Geautomatiseerd dissectieprotocol voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte
29 maart 2021
Digitale annotatie met geautomatiseerde weefseldissectie biedt een innovatieve benadering voor het verrijken van tumoren in gevallen met een laag tumorgehalte en kan worden aangepast aan zowel paraffine- als bevroren weefseltypen. De beschreven workflow verbetert de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en doorvoer en kan worden toegepast op zowel onderzoeks- als klinische omgevingen.
Isolatie of verrijking van kleine verspreide gebieden van belang van FFPE, of vers bevroren materiaal, kan sneller en efficiënter worden bereikt met geautomatiseerde dissectie dan met traditionele methoden. Extractie van genomisch materiaal uit FFPE, of vers ingevroren weefsel, is een vereiste voor veel klinische en translationele onderzoekslaboratoria. Geautomatiseerde dissectie vult een aanzienlijke kloof tussen macrodissectie en laser capture microdissectie.
Annoteer om te beginnen de gescande diaafbeeldingen voor de tumorgebieden van belang, met behulp van een door de leverancier geleverd weergaveplatform of een open source-viewer. Plaats de niet-gekleurde monsterweefselschuif op het werkgebied in de eerste tot en met de vierde diapositie wanneer u een digitale diareferentie gebruikt. Maak een freestaak met behulp van de geautomatiseerde weefseldissectiesoftware door de takenlijst te openen, selecteer vervolgens Nieuwe taak maken en voer de hoofdletter-ID en -naam in om de naam van de taak in te voeren.
Ga naar Dikte en selecteer sectiedikte met behulp van het pijltje omhoog of omlaag. Ga vervolgens naar Weefselvoorbereiding en selecteer Geparaffiniseerd of Gedeparaffineerd. Selecteer Referentieafbeelding"Van bestand en Afbeelding importeren.
Selecteer vervolgens het bestand dat u wilt importeren in de vervolgkeuzelijst als de digitale referentie. Scan de fase door de knop Scan stage" in de rechterbenedenhoek te selecteren om elke monsterweefseldia in de eerste tot en met de vierde positie vast te leggen. Voor de verwijzing in het werkgebied sleept u het vak om een rechthoekig gebied over het weefsel te maken en selecteert u de cirkelvormige bel onder het rechthoekige gebied om de werkgebiedverwijzingsafbeelding vast te leggen.
Kopieer dit rechthoekige veld naar de resterende voorbeeldweefseldia's in de tweede tot en met vierde diapositie door de optie kopiëren in de rechterbovenhoek van de referentieafbeelding te selecteren. Pas vervolgens uit en wijzig het formaat indien nodig. Voor de digitale referentieafbeelding legt u de afbeelding over het geselecteerde rechthoekige gebied.
Wijzig vervolgens het formaat en lijn de digitale referentie grof uit, natuurlijk zoomen, om het beste aan te sluiten bij de grootte en de positie over het monsterweefsel. Kopieer dit rechthoekige veld naar de resterende voorbeeldweefseldia's in de tweede tot en met vierde diapositie door de optie kopiëren in de rechterbovenhoek van de referentieafbeelding te selecteren. Pas vervolgens uit en wijzig het formaat indien nodig.
Selecteer de knop Fase scannen in de rechterbenedenhoek om naar de stap voor fijnaanpassing te gaan. Selecteer de positie van het eerste werkgebied en het pictogram van het gereedschap Transformeren in de rechterwerkbalk om de verwijzing nauwkeurig uit te lijnen en in te zoomen om het beste overeen te komen met de voorbeelddia-overlay. Gebruik de verwijzing om een voorbeeld van een schuifbalk onder aan het scherm te nemen en schakel tussen de referentie- en voorbeeldafbeeldingen.
En de in- en uitzoomfunctie om de uitlijning van elke diapositie aan te passen en te bereiken. Zodra de optimale voorbeeldoverlay is bereikt, tekent u de aanduidingen van het freespad op het gekleurde gedeelte van de gemaskeerde referentieafbeelding door het pictogram van het gereedschap Kleurkiezer in de rechterwerkbalk te selecteren. Teken de freespaden op de voorbeelddia's door de knop Annotaties ophalen in de rechterbenedenhoek van het scherm te selecteren.
Leg het geannoteerde interessegebied vast en verzamel het met vier of minder freespunten wanneer het freespad wordt berekend. Het gebruik van de freespunt in de linkerbovenhoek wordt berekend op basis van het bestreken gebied en de geselecteerde tipgrootte. De tipgrootte kan worden gewijzigd onder de freespijl en het tipgebruik wordt opnieuw berekend.
Wanneer het freespad in de eerste diapositie is geselecteerd, wordt het gekopieerd naar de resterende diaposities. Selecteer de knop Setup stage" in de rechterbenedenhoek van het scherm voor het snel laden van de freespunten van de verzamelbuizen in hun juiste aanduiding op het podium. Vul het reservoir met drie milliliter geschikte dissectiebuffer voor het weefseltype en voor downstream nucleïnezuurextractie.
Selecteer vervolgens de knop Ontleden in de rechterbenedenhoek van het scherm. Verwijder na de geautomatiseerde dissectie de verzamelbuizen en de ontleedde monsterglijders uit het podium. Plaats de opvangbuizen in het buizenrek en de dia's in het schuifrek.
De H &E-gekleurde formaline, vaste paraffine ingebed en vers bevroren muizenleversecties met gemetastaseerde colorectale kanker in xenografts werden gescand op een hele diabeeldcamera met 20x vergroting en gebruikt als referentiedia's. De H&E-gekleurde referentiedia's werden geannoteerd en digitaal gemaskeerd voor tumorgebieden voor dissectie en nucleïnezuurextractie. De nagesneden monsterdia's waren H &E-gekleurd om de dissectiegebieden in dia's van 10 micrometer en 20 micrometer te bevestigen.
Vastgelegde statistieken toonden het succes aan van de geautomatiseerde dissectie en nucleïnezuurextractie. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het bereiken van een relatief nauwkeurige overlay van annotatie op de niet-gekleurde dia's belangrijk is voor het isoleren van interessegebieden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor geautomatiseerde weefseldissectie om tumorregio's te verrijken uit weefsels met een laag tumorgehalte, wat hoogwaardige extractie van nucleïnezuren mogelijk maakt voor downstream-applicaties zoals whole exome sequencing. De methode maakt gebruik van digitale annotatie-overlays op ongekleurde coupes, waardoor de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en doorvoer verbeteren in vergelijking met traditionele macrodissectie en laser capture microdissectie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Moleculaire pathologie
- Weefseldissectietechnologie
- Genomische analyse
Achtergrond
- Weefsels met een laag tumorpercentage (<20% tumor) leveren vaak onvoldoende materiaal op voor betrouwbare downstream-assays.
- Traditionele macrodissectie is gebruikersafhankelijk en onnauwkeurig, terwijl laser-capture microdissectie tijdrovend en kostbaar is.
- Geautomatiseerde weefseldissectie biedt een oplossing door digitale annotatie te combineren met nauwkeurig, geautomatiseerd frezen.
- Nauwkeurige verrijking van tumorregio's is cruciaal voor klinische en onderzoeksgerichte sequencing-workflows.
Doel van de studie
- Om een protocol te demonstreren voor de geautomatiseerde verrijking van tumorregio's in FFPE- of vers ingevroren weefsels.
- Om de efficiëntie en reproduceerbaarheid van weefseldissectie voor nucleïnezuurextractie te verbeteren.
- Om de generatie van hoogwaardige data uit monsters met een laag tumorgehalte voor sequencing-applicaties mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Digitale annotatie van tumorregio's op gescande H&E-gekleurde referentiaarsneden met behulp van gespecialiseerde of open-source software.
- Overlay van digitale annotaties op ongekleurde weefselsneden voor nauwkeurige targeting.
- Geautomatiseerd frezen van geannoteerde regio's met een mes met een diameter van 250 µm2 op FFPE- of vers bevroren coupes tot 20 µm dik.
- Verzamelen van gedisseceerd weefsel voor extractie van nucleïnezuren en daaropvolgende whole exome sequencing.
Belangrijkste resultaten
- Geautomatiseerde dissectie isoleert efficiënt kleine, verspreide tumorregio's uit weefsels met een laag tumorgehalte.
- H&E-kleuring na dissectie bevestigt de nauwkeurige verwijdering van de geannoteerde regio's.
- Verzamelingsstatistieken tonen een succesvolle verrijking en extractie van nucleïnezuren aan.
- Het protocol verhoogt de doorvoersnelheid en vermindert het gebruik van objectglazen in vergelijking met handmatige methoden.
Conclusies
- Geautomatiseerde weefseldissectie verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid bij tumorverrijking uit monsters met een laag gehalte.
- De methode overbrugt het gat tussen macrodissectie en laser-capture microdissectie.
- Het is geschikt voor zowel klinische als onderzoeksapplicaties die hoogwaardige nucleïnezuren voor sequencing vereisen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Geautomatiseerde dissectie voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte pakt een kritiek knelpunt aan bij het genereren van kwalitatief hoogwaardige nucleïnezuren voor downstream genomische assays. Door gebruikersafhankelijke variabiliteit te verminderen en de doorvoersnelheid te verhogen, verbetert dit protocol het voorspellend vertrouwen en de reproduceerbaarheid op het snijvlak van discovery- en translationeel onderzoek. De integratie ervan ondersteunt risico-gecorrigeerde besluitvorming en portfolio-optimalisatie in R&D-pipelines die gericht zijn op oncologie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige isolatie van tumorregio's mogelijk, wat bijdraagt aan een robuuste validatie van targets in heterogene weefselmonsters.
- Vermindert biologische ambiguïteit door de zuiverheid van het inputmateriaal voor moleculaire analyses te verbeteren.
- Faciliteert betrouwbare hypothesetests door contaminatie vanuit niet-tumoreus weefsel te minimaliseren.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt verrijkte monsters voor die geschikt zijn voor gestandaardiseerde downstream-assays, zoals next generation sequencing.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay door de stappen voor weefselselectie en dissectie te automatiseren.
- Ondersteunt schaalbare workflows door de doorvoer te verhogen en het verbruik van objectglazen te verminderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stelt monstervoorbereiding af op de vereisten voor translationele biomarkerontdekking en -validatie.
- Waarborgt continuïteit van weefselwerving tot generatie van genomische data in preklinische modellen.
- Vermindert de risico's van translationele studies door het leveren van hoogwaardige, tumorverrijkte nucleïnezuren als input.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit geautomatiseerde dissectieprotocol vormt de schakel tussen de weefselwerving en de extractie van nucleïnezuren, waardoor een betrouwbare monstervoorbereiding mogelijk wordt voor sequencing en moleculaire profilering in zowel discovery- als translationele workflows.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesegestuurde studies door nauwkeurige isolatie van het interessegebied uit complexe weefsels mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve verrijking die geschikt is voor high-throughput sequencing-assays.
- Analytics: Biedt verzamelingsmetrieken en bevestiging na oogst om de monsterkwaliteit en het succes van de verrijking te valideren.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen preklinische en klinische monsterverwerking met gestandaardiseerde, schaalbare verrijkingsmethoden.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een platformonafhankelijke functionaliteit die aanpasbaar is aan verschillende weefseltypen en onderzoeksvragen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in moleculaire analyses.
- Operationele waarde: Standaardiseert weefselverrijking, waardoor de reproduceerbaarheid en doorvoer worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk door hoogwaardige input voor downstream-assays te garanderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door monstergerelateerde variabiliteit in genomische studies te verminderen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in digitale pathologie-annotatie en het bedienen van software voor geautomatiseerde dissectie.
- Toegang tot compatibele instrumentatie voor beeldvorming, annotatie en freeswerk is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van annotatie- en dissectieparameters tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar voor zowel FFPE- als vers ingevroren weefsels van dierlijke of menselijke oorsprong.
- Afhankelijk van nauwkeurige overlay en uitlijning van digitale annotaties voor optimale verrijking.
