet-gepulseerd peptide en mitomycine C te verwijderen. Vul voor de eerste wasbeurt de incubatiecultuur aan met 100 μL RPMI 1640.</li>
		<li>Resuspend cellen in 120 μL volledig kweekmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het stimuleren van PBMC's met peptide gepulste BLCLs.<ol>
<li>Breng op dag 12 PBMC's over naar een 96-well plaat (ronde bodem).</li>
		<li>Verwijder het supernatant na centrifugeren (550 × g, 3 min) in een plaat, een wasbeurt tweemaal met 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in een plaat. OPMERKING: Verwijdering van resterende cytokines en peptiden in de cultuur door herhaald wassen is de belangrijkste stap om de achtergrond in intracellulaire flowcytometrie-analyse te verminderen. Vooral voor resterende peptiden zal het binden aan BLCLs en de achtergrond aanzienlijk vergroten.</li>
		<li>Resuspend PBMC's bij elke put met 210 μL volledig kweekmedium.</li>
		<li>Voor de put van PBMC's die zijn gekozen voor epitoopidentificatie, mengt u de aliquot (elk 70 μL) met peptide gepulste BLCLs (3 putten, inclusief 2 achtergrondcontroles). OPMERKING: Op dag 12 zal het aantal peptidepools uitgebreide PBMC's meestal oplopen tot meer dan 5-7×105 per put, dus de verhouding van PBMC's / BLCLs is ongeveer 6/1 tot 4/1.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 6 uur.</li>
		<li>Voeg na 1 uur incubatie Monensin (1,37 μg/ml) toe aan de kweek. Het uiteindelijke volume van het volledige kweekmedium in elke put is 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flowcytometrie<ol>
<li>Herhaal dezelfde bewerkingen als in stap 4.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse van flowcytometrieresultaten<ol>
<li>Verifieer een peptide als een HLA-DR-beperkt CD4 T-cellen epitoop als PBMC's geïncubeerd met dit peptide gepulseerde BLCLs een frequentie vertonen van cytokine afscheiding CD4 T-cellen ten minste twee keer van de PBMC's geïncubeerd met achtergrondcontroles (peptide pulseren met HLA-DR pre-blocking; DMSO pulserend) (Figuur 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+T-cell+epitopes+in+hepatitis+B+virus%3A+identification%2C+genotypic+variation+and+relevance+to+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Therapy%22%5BJournal%5D)">A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics.</a> Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).</li>
<li>Mizukoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+responses+to+the+hepatitis+B+virus+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase.</a> Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).</li>
<li>Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CD137+to+study+the+full+repertoire+of+CD8%2B+T+cells+without+the+need+to+know+epitope+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities.</a> Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).</li>
<li>Reiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+activation+induced+marker+%28AIM%29+assays+for+sensitive+identification+of+antigen-specific+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells.</a> PLoS One. 12, 0186998(2017).</li>
<li>Herati, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successive+annual+influenza+vaccination+induces+a+recurrent+oligoclonotypic+memory+response+in+circulating+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells.</a> Science Immunology. 2, (2017).</li>
<li>Bowyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+Markers+Detect+Vaccine-Specific+CD4%2B+T+Cell+Responses+Not+Measured+by+Assays+Conventionally+Used+in+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials.</a> Vaccines. 6, (2018).</li>
<li>Morou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+differentiation+is+central+to+HIV-specific+CD4%28%2B%29+T+cell+dysfunction+in+progressive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease.</a> Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).</li>
<li>Grifoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targets+of+T+Cell+Responses+to+SARS-CoV-2+Coronavirus+in+Humans+with+COVID-19+Disease+and+Unexposed+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals.</a> Cell. 181, 1489-1501 (2020).</li>
<li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Regulatory+and+Cytotoxic+SARS-CoV-2-Reactive+CD4%2B+T+Cells+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19.</a> Cell. , (2020).</li>
<li>Boni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hepatitis+B+virus+%28HBV%29-specific+T-cell+dysfunction+in+chronic+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection.</a> Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).</li>
<li>Chang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+hepatitis+B+virus+%28HBV%29-specific+CD4%2B+T-cell+responses+in+human+immunodeficiency+virus+type+1-HBV-coinfected+individuals+receiving+HBV-active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).</li>
<li>Boni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restored+Function+of+HBV-Specific+T+Cells+After+Long-term+Effective+Therapy+With+Nucleos%28t%29ide+Analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues.</a> Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).</li>
<li>Kennedy, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+T-cell+function+in+children+and+young+adults+with+immune-tolerant+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).</li>
<li>de Niet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+T+cell+function+in+chronic+hepatitis+B+patients+upon+treatment+with+interferon+based+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy.</a> Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).</li>
<li>Rinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus-specific+T+cell+responses+after+stopping+nucleos%28t%29ide+analogue+therapy+in+HBeAg-negative+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B.</a> Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1%2FIFN-%CE%B3+profile+of+HBV-specific+CD4+T+cells+is+associated+with+liver+damage+and+viral+clearance+in+chronic+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection.</a> Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).</li>
<li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li>
<li>Anthony, D. D., Lehmann, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+epitope+mapping+using+the+ELISPOT+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach.</a> Methods. 29, 260-269 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De meest kritieke stappen in dit protocol worden als volgt opgesomd: 1) voldoende PBMC's met een hoge levensvatbaarheid om pbmc-uitbreiding te starten; 2) geschikte omgeving voor pbmc-uitbreiding; en 3) volledige verwijdering van resterende peptidepools in PBMC-cultuur vóór epitoopidentificatie.
Alle analyse in dit protocol hangt af van de robuuste proliferatie van CD4 T-cellen. Over het algemeen zal het aantal PBMC's na 10-daagse uitbreiding 2-3 keer het oorspronkelijke aantal zijn. Het celnu...

Momenteel zijn er 3 hoofdbenaderingen om antigeenspecifieke T-cellen te analyseren. De eerste benadering is gebaseerd op de interactie tussen de T-celreceptor en het peptide (epitoop). Antigeenspecifieke T-cellen kunnen direct worden gekleurd met peptide-major histocompatibiliteitscomplex (MHC) multimeren. Het voordeel van deze methode is dat het levensvatbare antigeenspecifieke T-cellen kan verkrijgen, geschikt voor downstream transcriptomics / metabolomics-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over de hele T-celrespons op een specifiek antigeen, omdat het gevalideerde epitooppeptiden vereist, terwijl het aantal geïdentificeerde epitopen voor een specifiek antigeen voorlopig beperkt is. Vergeleken met hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD8 T-cel epitopen zijn er minder HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen geïdentificeerd1,2, waardoor deze methode momenteel minder toepasbaar is voor de analyse van HBV-specifieke CD4 T-cellen.
De tweede benadering is gebaseerd op de upregulatie van een reeks activeringsgeïnduceerde markers na antigeenpeptidestimulatie3. De meest gebruikte markers zijn CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Deze methode is nu gebruikt om antigeenspecifieke T-celresponsen te analyseren bij gevaccineerde personen5,6,human immunodeficiëntievirusinfectiepatiënten7en ernstig acuut respiratoir syndroom Coronavirus 2 infectiepatiënten8,9. In tegenstelling tot de op peptide-MHC-multimeren gebaseerde test, wordt deze methode niet beperkt door gevalideerde epitopen en kunnen levensvatbare cellen verkrijgen voor downstream-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over het cytokineprofiel van antigeenspecifieke T-cellen. Ook kan de expressie van deze activerings-geïnduceerde markers door sommige geactiveerde antigeen-niet-specifieke cellen bijdragen aan de achtergrondsignalen in de analyse, wat een probleem kan zijn, vooral wanneer de doelantigeenspecifieke T-cellen zeldzaam zijn. Momenteel is er beperkte toepassing van deze methode op HBV-specifieke CD4 T-cellen4. Of deze methode kan worden gebruikt om HBV-specifieke CD4 T-cellen op een betrouwbare manier te analyseren, moet verder worden onderzocht.
De derde benadering is gebaseerd op de cytokinesecretie na antigeenpeptidestimulatie. Net als activeringsgeïnduceerde markergebaseerde analyse wordt deze methode niet beperkt door gevalideerde epitopen. Deze methode zou direct het cytokineprofiel van antigeenspecifieke T-cellen kunnen onthullen. De gevoeligheid van deze methode is lager dan de activeringsgeïnduceerde markergebaseerde methode, omdat deze afhankelijk is van de cytokinecretie van antigeenspecifieke T-cellen en het aantal geteste cytokines meestal beperkt is. Momenteel wordt deze methode veel gebruikt bij de analyse van HBV-specifieke T-cellen. Omdat cytokine-afscheidende HBV-specifieke T-cellen nauwelijks konden worden gedetecteerd door directe ex vivo peptidestimulatie10,11,wordt het cytokineprofiel van HBV-specifieke T-cellen meestal geanalyseerd na 10-daagse in vitro peptide gestimuleerde expansie12,13,14,15,16. Rangschikking van peptidepools in een matrixvorm is gebruikt om de identificatie van antigeenspecifieke epitopen17,18te vergemakkelijken. Met de combinatie van peptidematrix en cytokinesecretieanalyse is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen tegelijkertijd te identificeren16. In dit protocol worden de details van deze methode beschreven. HBV-kernantigeen wordt gekozen als voorbeeld van demonstratie in dit protocol.

<table><tbody><tr><td>Albumin Bovine V (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST023</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated Anti-human TNF-&alpha;</td><td>eBioscience</td><td>17-7349-82</td><td>Beschermd houden tegen licht</td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Beperk celkluwen</td></tr><tr><td>B lymfoblastoïde cellijnen (BLCL's)</td><td>FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER</td><td>IHW09126</td><td>HLA-DRB1*0803 homozygoot</td></tr><tr><td>B lymfoblastoïde cellijnen (BLCL's)</td><td>FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER</td><td>IHW09121</td><td>HLA-DRB1*1202 homozygoot</td></tr><tr><td>Celkweker (T75)</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Celkwekerplaat (96-well, platte bodem)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Vlakke bodem</td></tr><tr><td>Celkwekerplaat (96-well, ronde bodem)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Ronde bodem</td></tr><tr><td>Celzeef</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td>Poriegrootte 70&nbsp;&mu;m, wit, steriel</td></tr><tr><td>Centrifugebuis (15 mL)</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Centrifugebuis (50 mL)</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Centrifuge, Gekoeld</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, Gekoeld</td><td>Thermo</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, Gekoeld</td><td>Thermo</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set)</td><td>BD Biosciences</td><td>562574</td><td>Bereid oplossing voor gebruik</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Bij kamertemperatuur bewaren om kristallisatie te voorkomen</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td></td><td></td><td>Bereid ddH2O (1000 ml) met NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), en Na2HPO4.7H2O (2160&nbsp; mg). PH aanpassen naar 7.4. Steriliseren door middel van autoclaaf.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Filtertips (0,5-10)</td><td>Kirgen</td><td>KG5131</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Filtertips (100-1000)</td><td>Kirgen</td><td>KG5333</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Filtertips (1-200)</td><td>Kirgen</td><td>KG5233</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>FITC-conjugated Anti-human CD4</td><td>BioLegend</td><td>300506</td><td>Beschermd houden tegen licht</td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>Beschermd houden tegen licht</td></tr><tr><td>GolgiStop Eiwit Transport Inhibitor (Monensin bevattend)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Eiwit Transport Inhibitor</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Brand</td><td>718620</td><td></td></tr><tr><td>HBV Core Antigen Afgeleide Peptiden</td><td>ChinaPeptides</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Human Serum AB</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-51</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395-0500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100781-0500</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuis (1,5 mL)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td>Geautoclaveerde sterilisatie voor gebruik</td></tr><tr><td>Microplate Shakers</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100348-0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241-0500</td><td></td></tr><tr><td>PCR buizen (0,2 mL)</td><td>Kirgen</td><td>KG2331</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8</td><td>BioLegend</td><td>300914</td><td>Beschermd houden tegen licht</td></tr><tr><td>PE-conjugated Anti-human IFN-&gamma;</td><td>eBioscience</td><td>12-7319-42</td><td>Beschermd houden tegen licht</td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3</td><td>eBioscience</td><td>45-0037-42</td><td>Beschermd houden tegen licht</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat,100mM</td><td>Gibco</td><td>15360070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR</td><td>BioLegend</td><td>307648</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van hbv-specifieke cd4 t-celresponsen en identificatie van hla-dr-beperkte cd4 t-cel epitopen op basis van een peptidematrix

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

CD4 T-cellen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van chronische hepatitis B. Als een veelzijdige celpopulatie zijn CD4 T-cellen geclassificeerd als verschillende functionele subsets op basis van de cytokines die ze hebben uitgescheiden: bijvoorbeeld IFN-γ voor CD4 T-helper 1-cellen, IL-4 en IL-13 voor CD4 T-helper 2-cellen, IL-21 voor CD4 T folliculaire helpercellen en IL-17 voor CD4 T-helper 17-cellen. Analyse van hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD4 T-cellen op basis van cytokinesecretie na HBV-afgeleide peptidenstimulatie zou niet alleen informatie kunnen opleveren over de omvang van HBV-specifieke CD4 T-celrespons, maar ook over de functionele subsets van HBV-specifieke CD4 T-cellen. Nieuwe benaderingen, zoals transcriptomics en metabolomics-analyse, kunnen meer gedetailleerde functionele informatie opleveren over HBV-specifieke CD4 T-cellen. Deze benaderingen vereisen meestal isolatie van levensvatbare HBV-specifieke CD4 T-cellen op basis van peptide-major histocompatibiliteit complex-II multimeren, terwijl momenteel de informatie over HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen beperkt is. Op basis van een hbv-afgeleide peptidematrix is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen gelijktijdig te identificeren met behulp van perifere bloedmononucleaire celmonsters van chronische HBV-infectiepatiënten.

De frequentie van cytokine-afscheidende CD4 T-cellen wordt berekend als de som van zowel enkele producenten als dubbele producenten. Zoals aangetoond in figuur 1,zijn de frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen in background control (DMSO) afscheiden respectievelijk 0,154% en 0,013%. De frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden die specifiek zijn voor peptidepool Core11 zijn resp...

Op basis van een van hepatitis B-virus (HBV) afgeleide peptidematrix konden HBV-specifieke CD4 T-celresponsen parallel aan de identificatie van HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen worden geëvalueerd.

Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

Bij een chronische HBV-infectie spelen CD4 T-cellen een belangrijke rol bij zowel de virale klaring als de terugkeerders. Deze methode stelt ons in staat om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en tegelijkertijd HBV-specifieke CD4 T-celepithopen te identificeren. De procedure wordt gedemonstreerd door Jianmei Xiao, een onderzoeksassistent.En Xing Wan, een technicus uit Bilao. Isoleer om te beginnen perifere mononucleaire bloedcellen, of PBMC's, uit bloed, met behulp van Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie op 800 keer G gedurende 20 minuten. Verzamel vervolgens de granulocyten tussen de en rode bloedcellaag, met behulp van een pasteurpipet.Breng de ontdooide celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 milliliter, voeg een milliliter van de voorverwarmde Benzonase RPMI 1640 toe, druppelgewijs en voeg dan langzaam nog eens zes milliliter toe. Spoel de cryoflacon met twee milliliter Benzonase RPMI 1640 om de resterende cellen op te halen. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende 10 minuten op 400 keer G.Verwijder het supernatant en maak de pellet los door op de buis te tikken. Suspensie de pellet voorzichtig opnieuw in één milliliter warme Bensenase NACE RPMI 1640. Meng de cellen voorzichtig en filter ze door een celzeef van 70 micrometer, als er celklonten zichtbaar zijn.Tel levensvatbare cellen met behulp van trypan blue en een hemocytometer. Suspensie van de PBMC's en het volledige kweekmedium, met 10 eenheden per milliliter IL2 en 10 nanogram per milliliter IL7. Pas de celdichtheid aan op 1,5x10 voor de 6 cellen per milliliter.Plaats vervolgens de cellen in 96-Well vlakke bodemplaten met een dichtheid van 3x10 tot de vijfde cellen per put. Voeg hepatitis B-virus of HBV afgeleide peptidepools toe aan elke put. Voeg voor de achtergrond en positieve controleputten dezelfde hoeveelheid oplosmiddel toe.Incubeer de platen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vul op dag drie het kweekmedium aan met 50 eenheden per milliliter IL2 en 10 nanogram per milliliter IL7. Vervang op dag zeven de helft van het kweekmedium door vers medium met: vier microgram per milliliter peptiden, 100 eenheden per milliliter IL2 en 20 nanogram per milliliter IL7.Pipetteer op dag 10 voorzichtig de cellen in elke Put zeven tot negen keer om celclusters te de-aggregeren. Tel het aantal levensvatbare cellen en breng 2x10 over naar de vijfde cellen in elke put van een 96-Well ronde bodemplaat voor HPV-specifieke CD4 T-celresponsanalyse. Stel voor de restcellen in de 96-Well vlakke bodemplaat het volume van het kweekmedium in op 100 microliter door overmatig medium weg te gooien.Vul vervolgens de cultuur aan met 100 microliter vers, compleet kweekmedium, met daarin: vier microgram per milliliter peptiden, 100 eenheden per milliliter IL2, en 20 nanogram per milliliter IL7. Ga door met het kweken van de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor epitoopidentificatie op dag 12. Was de cellen in de 96-Well ronde bodemplaat door 200 microliter RPMI 1640 toe te voegen, de plaat gedurende drie minuten op 550 maal G te centrifugeren en het supernatant weg te gooien.Herhaal de was twee keer met behulp van een volledig kweekmedium voor de laatste wasbeurt. Voeg voor elke bron van cellen gestimuleerd met een specifieke peptidepool 200 microliter volledig kweekmedium toe, aangevuld met dezelfde peptidepool. Voeg voor de Background Control Well een compleet kweekmedium toe, aangevuld met één microliter per milliliter DMSO.Voeg voor de Positive Control Well een compleet kweekmedium toe aangevuld met één microliter per milliliter DMSO, 150 nanogram per milliliter PMA en één micromol per liter ionomycine. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide gedurende zes uur. Voeg na een uur incubatie 1,37 microgram per milliliter monensin toe aan de cultuur.Nadat de zes uur durende incubatie is voltooid, centrifugeert u de plaat gedurende drie minuten op 550 maal G. Verwijder het supernatant en was de cellen eenmaal met 200 microliter DPP's, zoals eerder aangetoond. Vlek voor oppervlaktemarkers CD3, CD4 en CD8, en een levensvatbaarheidsmarker.Na het opschorten van de cellen met vibrator, koel de plaat vervolgens gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Na het eenmaal wassen van de plaat met 200 microliter DPBS, fixeer en permeabiliseer de cellen, kleur voor intracellulaire cytokines, TNF Alpha en Interferon-gamma, en koel de plaat bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten. Was de cellen opnieuw en suspensie ze opnieuw in 150 microliter flowcytometriebuffer.Verkrijg vervolgens de flowcytometriegegevens met behulp van een flowcytometer. Onderhoud allergene B-lymfoblastoïde cellijnen, of BLCLs, in een T-75 kolf. Tel op dag 12 van de PBMC-uitbreiding het aantal levensvatbare BLCLs en breng ze over naar 15 milliliter centrifugebuizen.Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 350 maal G en verwijder het supernatant. Suspensie van de celkorrel en het volledige kweekmedium opnieuw. Vervolgens aliquoteert u de BLCLs naar een 96-Well ronde bodemplaat met 4x10 tot de vierde cellen per put, en 80 microliter volledig kweekmedium.Voeg 10 microgram per milliliter van een enkel peptide toe en stel twee achtergrondcontroles in. Peptide pulseren met HLADR-blokkering en DMSO-pulseren. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, gedurende twee uur.Voeg 100 microgram per milliliter Mitomycine C toe en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende een uur. Was de plaat drie keer met 200 microliter RPMI 1640 om ongepulseerd peptide en Mitomycine C te verwijderen en suspensuspensie de cellen vervolgens opnieuw in 120 microliter volledig kweekmedium, met behulp van vibrator. Breng op dag 12 van de PBMC-uitbreiding de PBMC's over naar een 96-Well ronde bodemplaat.Centrifugeer de cellen in de plaat, verwijder het supernatant en was ze twee keer met 200 microliter RPMI 1640, zoals eerder aangetoond. Suspensie de PBMC's in elke put opnieuw met 210 microliter volledig kweekmedium. Voor de PBMC Wells gekozen voor epitoop identificatie, aliquot 70 microliter van de cel suspensie en mix met peptide gepulseerde BLCLs in drie Wells, inclusief twee achtergrond controles.Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende zes uur. Voeg na een uur incubatie 1,37 microgram per milliliter monensin toe aan de cultuur en breng het uiteindelijke volume in elke put tot 200 microliter met volledig kweekmedium. In dit representatieve voorbeeld zijn de TNF Alpha- en Interferon-gamma-afscheidende CD4 T-celresponsen voor peptidepool Core11 lager dan twee keer de achtergrondwaarden, daarom als negatief beschouwd.Ondertussen zijn de reacties voor peptidepool Core09 hoger dan twee keer de achtergrond en worden ze als positief beschouwd. De grijze achtergrond geeft Wells aan met een positieve CD4 T-celrespons en kandidaat-peptiden voor epitoopidentificatie zijn aangegeven in rood, Core01 heeft het hoogste responspercentage, te oordelen naar zowel TNF Alpha als Interferon-gamma afscheidende CD4T-cellen in kolompeptidepools. Peptiden C1 tot 15, C31 tot 45, C61 tot 75 en C91 tot 105 in deze peptidepool worden ingesteld als kandidaat-peptiden, omdat de rij peptidepools die deze peptiden bevatten ook positieve resultaten vertoont.PBMC's uitgebreid met peptidepools Core07, 08, 09 en 10, worden gebruikt voor epitoopidentificatie van deze peptiden. Evenzo heeft Core09 het hoogste responspercentage in rijpeptidepools. Alle peptiden in deze pool zijn ingesteld als kandidaat-peptiden en PBMC's uitgebreid met peptidepools: Core01, 02, 03, 04, 05 en 06 worden gebruikt voor epitoopidentificatie van deze peptiden.Voor peptidepool Core08 uitgebreide PBMC's, na stimulatie met peptide C31 tot 45 gepulste BLCLs, zijn de frequenties van TNF Alpha en Interferon-gamma afscheidende CD4 T-cellen twee keer hoger dan achtergrondcontroles. Peptide C31 tot 45 is dus een geverifieerd HLADR-beperkt CD4 T-cel epitoop. Het was daar, extra uitgebreide PBMC's die overbleven na epitoopidentificatie.Fijne markering van de geïdentificeerde epitopen kan worden uitgevoerd met behulp van een paneel van verkorte peptiden.

analysis-hbv-specific-cd4-t-cell-responses-identification-hla-dr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan ​​dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.

Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Het karakteriseren van T-cel-epitopen van pathogenen die lokale infecties veroorzaken, zoals het humaan papillomavirus, is een uitdaging vanwege het beperkte aantal circulerende T-cellen. Er wordt een methode beschreven waarbij zeldzame T-cellen werden geïsoleerd en gekarakteriseerd, beginnend met een zeer klein aantal cellen.

Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats...

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

The video demonstrates an assay using human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8+ T cells to inhibit hepatitis B virus (HBV) replication in mice. These T cells, engineered with HBV-specific receptors, are transferred into transgenic mice. Replication-competent HBV genome plasmids are then injected directly into the liver, enabling viral DNA uptake. Once viral antigens are expressed and presented by hybrid MHC-I molecules, the engineered T cells recognize and bind to these complexes.

Suppressing Hepatitis B Virus Replication Using Viral Antigen-Specific T Cells

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Intact klasse I HLA / peptide complexen worden vergoten door kankercellen, wat neerkomt op een potentieel relevante kanker biomarker. Met behulp labelvrije sensortechnologie en T-cel receptor nabootsen monoklonale antilichamen, detectie van stal MIF / HLA-A * 02: 01 complexen in MDA-MB-231 cel supernatanten, spiked humaan serum en plasma van een patiënt wordt aangetoond, waardoor de ontwikkeling van een nieuwe kankertherapie diagnostisch platform.

Detectie van Humaan leukocytenantigeen Biomarkers bij Borstkanker Gebruikmakend-Label gratis biosensortechnologie

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het opsommen en karakteriseren rhesus macaque CD8 + T cellen tegen het AIDS-virus. Dit artikel is niet alleen nuttig voor het gebied van immunologie HIV, maar ook op andere gebieden van biomedisch onderzoek waarbij CD8 + T cel responsen is bekend dat de ziekte uitkomst beïnvloeden.

Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 + T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Incongruenties in menselijke leukocyten antigeen (HLA) sequenties tussen organ donor en ontvanger paren zijn de belangrijkste oorzaak van antilichaam-gemedieerde afwijzing in orgaantransplantatie. Hier presenteren we het gebruik van aangepaste antigeen arrays die zijn gebaseerd op individuele donoren HLA sequenties sonde anti-donor HLA alloantibodies orgel geadresseerden.

Gepersonaliseerd Peptide Arrays voor detectie van HLA Alloantibodies in orgaantransplantatie

Dit protocol beschrijft het gebruik van één keten MHC klasse I complexen te onderzoeken van de moleculaire interacties in menselijke CD8 + T cel activatie: generatie van gemanipuleerde antigeen presentatie van cellen uiten van één keten bouwt, cultuur van menselijke CD8 + T cel kloon en T-cel activatie experimenten.

Gebruik van één keten MHC technologie te onderzoeken van Co-agonisme in menselijke CD8 + T cel activatie

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van MHC klasse I en klasse II peptidecomplexen uit muis- en menselijke cellijnen die hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens leveren. Het protocol richt zich op monstervoorbereiding met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen.

Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

Leer een methode voor het evalueren van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en het identificeren van epitopen bij chronische hepatitis B-infectie. Deze aanpak combineert peptidestimulatie met flowcytometrie.

Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix (Video) | JoVE Journal

Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix

Meer video's verkennen