Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

Ultrasnelle krachtklemspectroscopie is een techniek met één molecuul op basis van een laserpincet die het mogelijk maakt om de chemomechanica van myosinenmotoren onder belasting met de hoogste tijdresolutie te onderzoeken. Deze techniek maakt het mogelijk om zeer snelle gebeurtenissen in de krachtproductie te onderzoeken door de kracht constant te houden tijdens elke fase van de motorische interactie met volledige controle over de richting van de kracht. Door de juiste aanpassingen aan te brengen, kan dit protocol gemakkelijk worden toegepast op andere soorten processieve motoren, waaronder kinesines en dyneinen, om de regulatie met geweld bloot te leggen.

Nadat u een set acousto-optische deflectoren op een lineaire vertaler hebt gemonteerd, neemt u een iris en past u het diafragma aan de grootte van het diafragma terug van het objectief aan. Vervang het objectief door de iris gecentreerd op de behuizing van het schroefdraadobject. Verplaats de vertaler naar de laserstraal totdat het deel van de straal dat door het piëzokristal wordt geblokkeerd zichtbaar is na de iris, en draai de vertaler iets naar achteren totdat de straal de irisopening volledig vult.

Om silicaparels in pentylacetaat te bereiden, verdunt u eerst 20 microliter 1,2 micron 10% vaste silicakorrels in 1-1,5 milliliter aceton met vortexing en 30 seconden ultrasoonapparaat. Na het ultrasoonapparaat verzamel je de kralen door centrifugeren en resuspenseer je de kraalkorrel in 1 milliliter verse aceton voor een tweede wasbeurt. Was na de tweede acetonwassing de kralen drie keer in 1 milliliter vers pentylacetaat per wasbeurt onder dezelfde centrifugatieomstandigheden en resuspenseer de pellet in 100 microliter van 1% nitrocellulose en 900 microliter pentylacetaat.

Gebruik vervolgens een zuiver met ethanol doordrenkt stuk laboratoriumweefsel om voorzichtig een glazen afdeksel van 24 x 24 millimeter af te vegen voordat u een schoon pincet gebruikt om het glas direct in de ethanol te spoelen en de coverslip te laten drogen onder een zachte stikstofstroom. Vortex en soniceer de voorbereide silicaparelvoorraad gedurende 30 seconden en gebruik een ethanol-gereinigde 24 x 60 millimeter coverslip om 2 microliter silicakraaloplossing op het oppervlak van de kleinere coverslip te smeren. Terwijl de kralen drogen, reinigt u een dia van 26 x 76 millimeter zoals gedemonstreerd en plaatst u twee 60-100 micron dikke lijnen van 3 millimeter dubbelzijdig geplakt op de lange randen van de dia.

Plaats met een schoon pincet de met kralen gecoate afdeksel op de tape met de kralen naar de binnenkant van de schuifkamer en vul de kamer met 15 millimolar fosfaatbuffer en zwevende polystyreenkraaloplossing. Sluit vervolgens de kamer af met siliciumvet. Om de pixel-nanometerverhouding van de brightfield-camera te kalibreren, verwerft u een eerste afbeelding van een silicakraal op het coverslipoppervlak op ongeveer 5 micron van het midden van het gezichtsveld.

Verplaats het werkgebied om de kraal 10 micron naar het midden van het gezichtsveld te verplaatsen en maak een tweede afbeelding. Bereken de kalibratieconstante van de camera door de pixelafstand tussen twee posities van de kraal te meten. Om de valpositie te kalibreren, vangt u een enkel zwevend deeltje in één val en verplaatst u de acousto-optische deflectoren in stappen van 0,2 megahertz, waardoor een beeld van het deeltje en de bijbehorende frequentie van de deflectoren voor elke stap wordt verkregen.

Herhaal vervolgens de kalibratie voor de tweede val op dezelfde manier. Om het valvermogen en de stijfheid te kalibreren, vangt u een enkel deeltje in elke val en verdringt u beide vallen met behulp van de acousto-optische deflectoren in stappen van 0,2 megahertz, waarbij een Brownse beweging van het deeltje in beide vallen wordt geregistreerd met Quadrant Photodiode Detectors en de overeenkomstige frequentie van de acousto-optische deflectoren. Verkrijg kalibratieconstanten door een Lorentziaanse functie aan te passen aan een vermogensspectrum van de geregistreerde Brownse beweging.

Om een monster voor meting samen te stellen, voegt u 1 milligram per milliliter gebiotinyleerd BSA toe aan een nieuwe kamer met silicaparels op het oppervlak van de coverslip. Was na 5 minuten de kamer met AB-buffer en voeg 1 milligram per milliliter streptavidin toe aan de kamer. Was na 5 minuten de kamer zoals gedemonstreerd en voeg 3 nanomolaire gebiotinyleerde Myosine-5B zware meromyosine toe in M5B buffer aangevuld met 2 micromolaire Calmodulin.

Was de kamer na 5 minuten drie keer met 1 milligram per milliliter gebiotinyleerd BSA aangevuld met 2 micromolaire Calmodulin in AB-buffer en wacht 3 minuten na de laatste wasbeurt. Laat het reactiemengsel stromen en sluit de kamer af met siliciumvet. Om het monster te meten, plaatst u de kamer op het microscoopstadium en verplaatst u het objectief totdat de zwevende alfa-actininekorrels in focus zijn.

Schakel één val in en vang één kraal. Zodra de eerste val bezet is, verplaatst u de vertaler om de gevangen kraal dicht bij het oppervlak van de coverslip te plaatsen om te voorkomen dat meerdere kralen worden gevangen en een kraal in de tweede val vangen. Verplaats het monster door de langeafstandsvertalers om actinefilamenten van ten minste 5 micron lang in de oplossing te lokaliseren.

Wanneer een gloeidraad is gespot, verplaatst u het monster om een gevangen kraal het ene uiteinde van het filament te laten naderen. Zodra het filament is bevestigd, past u de afstand van de kraal aan de geschatte filamentlengte aan en verplaatst u het podium om een stroom in de ongebonden kraalrichting te creëren. Het filament wordt uitgerekt door de stroom en bindt uiteindelijk aan de tweede kraal.

Het resulterende complex wordt een halter genoemd"Om actine-myosinecontact tot stand te brengen, scheidt u de twee vallen voorzichtig en stelt u het filament in op pretentieniveaus tot ongeveer 3 piconewton. Om de stijfheid van de halter te onderzoeken, laat u één val oscilleren in een driehoeksgolf door de frequentie van één acousto-optische deflector te veranderen en de daaruit voortvloeiende overdracht van de beweging naar de achtergebleven kraal via zijn positiesignaal te verifiëren. Verplaats het podium om de halter in de nabijheid van een silicakraal op voetstuk te plaatsen en pas de hoogte van de dumbbell aan zodat het actinefilament in contact komt met het silicakraaloppervlak.

Zoals waargenomen in dit representatieve positierecord, wanneer de myosinemotor geen interactie heeft met het actinefilament, bewegen de gevangen kralen met een constante snelheid tegen de viskeuze weerstandskracht van de oplossing. Zodra de myosinemotor begint te interageren met het filament, wordt de kracht die door het bewegende filament wordt gedragen zeer snel overgebracht naar het eiwit en daalt de systeemsnelheid tot nul, waarbij de stapgebeurtenissen onder constante kracht plaatsvinden tot het einde van de run. De kracht wordt overgeschakeld van de positieve naar de negatieve richting door het feedbacksysteem, dat de krachtrichting verandert wanneer de kraal de rand van het oscillatiebereik bereikt dat door de gebruiker is ingesteld.

Wanneer de myosine bindt en het filament in de positieve richting verplaatst, duwt het de kraal naar de bovenrand van het oscillatiebereik. Als dit onder ondersteunende kracht gebeurt, wordt de run van de myosine onderbroken door de krachtrichtinginversie aan de oscillatierand, waardoor de lengte van de run wordt beperkt tot de amplitude van de halteroscillatie. Nauwkeurige uitlijning van het optische systeem is noodzakelijk om de optimale ruimtelijke en temporele resolutie te bereiken, terwijl een nauwkeurige kalibratie noodzakelijk is om de waarden van de uitgeoefende krachten nauwkeurig te bepalen.

Deze techniek is aangepast om het glijden en gericht zoeken naar transcriptiefactoren in DNA te bestuderen, evenals dynamische interacties tussen mechanotransductie-eiwitten die over microtubule-filamenten worden getransporteerd.