Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix

Bij een chronische HBV-infectie spelen CD4 T-cellen een belangrijke rol bij zowel de virale klaring als de terugkeerders. Deze methode stelt ons in staat om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en tegelijkertijd HBV-specifieke CD4 T-celepithopen te identificeren. De procedure wordt gedemonstreerd door Jianmei Xiao, een onderzoeksassistent.

En Xing Wan, een technicus uit Bilao. Isoleer om te beginnen perifere mononucleaire bloedcellen, of PBMC's, uit bloed, met behulp van Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie op 800 keer G gedurende 20 minuten. Verzamel vervolgens de granulocyten tussen de en rode bloedcellaag, met behulp van een pasteurpipet.

Breng de ontdooide celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 milliliter, voeg een milliliter van de voorverwarmde Benzonase RPMI 1640 toe, druppelgewijs en voeg dan langzaam nog eens zes milliliter toe. Spoel de cryoflacon met twee milliliter Benzonase RPMI 1640 om de resterende cellen op te halen. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende 10 minuten op 400 keer G.

Verwijder het supernatant en maak de pellet los door op de buis te tikken. Suspensie de pellet voorzichtig opnieuw in één milliliter warme Bensenase NACE RPMI 1640. Meng de cellen voorzichtig en filter ze door een celzeef van 70 micrometer, als er celklonten zichtbaar zijn.

Tel levensvatbare cellen met behulp van trypan blue en een hemocytometer. Suspensie van de PBMC's en het volledige kweekmedium, met 10 eenheden per milliliter IL2 en 10 nanogram per milliliter IL7. Pas de celdichtheid aan op 1,5x10 voor de 6 cellen per milliliter.

Plaats vervolgens de cellen in 96-Well vlakke bodemplaten met een dichtheid van 3x10 tot de vijfde cellen per put. Voeg hepatitis B-virus of HBV afgeleide peptidepools toe aan elke put. Voeg voor de achtergrond en positieve controleputten dezelfde hoeveelheid oplosmiddel toe.

Incubeer de platen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vul op dag drie het kweekmedium aan met 50 eenheden per milliliter IL2 en 10 nanogram per milliliter IL7. Vervang op dag zeven de helft van het kweekmedium door vers medium met: vier microgram per milliliter peptiden, 100 eenheden per milliliter IL2 en 20 nanogram per milliliter IL7.

Pipetteer op dag 10 voorzichtig de cellen in elke Put zeven tot negen keer om celclusters te de-aggregeren. Tel het aantal levensvatbare cellen en breng 2x10 over naar de vijfde cellen in elke put van een 96-Well ronde bodemplaat voor HPV-specifieke CD4 T-celresponsanalyse. Stel voor de restcellen in de 96-Well vlakke bodemplaat het volume van het kweekmedium in op 100 microliter door overmatig medium weg te gooien.

Vul vervolgens de cultuur aan met 100 microliter vers, compleet kweekmedium, met daarin: vier microgram per milliliter peptiden, 100 eenheden per milliliter IL2, en 20 nanogram per milliliter IL7. Ga door met het kweken van de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor epitoopidentificatie op dag 12. Was de cellen in de 96-Well ronde bodemplaat door 200 microliter RPMI 1640 toe te voegen, de plaat gedurende drie minuten op 550 maal G te centrifugeren en het supernatant weg te gooien.

Herhaal de was twee keer met behulp van een volledig kweekmedium voor de laatste wasbeurt. Voeg voor elke bron van cellen gestimuleerd met een specifieke peptidepool 200 microliter volledig kweekmedium toe, aangevuld met dezelfde peptidepool. Voeg voor de Background Control Well een compleet kweekmedium toe, aangevuld met één microliter per milliliter DMSO.

Voeg voor de Positive Control Well een compleet kweekmedium toe aangevuld met één microliter per milliliter DMSO, 150 nanogram per milliliter PMA en één micromol per liter ionomycine. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide gedurende zes uur. Voeg na een uur incubatie 1,37 microgram per milliliter monensin toe aan de cultuur.

Nadat de zes uur durende incubatie is voltooid, centrifugeert u de plaat gedurende drie minuten op 550 maal G. Verwijder het supernatant en was de cellen eenmaal met 200 microliter DPP's, zoals eerder aangetoond. Vlek voor oppervlaktemarkers CD3, CD4 en CD8, en een levensvatbaarheidsmarker.

Na het opschorten van de cellen met vibrator, koel de plaat vervolgens gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Na het eenmaal wassen van de plaat met 200 microliter DPBS, fixeer en permeabiliseer de cellen, kleur voor intracellulaire cytokines, TNF Alpha en Interferon-gamma, en koel de plaat bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten. Was de cellen opnieuw en suspensie ze opnieuw in 150 microliter flowcytometriebuffer.

Verkrijg vervolgens de flowcytometriegegevens met behulp van een flowcytometer. Onderhoud allergene B-lymfoblastoïde cellijnen, of BLCLs, in een T-75 kolf. Tel op dag 12 van de PBMC-uitbreiding het aantal levensvatbare BLCLs en breng ze over naar 15 milliliter centrifugebuizen.

Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 350 maal G en verwijder het supernatant. Suspensie van de celkorrel en het volledige kweekmedium opnieuw. Vervolgens aliquoteert u de BLCLs naar een 96-Well ronde bodemplaat met 4x10 tot de vierde cellen per put, en 80 microliter volledig kweekmedium.

Voeg 10 microgram per milliliter van een enkel peptide toe en stel twee achtergrondcontroles in. Peptide pulseren met HLADR-blokkering en DMSO-pulseren. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, gedurende twee uur.

Voeg 100 microgram per milliliter Mitomycine C toe en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende een uur. Was de plaat drie keer met 200 microliter RPMI 1640 om ongepulseerd peptide en Mitomycine C te verwijderen en suspensuspensie de cellen vervolgens opnieuw in 120 microliter volledig kweekmedium, met behulp van vibrator. Breng op dag 12 van de PBMC-uitbreiding de PBMC's over naar een 96-Well ronde bodemplaat.

Centrifugeer de cellen in de plaat, verwijder het supernatant en was ze twee keer met 200 microliter RPMI 1640, zoals eerder aangetoond. Suspensie de PBMC's in elke put opnieuw met 210 microliter volledig kweekmedium. Voor de PBMC Wells gekozen voor epitoop identificatie, aliquot 70 microliter van de cel suspensie en mix met peptide gepulseerde BLCLs in drie Wells, inclusief twee achtergrond controles.

Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende zes uur. Voeg na een uur incubatie 1,37 microgram per milliliter monensin toe aan de cultuur en breng het uiteindelijke volume in elke put tot 200 microliter met volledig kweekmedium. In dit representatieve voorbeeld zijn de TNF Alpha- en Interferon-gamma-afscheidende CD4 T-celresponsen voor peptidepool Core11 lager dan twee keer de achtergrondwaarden, daarom als negatief beschouwd.

Ondertussen zijn de reacties voor peptidepool Core09 hoger dan twee keer de achtergrond en worden ze als positief beschouwd. De grijze achtergrond geeft Wells aan met een positieve CD4 T-celrespons en kandidaat-peptiden voor epitoopidentificatie zijn aangegeven in rood, Core01 heeft het hoogste responspercentage, te oordelen naar zowel TNF Alpha als Interferon-gamma afscheidende CD4T-cellen in kolompeptidepools. Peptiden C1 tot 15, C31 tot 45, C61 tot 75 en C91 tot 105 in deze peptidepool worden ingesteld als kandidaat-peptiden, omdat de rij peptidepools die deze peptiden bevatten ook positieve resultaten vertoont.

PBMC's uitgebreid met peptidepools Core07, 08, 09 en 10, worden gebruikt voor epitoopidentificatie van deze peptiden. Evenzo heeft Core09 het hoogste responspercentage in rijpeptidepools. Alle peptiden in deze pool zijn ingesteld als kandidaat-peptiden en PBMC's uitgebreid met peptidepools: Core01, 02, 03, 04, 05 en 06 worden gebruikt voor epitoopidentificatie van deze peptiden.

Voor peptidepool Core08 uitgebreide PBMC's, na stimulatie met peptide C31 tot 45 gepulste BLCLs, zijn de frequenties van TNF Alpha en Interferon-gamma afscheidende CD4 T-cellen twee keer hoger dan achtergrondcontroles. Peptide C31 tot 45 is dus een geverifieerd HLADR-beperkt CD4 T-cel epitoop. Het was daar, extra uitgebreide PBMC's die overbleven na epitoopidentificatie.

Fijne markering van de geïdentificeerde epitopen kan worden uitgevoerd met behulp van een paneel van verkorte peptiden.