Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Deze methodologie biedt een verlies-van-functiebenadering voor studies van retinale ontwikkeling bij het kuiken. Deze techniek ondersteunt snelle en aanhoudende onderdrukking van doelwitgenen in een specifiek gebied van het netvlies. Deze aanpak kan ook worden toegepast op andere delen van het kuikenembryo, waaronder zowel de neurale als niet-neurale weefsels.

Bereid voor in ovo-elektroporatie een 0,25% Fast Green-oplossing door 25 milligram Fast Green FCF op te lossen in 10 milliliter PBS en filter de oplossing vervolgens met een spuitfilter van 0,2 micron. Bereid vervolgens de DNA-cocktailinjectieoplossing door het microRNA-smaragdgroene GFP-plasmide te mengen met het Tol2-transposase-expressieplasmide in een verhouding van twee op één. Voeg vervolgens de bereide Fast Green-oplossing toe aan de DNA-cocktail in een verhouding van één op 10 voor visualisatie van het geïnjecteerde gebied.

Stel vervolgens het micro-injectieapparaat in. Het apparaat bestaat uit een Hamilton-spuit, een 18 gauge twee inch naald, een twee centimeter lange polyvinylchloride slang en een micropipetnaald. Vul de Hamilton-spuit met zware minerale olie, bevestig vervolgens de naald van 18 gauge aan de spuit en vul de binnenruimte van de naald met olie door de zuiger van de spuit in te drukken.

Bevestig vervolgens de polyvinylchlorideslang aan het uiteinde van de naald en vul de slang met de olie. Bevestig de getrokken micropipetnaald aan de slang. Breek vervolgens onder de ontleedmicroscoop met een fijne tang de punt van de naald af tot een diameter van 10 tot 20 micrometer om een kleine opening te maken.

Vul de hele naald met olie. Leg vervolgens vijf microliter van de gekleurde DNA-cocktail op een petrischaaltje. Plaats onder de ontleedmicroscoop de punt van de micropipetnaald in de DNA-oplossing op de petrischaal en trek de oplossing langzaam in de naald.

Nadat de druk binnen en buiten de naald in evenwicht is gebracht, haalt u de punt van de naald uit de DNA-oplossing en houdt u deze ondergedompeld in steriele PBS in een klein bekerglas tot injectie. Om vervolgens het elektroporatieapparaat in te stellen, stelt u een paar platina-elektroden stevig in met een elektrodehouder op een micromanipulator. Pas de afstand tussen de punt van de elektroden aan op twee millimeter en sluit de elektroden met kabels aan op een blokgolfpulsgenerator.

Verwijder vervolgens voor de DNA-micro-injectie een bevrucht White Leghorn-ei uit de broedmachine en veeg het oppervlak van het ei af met tissuepapier gedrenkt in 70% ethanol. Bevestig vervolgens een naald van 18 gauge aan een spuit van 10 milliliter en steek de naald door het stompe uiteinde van het ei, schuin naar beneden om beschadiging van de dooier te voorkomen. Nadat u twee tot drie milliliter albumine uit het ei hebt gehaald, sluit u het gat af met een stuk plakband en kaars het ei met licht om ervoor te zorgen dat het embryo en het vitellinemembraan van de schaal worden losgemaakt.

Verwijder vervolgens met een tang een stuk eierschaal van de bovenkant van het ei, waardoor het embryo wordt blootgesteld. Venster niet meer dan vijf eieren tegelijk om uitdroging van embryo's tijdens elektroporatie te voorkomen. Steek de punt van de naald in het optische blaasje vanaf de proximale zijde in een hoek van 45 graden en injecteer de DNA-cocktail door de zuiger langzaam in te drukken totdat de blauw gekleurde oplossing het lumen vult.

Trek de naald terug en plaats de punt terug in PBS. Voor elektroporatie stelt u de pulsspanning in op 15 volt, de pulslengte op 15 milliseconden, het pulsinterval op 915 milliseconden en het pulsgetal op vijf. Na het toevoegen van een paar druppels HBSS op het vitellinemembraan over het embryo, gebruikt u de micromanipulator om de elektroden in de HBSS loodrecht op de voorste-achterste as van het embryo te laten zakken.

Plaats de elektroden aan weerszijden van het optische blaasje, zorg ervoor dat de elektroden het embryo of de bloedvaten niet raken en breng vervolgens gepulseerde elektrische velden aan. Nadat de elektroporatie is voltooid, verwijdert u de elektroden en reinigt u de elektroden voorzichtig met een met water gedrenkt steriel wattenstaafje om albumineophoping te voorkomen. Sluit het venster af met plakband en incuber het embryo opnieuw tot het gewenste ontwikkelingsstadium.

Transfectie van individuele pre-microRNA-sequenties in Nel AP-expressie HEK293T cellen resulteerde in significante onderdrukking van Nel-expressie door constructen tegen nucleotiden 482 tot 502, 910 tot 930 en 2461 tot 2481. Het koppelen van twee microRNA-sequenties verbeterde de knockdown-efficiëntie aanzienlijk. Alle drie de combinaties vertoonden verbeterde onderdrukkingsactiviteiten in vergelijking met niet-geketende individuele pre-microRNA-sequenties.

Robuuste onderdrukking werd waargenomen ten minste 13 dagen na transfectie. Wanneer een Nel pre-microRNA-construct gericht op nucleotiden 482 tot 502 en 2461 tot 2481 samen met de transposase-expressievector in het netvlies van het kuiken werd getransfecteerd, was de Nel-expressie in het retinale pigmentepitheel significant verminderd in smaragdgroene GFP-expressiecellen op embryonale dag 4,5. Bij acht dagen oude embryo's nam de Nel-expressie ook af in retinale ganglioncellen.

Daarentegen werd de Nel-expressie in het netvlies niet beïnvloed door de introductie van controlemicroRNA. Na deze procedure kunnen effecten op doelgenonderdrukking worden onderzocht met behulp van verschillende methoden, zoals onderzoek naar celproliferatie en -differentiatie, celdood en cel- en axontracering.