Name: 15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer eiwitconformatiedynamiek analyseren met 15N CPMG relaxatiedispersie-NMR op de μs-ms tijdschaal. Dit protocol biedt kinetische en thermodynamische inzichten zonder gespecialiseerde samplevoorbereiding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door fondsen van NIGMS R35GM133488 en van de Roy J. Carver Charitable Trust aan V.V.

1. Bereiding van het NMR-monster
<ol><li>Druk een 2H,15N-labled monster van het eiwit van belang uit en zuiver het. OPMERKING: Hoewel een 15N-gelabeld eiwitmonster kan worden gebruikt voor de verwerving van het CPMG RD-experiment, verhoogt perdeuteratie (waar mogelijk) de kwaliteit van de verkregen gegevens aanzienlijk. Protocollen voor de productie van perdeuterated eiwitten zijn beschikbaar in de literatuur13.</li>
	<li>Buffer het gezuiverde eiwitmonster omwisselen tot een ontgaste NMR-buffer.</li>
	<li>Breng het NMR-monster over in de NMR-buis. OPMERKING: De concentratie van het NMR-monster moet zorgvuldig worden geoptimaliseerd om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren en het optreden van eiwit-eiwitinteracties te minimaliseren. Over het algemeen is het typische concentratiebereik voor CPMG-experimenten 0,1-1,0 mM.</li>
</ol>2. Eerste opzet van het NMR-experiment
<ol><li>Download en pak de aanvullende bestanden uit.</li>
	<li>Kopieer de bestanden bits.vv en trosy_15N_cpmg.vv (in de map met de naam pulseprogram) naar de map pulse program (<path>/exp/stan/nmr/lists/pp/user). OPMERKING: Zorg ervoor dat het pad naar bits.vv op de eerste regel van het bestand trosy_15N_cpmg.vv correct is.</li>
	<li>Open acquisitiesoftware en kopieer een eerder uitgevoerd 1H-15N HSQC-experiment naar een nieuw experiment met behulp van de opdracht edc.</li>
	<li>Laad met behulp van de opdracht pulproghet pulsprogramma trosy_15N_cpmg.vv in het nieuw gemaakte experiment.</li>
	<li>Stel het CPMG-experiment in met behulp van de instructies aan het einde van het pulsprogrammabestand (trosy_15N_cpmg.vv).</li>
</ol>3. Routinematige opzet van het NMR-experiment
<ol><li>Introduceer het monster in de magneet en voer alle basisstappen uit voor het verkrijgen van een NMR-experiment: vergrendel en shim het monster; de 1 H- en 15N-kanalen matchen en afstemmen. </li>
	<li>Stel p1 en p7 in op de duur van respectievelijk de 1H en 15N harde 90° pulsen. OPMERKING: Voor een optimaal resultaat is het belangrijk om de 15N 90° puls met grote zorg te kalibreren. Kalibratie wordt meestal uitgevoerd met behulp van een monster van 100 mM met 15N-gelabelde ureum in DMSO zoals beschreven in de spectrometerhandleiding. Bovendien is het mogelijk om de kalibratie rechtstreeks op het werkende NMR-monster te controleren door de eerste stap te nemen van een 1H-15N HSQC-spectrum waarin de 15N 90° puls van het eerste INEPT-blok wordt overgeschakeld op een 180° puls. Als de kalibratie correct is, moet een null worden verkregen.</li>
	<li>Stel in het acquisitievenster het midden en de spectrale breedte in voor de afmetingen 1H en 15N. OPMERKING: Centreer het 1H-spectrum op de frequentie van het watersignaal voor optimale wateronderdrukking.</li>
	<li>Stel de ontspanningsvertraging (d30) in op 0,7 T2, waarbij T2 de verwachte 15N transversale ontspanningstijd van uw eiwit is. OPMERKING: De waarde van d30 kan empirisch worden geoptimaliseerd om de beste resultaten te verkrijgen.</li>
	<li>Gebruik de opdracht vclist om een lijst met gehele getallen te maken die overeenkomen met de parameter n in figuur 1A en figuur 1B. Zorg ervoor dat elke vermelding in de lijst overeenkomt met een ander CPMG-veld (νcpmg) volgens νcpmg = 4 x n / d30. Zorg ervoor dat het eerste getal in de lijst 0 is (dit komt overeen met het referentie-experiment waarvoor het CPMG-blok wordt overgeslagen en d30 = 0 s) en gebruik geen getallen groter dan 1.000 x d30 / 4. Getallen die groter zijn dan deze drempel resulteren in νcpmg > 1 kHz en kunnen de sonde beschadigen.</li>
	<li>Stel l8 in op het aantal items in de vclist, l3 op het aantal reële punten voor de indirecte dimensie (meestal is een bereik van 64-200 ingesteld op l3) en 1 td gelijk aan l8 x l3 x 2. OPMERKING: Voer de stappen 3.7-3.11 uit om de wateronderdrukking te optimaliseren.</li>
	<li>Stel de ontvangerwinst (rg) in op 1; open het pulsprogrammabestand (edcpul), ga naar regel 91, verwijder de puntkomma voorafgaand aan goto 999en sla het bestand op.</li>
	<li>Met behulp van de opdracht gs passen de parameters spdb0 (of spdw0) aan om de intensiteit van het FID-signaal te minimaliseren.</li>
	<li>Introduceer de puntkomma op regel 91 van het pulsprogrammabestand opnieuw en sla het bestand op.</li>
	<li>Herhaal de stappen 3.7-3.9 om spdb11 (lijn 168 van het pulsprogrammabestand), spdb2 (lijn 179 van het pulsprogrammabestand) en pldb2 (regel 184 van het pulsprogrammabestand) te optimaliseren.</li>
	<li>Voer de opdracht rga uit om de versterking van de ontvanger te optimaliseren.</li>
	<li>Stel het aantal scans (ns) in op een veelvoud van 8.</li>
	<li>Voer de opdracht zg uit om het experiment te starten.</li>
</ol>4. Verwerking en analyse van de NMR-gegevens
<ol><li>Kopieer de map met de naam Proces (Aanvullende bestanden) naar de map met het ser-bestand.</li>
	<li>Gebruik de bestanden sep_fid.com en ft2D.com om de NMR-gegevens te verwerken. OPMERKING: Instructies voor het bewerken van de verwerkingsscripts worden gegeven in de sep_fid.com- en ft2D.com bestanden.</li>
	<li>Open de ucsf-bestanden in de map CPMG_Sparky_files in Sparky. OPMERKING: De ucsf-bestanden worden gemaakt door de verwerkingsscripts. Er is één ucsf-bestand voor elk item in de vclist. Het eerste ucsf-bestand (test_1.ucsf) bevat het referentie-experiment. De daaropvolgende ucsf-bestanden (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) worden besteld van de laagste tot de grootste waarde van νcpmg.</li>
	<li>Kies de NMR-kruispieken op het referentie-NMR-spectrum (test_1.ucsf).</li>
	<li>Selecteer alle gepickte kruispieken met de sparky-opdracht pa.</li>
	<li>Voer de Sparky-opdracht rhuit. Met deze opdracht wordt een dialoogvenster geopend. Selecteer de optiehoogten op dezelfde positie in elk spectrum. Klik op Setup en bekijk alle NMR spectra. Klik op Bijwerken en sla het uitvoerbestand op in de werkmap. Het uitvoerbestand bevat de matrix van de signaalintensiteiten over alle geopende NMR-spectra. OPMERKING: Nauwkeurigere protocollen die lineshape fitting gebruiken voor het herstellen van intensiteiten van interleaved pseudo-3D-experimenten zijn beschreven in de literatuur14. Vrij beschikbare software voor lineshape fitting is beschikbaar op https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) en binnen NMRPipe (nLinLS module) en SPARKY (it module).</li>
	<li>Zet voor elk CPMG-veld de signaalintensiteiten om in R2-snelheden met behulp van de formule <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq03.jpg"> , waarbij I0 en Id30 respectievelijk de intensiteit van de referentie (vc = 0) en ontspannen (vc > 0) NMR-spectra zijn. OPMERKING: In de aanvullende bestandenwordt een sjabloon van het spreadsheetbestand (R2_calc.xls) verstrekt om de signaalintensiteiten naar R2-tarieven te converteren en de RD-profielen te visualiseren.</li>
	<li>Lees het geluidsniveau in het referentiespectrum met behulp van de Sparky-opdracht st en verspreid de fout op de R2-snelheden. OPMERKING: In de aanvullende bestandenwordt een sjabloon van het spreadsheetbestand (R2_calc.xls) verstrekt die wordt gebruikt om de fout op de gemeten R2-tarieven door te geven.</li>
</ol>5. Rd-bochten monteren
<ol><li>Kopieer de map met de naam RD_fitting (Aanvullende bestanden) naar de werkmap.</li>
	<li>Voor elke toegewezen NMR-piek, schatting Rex door het berekenen van de <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq04.jpg"> . en zijn de R <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> 2 tarieven gemeten op de laagste en hoogste νcpmg in de vclist.
</li>
	<li>Inspecteer de RD-curven visueel met Rex groter dan twee keer de geschatte fout en gooi alle RD-curven weg die te luidruchtig zijn om nauwkeurig te worden gemodelleerd. OPMERKING: Ruis op Rex kan worden doorgegeven door de fouten op <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> en <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> .</li>
	<li>Bereid een invoerbestand voor het montagescript voor met behulp van alle RD-curven met Rex groter dan twee keer de geschatte fout. OPMERKING: Gedetailleerde instructies voor de voorbereiding van de invoerbestanden zijn opgenomen in de passcripts. Voorbeeldinvoerbestanden worden geleverd als aanvullende bestanden. Gewoonlijk worden RD-gegevens gemeten op twee verschillende statische velden en tegelijkertijd gemonteerd. In dit protocol zijn twee verschillende invoerbestanden vereist (Aanvullende bestanden).</li>
	<li>Pas de RD-gegevens aan met behulp van de scripts in Aanvullende bestanden. OPMERKING: Er zijn twee verschillende scripts beschikbaar om respectievelijk een op residu gebaseerde of globale pasvorm van de RD-curven uit te voeren. Beide scripts passen in de RD-curven met behulp van een uitwisselingsmodel met twee plaatsen en de Carver-Richards-vergelijking. Meer gedetailleerde instructies zijn te zien in de montagescripts. Aanvullende softwarepakketten zoals Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) en CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/ ) zijn beschikbaar om gegevensmontage uit te voeren met behulp van de Block-McConnell-vergelijkingen.</li>
	<li>Test de betrouwbaarheid van de gemonteerde parameters die de verlaagde χ2 schatten als functie van pb en kex. OPMERKING: De verlaagde χ2 wordt in het uitvoerbestand opgenomen. pb en kex kunnen worden beperkt tot specifieke waarden met behulp van onder- en bovengrenzen in de montageprocedures. In onze scripts zijn de onder- en bovengrenzen voor pb respectievelijk lb(2) en ub(2). De onder- en bovengrenzen voor kex zijn respectievelijk lb(3) en ub(3).</li>
	<li>Schat de fout op de gemonteerde parameters. Dit kan worden gedaan door de waarde van MC_fac in het script in te stellen op 1 en de fitting meerdere keren te herhalen (meestal >20 herhalingen). De fout op elke parameter wordt geschat als de standaardafwijking van de verdeling. OPMERKING: Als u MC_fac instelt op 1, wordt een synthetische gegevensset gegenereerd waarin een Gaussiaanse gedistribueerde fout (berekend op basis van de experimentele fout) wordt toegevoegd aan de experimentele gegevens.</li>
</ol>

<ol><li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li>
<li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
<li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer%2Fdimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li>
<li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960(2015).</li>
<li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+slow+%28micros-ms%29+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+%2815%29N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li>
<li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+thermophilic%2Fmesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li>
<li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relaxation-compensated+Carr%E2%88%92Purcell%E2%88%92Meiboom%E2%88%92Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li>
<li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li>
<li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li>
<li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li>
<li>Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li>
<li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li>
<li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li>
<li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Contrast%27+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd%2FCeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li>
<li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li>
<li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy%3A+application+to+a+723-residue+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li>
<li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+backbone+%2813%29CO+and+%2815%29N+relaxation+dispersion+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li>
<li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+%2813%29C-detected+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747(2019).</li>
</ol>

Alle auteurs hebben het manuscript gelezen en goedgekeurd. Wij verklaren geen belangenconflicten.

Dit manuscript beschrijft het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N RD-gegevens over eiwitten. Met name de cruciale stappen voor de voorbereiding van het NMR-monster, de meting van de NMR-gegevens en de analyse van de RD-profielen komen aan bod. Hieronder worden enkele belangrijke aspecten met betrekking tot de verwerving en analyse van RD-experimenten besproken. Voor een meer diepgaande beschrijving van het experiment en de gegevensanalyse wordt echter een z...

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) ontspanningsdispersie (RD) experimenten worden routinematig gebruikt om conformatieevenwicht te karakteriseren dat optreedt op de μs-ms tijdschaal door oplossing NMR spectroscopie1,2,3,4,5. In vergelijking met andere methoden voor onderzoek van conformatiedynamiek zijn CPMG-technieken relatief eenvoudig te implementeren op moderne NMR-spectrometers, vereisen ze geen gespecialiseerde monstervoorbereidingsstappen (d.w.z. kristallisatie, monstervriezen of uitlijning, en/of covalente vervoeging met een fluorescerende of paramagnetische tag) en bieden ze een uitgebreide karakterisering van conformationeel evenwicht dat structurele, kinetische en thermodynamische informatie over uitwisselingsprocessen retourneert. Om een CPMG-experiment over een conformatieevenwicht te laten rapporteren, moeten twee voorwaarden van toepassing zijn: i) de waargenomen NMR-spins moeten verschillende chemische verschuivingen hebben in de staten die conformationele uitwisseling ondergaan (microstaten) en (ii) de uitwisseling moet plaatsvinden op een tijdschaal variërend van ~50 μs tot ~10 ms. Onder deze omstandigheden is de waargenomen transversale ontspanningssnelheid ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) de som van de intrinsieke R2 (de R2 gemeten bij afwezigheid van μs-ms <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> dynamiek) en de uitwisselingsbijdrage aan de transversale ontspanning (Rex). De Rex bijdrage aan R2obs kan geleidelijk worden gedoofd door de afstand tussen de 180° pulsen die het CPMG-blok van de pulssequentie vormen, te verkleinen, en de resulterende RD-curven kunnen worden gemodelleerd met behulp van de Bloch-McConnell-theorie om het chemische verschuivingsverschil tussen microstaten, de fractionele populatie van elke microstaat en de wisselkoersen tussen microstaten te verkrijgen (Figuur 1)1,2,3.
Verschillende pulssequenties en analyseprotocollen zijn gerapporteerd in de literatuur voor 15N CPMG-experimenten. Hierin wordt het protocol beschreven dat in het laboratorium is geïmplementeerd. Met name zullen de cruciale stappen voor de voorbereiding van het NMR-monster, de opzet en verwerving van de NMR-experimenten en de verwerking en analyse van de NMR-gegevens worden ingevoerd (figuur 2). Om de overdracht van het protocol naar andere laboratoria te vergemakkelijken, worden het pulsprogramma, de verwerkings- en analysescripts en een voorbeeldgegevensset geleverd als aanvullende bestanden en kunnen ze worden gedownload op (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). De meegeleverde pulssequentie bevat een fasecyclus in vier stappen in het CPMG-blok voor onderdrukking van offset-afhankelijke artefacten6 en is gecodeerd voor het verkrijgen van verschillende interleaved experimenten. Deze interleaved experimenten hebben een identieke ontspanningsperiode maar verschillende aantallen heroriënterende pulsen om verschillende CPMG-velden te bereiken7. Het is ook belangrijk op te merken dat het beschreven pulsprogramma de 15N R2 van de TROSY-component van het NMR-signaalmeet 8. Over het geheel genomen is het protocol met succes toegepast voor de karakterisering van conformationele uitwisseling in middelgrote en grote eiwitten4,5,9,10. Voor kleinere systemen (<20 kDa) is het gebruik van een op Heteronucleaire Single Quantum Coherence (HSQC) gebaseerde pulssequentie11,12 aan te raden.

<table><tbody><tr><td>Cryoprobe</td><td>Bruker</td><td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td><td>Gevoeligheid verbeteren</td></tr><tr><td>Deuterium Oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>756822-1</td><td>>99,8% puur, gebruikt bij het bereiden van NMR-monsters en gedeutereerd culturen</td></tr><tr><td>Hand driven centrifuge</td><td>United Scientific supply</td><td>CENTFG1</td><td>Wordt gebruikt om eventuele luchtbellen of resterende vloeistof die op de wanden van de NMR-buis vastzit te verwijderen.</td></tr><tr><td>High Field NMR spectrometer</td><td>Bruker</td><td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td><td>Verwerving van de NMR-gegevens</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>Modellering van de NMR-gegevens</td></tr><tr><td>NMR pasteur Pipette</td><td>Corning Incorporation</td><td>7095D-NMR</td><td>Pyrex glas pasteur pipette om vloeibare monsters in NMR-buis over te brengen</td></tr><tr><td>NMR tube</td><td>Willmad Precision</td><td>535-PP-7</td><td>5mm dunne wand 7'' cilindrische glazen buis</td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td><td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td><td>NMR-gegevensverwerking</td></tr><tr><td>SPARKY</td><td>University of California, San Francisco</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td><td>Analyse van de NMR-gegevens</td></tr><tr><td>Topspin 3.2 (of nieuwer)</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td><td>Acquisitie Software</td></tr></tbody></table>

15 n cpmg ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Eiwitconforme dynamica speelt een fundamentele rol bij de regulatie van enzymatische katalyse, ligandbinding, allosterie en signalering, die belangrijke biologische processen zijn. Begrijpen hoe de balans tussen structuur en dynamiek de biologische functie regelt, is een nieuwe grens in de moderne structurele biologie en heeft verschillende technische en methodologische ontwikkelingen aangewakkerd. Onder deze, CPMG ontspanning dispersie oplossing NMR methoden bieden unieke, atomaire-resolutie informatie over de structuur, kinetiek, en thermodynamica van eiwit conformationele evenwicht optreden op de μs-ms tijdschaal. Hier presenteert de studie gedetailleerde protocollen voor het verkrijgen en analyseren van een 15N ontspanningsdispersie-experiment. Als voorbeeld wordt de pijplijn voor de analyse van de μs-ms dynamiek in het C-terminal domein van bacteriën Enzym I getoond.

Het hier beschreven protocol resulteert in de verwerving van RD-profielen voor elke piek in het 1H-15N TROSY-spectrum (figuur 3A). Op basis van de verworven RD-profielen is het mogelijk om de uitwisselingsbijdrage aan de 15N transversale ontspanning van elke backboneamidegroep te schatten (figuur 3A, 3B). Door de Rex op de 3D-structuur van het onderzochte eiwit te plotten, is het mogelijk om de structu...

Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N-ontspanningsdispersieprofielen door oplossing NMR-spectroscopie.

15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Dit protocol kan worden gebruikt voor detectie en karakterisering van eiwitconformatiedynamiek, die essentieel zijn voor het begrijpen van een grote verscheidenheid aan cellulaire processen. In vergelijking met andere methoden vereist deze methode geen gespecialiseerde monstervoorbereidingsstappen en biedt het een uitgebreide karakterisering van de kinetiek, thermodynamica en structurele aspecten van bevestigingsevenwicht. CPMG ontspanningsdispersie kan breder worden toegepast voor de karakterisering van bevestigingsdynamiek in nucleïnezuren en andere biomoleculen, evenals voor de karakterisering van ligand nanodeeltjesinteracties.Ons protocol is gericht op nieuwe CPMG-gebruikers. Het is dus een goed uitgangspunt. We verwachten echter wel dat gebruikers de basisstappen kennen voor het uitvoeren van conventionele NMR-experimenten.Om voor het eerst een NMR-experiment in te stellen, downloadt en pakt u deze aanvullende bestanden eerst uit. Kopieer de Bits. vv en trosy_15N_CPMG.vv-bestanden in de map pulsprogramma naar de map met pulseprogramma's. Open de acquisitiesoftware en gebruik de opdracht EDC om een eerder uitgevoerd waterstofstikstof 15 HSQC-experiment te kopiëren naar een nieuw experiment. Gebruik de opdracht pulse program om de trosy_15N_CPMG te laden.vv pulse programma bestand in het nieuw gemaakte experiment. Gebruik vervolgens de instructies van het einde van het pulsprogrammabestand om het CPMG-experiment in te stellen. Om een routine-NMR-experiment op te zetten, introduceert u het monster in de magneet en voert u alle basisstappen voor NMR-acquisitie uit.Stel P1 in op de duur van de waterstofharde 90 graden pulsen en P7 op de duur stikstof 15 harde 90 graden pulsen. Stel in het acquisitievenster het midden en de spectrale breedte in voor de 15 dimensies waterstof en stikstof. Stel de ontspanningsvertraging in op 0,7 T2 en gebruik de opdracht VC-lijst om een lijst met gehele getallen te maken die overeenkomt met N.Nadat u hebt bevestigd dat elke vermelding in de lijst overeenkomt met een ander CPMG-veld volgens CPMG-bestand, is dit gelijk aan maal 4N gedeeld door D30, controleert u of het eerste getal in de lijst nul is.Stel L8 in op het aantal vermeldingen in de VC-lijst, L3 op het aantal echte punten voor de indirecte dimensie en 1TD op L8 keer L3 keer twee. Om de wateronderdrukking te optimaliseren, stelt u de ontvangerversterking in op één en typt u EDC pull om het pulsprogrammabestand te openen. Verwijder op regel 91 de puntkomma voorafgaand aan goto 999 en sla het bestand op.Pas met de opdracht GS de SPDB0-parameters aan om de intensiteit van het FID-signaal te minimaliseren. Wanneer de signaalintensiteit is gewijzigd, voert u een puntkomma in op lijn 91 van het pulsprogrammabestand en slaat u het bestand op. Om SPDB11 te optimaliseren, stelt u de ontvangerversterking in op één en het type EDC pull om het pulsprogrammabestand te openen.Verwijder op regel 168 de puntkomma voorafgaand aan goto 999 en sla het bestand op. Pas met de opdracht GS de SPDB11-parameters aan om de intensiteit van het FID-signaal te minimaliseren. Wanneer de signaalintensiteit is gewijzigd, voert u de puntkomma op lijn 168 opnieuw in en slaat u het bestand op.Om SPDB2 te optimaliseren, stelt u de ontvangerversterking in op één en voert u EDC pull in om het pulsprogrammabestand te openen. Verwijder op regel 179 de puntkomma voorafgaand aan goto 999 en sla het bestand op. Pas met de opdracht GS de SPDB2-parameters aan om de intensiteit van het FID-signaal te minimaliseren.Wanneer de signaalintensiteit is gewijzigd, voert u de puntkomma op lijn 179 van het pulsprogrammabestand opnieuw in en slaat u het bestand op. Om PLDB2 te optimaliseren, stelt u de ontvangerversterking in op één en voert u EDC pull in om het pulse-programmabestand te openen. Verwijder op regel 184 de puntkomma voorafgaand aan goto 999 en sla het bestand op.Pas met de opdracht GS de PLDB2-parameters aan om de intensiteit van het FID-signaal te minimaliseren. Wanneer de signaalintensiteit is gewijzigd, voert u de puntkomma op lijn 184 van het pulsprogrammabestand opnieuw in en slaat u het bestand op. Voer de opdracht RGA uit om de versterking van de ontvanger te optimaliseren.Voer vervolgens de opdracht ZG uit om het experiment te starten. In deze figuur kunnen de resultaten van de ontspanningsdispersieprofielen worden waargenomen die zijn verkregen voor elke piek in het waterstofstikstof 15 Trosy-spectrum. Uit de verworven ontspanningsdispersieprofielen is het mogelijk om de uitwisselingsbijdrage aan de stikstof 15 transversale ontspanning van elke backbone AMI-groep te schatten.Door de transversale ontspanning op de 3D-structuur van het onderzochte eiwit te plotten, is het mogelijk om de structurele regio's te identificeren die bevestigingsuitwisseling ondergaan op de microseconde milliseconde tijdschaal. Modellering van de ontspanningsdispersiecurven met behulp van de Carver-Richards-vergelijkingen retourneert de thermodynamische en kinetische parameters op het uitwisselingsproces, zoals de fractionele populaties van de staten in evenwicht en de wisselkoers tussen deze staten. De temperatuurafhankelijkheid van deze thermodynamische en kinetische parameters kan vervolgens worden gemodelleerd met behulp van respectievelijk de vergelijkingen van Van't Hoff en I-ring om gedetailleerde informatie te verkrijgen over de energetica van de bevestigingsuitwisseling.Het is cruciaal om alle acquisitieparameters, met name P7, zorgvuldig te optimaliseren. Het is ook belangrijk om zeer zuivere en homogene monsters te produceren om valse dispersies te voorkomen. De kinetische, thermodynamische en chemische chipparameters die met behulp van dit protocol worden verkregen, kunnen worden gebruikt om energetische en structurele informatie af te leiden over de soort die de bevestigingsuitwisseling ondergaat. Karakterisering van de eiwit confirmationele dynamiek verkregen door CPMG-methoden biedt cruciale informatie voor het begrijpen van signalering en enzymatische activiteit, evenals nieuwe perspectieven voor het ontwerpen van geneesmiddelen.

15n-cpmg-relaxation-dispersion-for-investigation-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele eiwitdynamica op een residuspecifieke manier karakteriseren. We bieden een hands-on protocol voor het opnemen van NMR 15N, R1 en R2 relaxatie en {1H}-15N heteronucleair Overhauser effect (hetNOE) experimenten, gevoelig voor de picoseconden tot nanoseconden tijdschaal.

NMR 15N relaxatie-experimenten voor het onderzoek van de picoseconde tot nanoseconde structurele dynamica van eiwitten

Dit op NMR gebaseerde protocol onderzoekt zwakke eiwit-glycaaninteracties met behulp van cyanovirine-N en D-mannose. Door ligand- en eiwitgedetecteerde methoden te combineren, brengt het bindingsplaatsen in kaart, detecteert het allosterische effecten en identificeert het ontmoetingscomplexen. De aanpak schetst monstervoorbereiding en gegevensanalyse en biedt structurele en dynamische inzichten die waardevol zijn voor glycaanspecifieke diagnostiek en herkenningsmechanismen.

Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het snel produceren van honderden nematode groei media agar, 96-Wells cultuur platen met een consistent aantal Caenorhhabditis elegans per putje. Deze culturen zijn nuttig voor de fenotypische screening van hele organismen. Hier richten we ons op met behulp van deze culturen op scherm chemicaliën voor Pro-levensduur effecten.

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Leer eiwitconformatiedynamiek analyseren met 15N CPMG relaxatiedispersie-NMR op de μs-ms tijdschaal. Dit protocol biedt kinetische en thermodynamische inzichten zonder gespecialiseerde samplevoorbereiding.

¹⁵ N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal

Meer video's verkennen