Name: Een gewijzigd chirurgisch model van ischemie van de achterpoten in ApoE-/- Muizen met behulp van een miniatuurincisie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Leer een minimaal invasieve chirurgische techniek om acute ischemie van de achterpoten te induceren bij ApoE-/- muizen. Deze methode gebruikt een kleine incisie en is toegankelijk voor de meeste onderzoeksgroepen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs bedanken Viktoria Skude, Alexander Schlund en Felix Hörner voor de uitstekende technische ondersteuning.

OPMERKING: Alle experimentele procedures zijn uitgevoerd volgens de EG-richtlijn EC 2010/63/EU en zijn goedgekeurd door de lokale Duitse wetgeving (35-9185.81/G[1]239/18). Tien mannelijke ApoE-/- muizen met de C57BL/6J achtergrond, met een gewicht van 29,6-38,0 g, werden gehuisvest op een 12 h licht/donker cyclus en kregen een westers dieet (1,25% cholesterol en 21% vet) en water ad libitum gedurende 12 weken vanaf de leeftijd van 8 weken. HLI werd uitgevoerd op 20 weken oude muizen zoals hieronder beschreven.
1. Inductie van HLI in ApoE-/- muizen
<ol><li>Bereid de benodigde apparatuur en gereedschappen voor chirurgie voor (zie de tabel met materialen en figuur 1). Steriliseer de chirurgische instrumenten via autoclaveren voor gebruik en gebruik een glazen kraalsterilisator tijdens de operatie.</li>
	<li>Anesthetiseer de muis met een subcutane injectie (S.C.) van een mengsel van midazolam (5 mg/kg), medetomidine (0,05 mg/ml/kg) en fentanyl (0,5 mg/kg) vóór alle chirurgische ingrepen.<ol>
<li>Gebruik na het begin van de anesthesie de dierenartszalf op de ogen om droogheid te voorkomen en bevestig de afwezigheid van de pedaalontwenningsreflex in de voorpoot en achterpoot.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de muis daarna op een verwarmingskussen om de kerntemperatuur van het lichaam op ongeveer 37 °C te houden. Gebruik wattenstaafjes en ontharingscrème om voorzichtig het haar van de huid van de achterpoten aan de rechterkant te verwijderen. OPMERKING: De ontharingscrème moet in voldoende hoeveelheid worden gebruikt om de achterlimb te bedekken, vooral het liesgebied waar de incisie zal worden gemaakt. De ontharingscrème moet worden gebruikt voor een duur van minder dan 3 minuten en moet vervolgens 2 tot 3 keer worden verwijderd met bevochtigde wattenstaafjes.</li>
	<li>Leg de muis in rugligging op het verwarmingskussen onder een ontleedmicroscoop. Gebruik een huidantisepticum (zie de tabel met materialen)om de huid van de muis te desinfecteren. Gebruik daarna een puntige tang en een chirurgische schaar om een incisie van ongeveer 3-4 mm te maken in het midden van het liesgebied. Zie figuur 2 voor een schema van de procedure.</li>
	<li>Verwijder het onderhuidse vetweefsel voorzichtig met behulp van een fijne puntige tang om de proximale femorale neurovasculaire bundel bloot te leggen. Gebruik voorzichtig de fijne puntige tang om het membraan van de dijbeenschede te doorboren. Gebruik een wattenstaafje bevochtigd met zoutoplossing om de dijbeenslagader (FA) voorzichtig weg te bewegen van de heupzenuw (FN) en de dijbeenader (FV).</li>
	<li>Passeer twee 7-0 absorbeerbare hechtingen door de proximale FA en maak dubbele knopen met behulp van een veerschaar om de FA tussen de twee banden te transfecteren.</li>
	<li>Om de distale FA bloot te leggen, passeert u een 7-0 absorbeerbare hechting door de onderrand van de incisie en sleept u de incisie voorzichtig naar het gebied van de rechterkant van de knie van de achterpoot.</li>
	<li>Beweeg het onderhuidse weefsel voorzichtig opzij om de neurovasculaire bundel bloot te leggen. Gebruik fijne puntige tang om het membraan van de femurschede te doorboren en ontleed de FA van de FV en FN.</li>
	<li>Passeer twee 7-0 absorbeerbare hechtingen door de distale FA en maak dubbele knopen. Gebruik een veerschaar om de FA tussen de twee banden te transfecteren. OPMERKING: Er werd geen ligatie uitgevoerd op de linker ledemaat, die diende als een controle in elke muis.</li>
	<li>Gebruik daarna 6-0 absorbeerbare hechtingen om de incisie te hechten. Plaats de muis op een verwarmingskussen in een schone kooi en blijf de vitale parameters controleren tot het herstel. Zorg voor postoperatieve analgetica: Buprenorfine s.c. (0,1 mg /kg lichaamsgewicht elke 8 uur gedurende 48 uur). Dien 48 uur na de operatie metamizol toe in drinkwater (24 mg /5 ml water komt overeen met een dosis van 200 mg / kg 4 maal daags).</li>
</ol>2. Magnetische resonantie beeldvorming
OPMERKING: Een dag na DLFA moeten de muizen MRI-scans ondergaan om FA-blokkering te beoordelen.
<ol><li>Plaats de muis in een transparante inductiekamer en verdoof de muis met 1,5-2% isofluraan in de omgevingslucht tot verlies van de rechtzettingsreflex.</li>
	<li>Plaats de muis op een verwarmd dierenbed uitgerust met een bijthouder en gepositioneerd in de richting van de magneet met een lasergestuurd systeem. Houd de lichaamstemperatuur op 37±1 °C.</li>
	<li>Houd tijdens beeldacquisitie de anesthesie met 1,5-2% isofluraan in de omgevingslucht en controleer de ademhaling met behulp van een druksonde.</li>
	<li>Verkrijg beelden in de transversale segmentoriëntatie met behulp van een driedimensionale (3D) time of flight (TOF) angiografiesequentie met parameter echo time (TE)/repetition time (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, vier gemiddelden, een acquisitiematrix van 178 x 144 gereconstrueerd tot 256 x 192 en 121 slices, resulterend in een isotrope resolutie van 0,15 mm3. Om het signaal van de aderen te onderdrukken, plaatst u een verzadigingsschijf distaal op de achterpoten.</li>
</ol>3. Klinische evaluatie en follow-up
<ol><li>Schat het functionele herstel in de1e,3e,5een7e dag na de operatie met behulp van de functionele score Tarlov schaal18,19 (Tabel 1).</li>
</ol>4. Histologische evaluatie
<ol><li>Breng zeven dagen na de operatie pentobarbital-injectie (115 mg / kg) aan om de muizen te euthanaseren.</li>
	<li>Perfuseer fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% paraformaldehyde (PFA) door de linker hartkamer (100 ml per muis). Fixeer de bilaterale gastrocnemius (Gm) van de muizen in 4% PFA 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Sluit het monster in paraffine in volgens het eerder beschreven protocol20.<ol>
<li>Snijd 4-5 μm dikke delen van het in paraffine ingebedde weefselblok op een microtoom. Plaats met behulp van een ronde verfkwast de gesneden weefseldelen in het waterbad dat op 42°C wordt gehouden.</li>
		<li>Plaats de microscoopglaas in het water onder een hoek van 45° en plaats deze voorzichtig onder de groep secties die moet worden verzameld.</li>
		<li>Til de glijbaan voorzichtig uit het water en laat de secties aan de glijbaan bevestigen en droog 's nachts in de incubator op de tafel bij 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer hematoxyline / eosine (HE) kleuring van de paraffine secties.<ol>
<li>Plaats de dia's met de secties in diahouders. Bereid 3 containers met vers xyleen voor en plaats de dia's gedurende 5 minuten in elke container om de secties te deparaffiniseren.</li>
		<li>Rehydrateer de secties door de plakjes achtereenvolgens in 96%, 80%, 70%, 50%, 30% ethanol en gedeïoniseerd water gedurende elk 5 minuten te dopen.</li>
		<li>Vlek in hematoxyline-oplossing gedurende 10 min.</li>
		<li>Breng de plakjes over in een bak met gedeïoniseerd water en spoel af door ze gedurende 5 minuten onder stromend leidingwater te plaatsen.</li>
		<li>Controleer met behulp van een microscoop de intensiteit van hematoxylinekleuring. Als de kleuring het mogelijk maakt om de celkernen duidelijk te identificeren, gaat u verder met de volgende stap. Als de kleuringsintensiteit de identificatie van celkernen niet vergemakkelijkt of als de intensiteit van de kleuring zwak is, plaatst u de dia gedurende 1 minuut in de hematoxyline-oplossing, herhaalt u de was met water (stap 4.4.4) en controleert u deze opnieuw.</li>
		<li>Counterstain in eosine-Y oplossing gedurende 5 min.</li>
		<li>Droog de secties uit door de plakjes achtereenvolgens in containers met gedeïoniseerd water en 30%, 50%, 70%, 80% en 96% ethanol achtereenvolgens te dopen voor een duur van 10 s elk. Plaats vervolgens de secties achtereenvolgens in drie containers met vers xyleen gedurende 10 s elk.</li>
		<li>Plaats de dia's horizontaal op microscopische dia-opslagkaarten met de secties naar boven gericht. Voeg voldoende bevestigingsmedium toe op de dia en monteer de dia's met coverslips.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de immunohistochemische (IHC) kleuring van de paraffinesecties uit.<ol>
<li>Herhaal de deparaffinisatie- en rehydratatiestappen 4.4.1-4.4.2. Dompel de secties vervolgens onder in een container met 10 mM natriumcitraatbuffer, pH 6, en breng het monster aan de kook in een magnetron. OPMERKING: Aangezien over- of onderverhitting van monsters inconsistente vlekken kan veroorzaken, moet u de temperatuur gedurende 10 minuten op net onder het kookpunt houden.</li>
		<li>Koel vervolgens de secties op een bankje gedurende 30 minuten. Was daarna de secties in PBS drie keer gedurende 5 minuten. Droog het gebied rond het monster zorgvuldig af en teken een grote cirkel rond het monster met een hydrofobe pen. . OPMERKING: Raak het monster nooit aan. Markering met een hydrofobe pen creëert een hydrofobe grens, die het gebruik van een kleiner volume antilichaamoplossing vergemakkelijkt.</li>
		<li>Demp endogene peroxidase-activiteit door de sectie gedurende 10 minuten in PBS in 0,3%H2 O2 te plaatsen. Bloksecties met 400 μL blokbuffer (PBS bevatten 3% runderserumalbumine en 0,3% niet-ionisch wasmiddel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.</li>
		<li>Was de secties in PBS gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 100-400 μL verdund anti-CD31-antilichaam (1:250) voldoende toe om de sectie te bedekken. Incubateer vervolgens secties 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde kamer. OPMERKING: Zorg ervoor dat de sectie volledig bedekt is met de antilichaamoplossing.</li>
		<li>Verwijder het primaire antilichaam en was de secties driemaal in PBS voor een duur van elk 5 minuten.</li>
		<li>Bereid het 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) mengsel door 1 druppel dab-concentraat toe te voegen aan 1 ml van het DAB-verdunningsmiddel en meng goed. Voeg daarna 100-400 μL DAB-mengsel toe aan de secties en controleer nauwlettend met het oog gedurende 2 minuten totdat een aanvaardbare kleurintensiteit wordt waargenomen. OPMERKING: Zorg ervoor dat het gedeelte volledig bedekt is met het DAB-mengsel.</li>
		<li>Daarna 5 min. afspoelen onder stromend leidingwater. Voer hematoxylinekleuring uit zoals beschreven in stappen 4.4.3-4.4.5.</li>
		<li>Voer eosine-Y-kleuring uit zoals beschreven in stap 4.4.6. Voer uit dehydratiestappen die worden beschreven in stap 4.4.7.</li>
		<li>De secties met coverslips gemonteerd met behulp van montagemedium. Gebruik ImageJ om het percentage CD31-positieve gebieden (%) in 5 willekeurig geselecteerde velden (40x) te schatten dat kan worden beschouwd als microvasculaire dichtheid zoals eerder beschreven21.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Statistische analyse
<ol><li>Gebruik statistische analysesoftware om de resultaten uit te drukken als gemiddelde ± standaarddeviatie en om ongepaarde t-testuit te voeren op de vergelijkingen. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat de inhoud van het artikel is samengesteld bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Deze studie rapporteert een aangepaste, vereenvoudigde en chirurgisch efficiënte aanpak om een HLI-model vast te stellen in ApoE-/- muizen met behulp van dubbele ligatie in de proximale en distale regio's van de FA via een incisie van 3-4 mm zonder vereiste laboratoriumupgrades. Het belangrijkste kenmerk van deze methode is de kleinere omvang van de incisie in vergelijking met eerder gerapporteerde studies die HLI-modellen van muizenbeschrijven 8,9,<su...

Er is een onvervulde behoefte aan preklinische diermodellen voor onderzoek naar vaatziekten zoals perifere arterieziekte (PAD). Ondanks de geavanceerde ontwikkelingen in diagnose en behandeling, waren er in 2018 meer dan 200 miljoen patiënten met PAD1, en hun aantal neemt voortdurend toe. Hoewel verschillende nieuwe therapeutische benaderingen2,3,4,5,6,7 zijn beschreven, blijft een succesvolle vertaling van deze therapeutische modaliteiten in klinische toepassing een ontmoedigende taak. Daarom zijn betrouwbare en relevante in vivo experimentele modellen nodig die de menselijke ziektetoestand simuleren om het potentiële mechanisme en de efficiëntie van deze nieuwe therapeutische benaderingen voor de behandeling van PAD6,7te onderzoeken.
Hyperlipidemie en atherosclerose (AS) zijn de belangrijkste risicofactoren voor de ontwikkeling van PAD. ApoE-/- muizen (op een vetrijk dieet) vertonen abnormaal vetmetabolisme en hyperlipidemie en ontwikkelen vervolgens atherosclerotische plaques waardoor ApoE-/- muizen de beste keuze zijn om de klinisch relevante PAD te simuleren. Preklinische HLI-diermodellen worden gegenereerd door dubbele ligatie van de femorale slagader (DLFA), wat de meest gebruikte aanpak is in laboratoria over de hele wereld8,9,10,11,12,13,14,15 om acute-op-chronische ischemie te simuleren. Deze aanpak vereist echter meestal een relatief grote en invasieve incisie. Bovendien leidt het er onvermijdelijk toe dat de dieren (vooral muizen) lijden aan verhoogde pijnschade en ontsteking, wat ook de daaropvolgende experimentele resultaten beïnvloedt5,6,16,17. Dit artikel beschrijft een acuut-op-chronisch HLI-model in APOE-/- muizen met behulp van een zeer kleine incisie.

<table><tbody><tr><td>10x Phosphate buffer saline</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td>Gebaten voor hematoxyline en eosin kleuring en immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Roth</td><td>9681.2</td><td>Gebaten voor immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>6-0 absorbable sutures</td><td>PROLENE</td><td>8776H</td><td>Gebaten voor het naaien van de huid</td></tr><tr><td>6-0 absroable suture</td><td>PROLENE</td><td>EP8706</td><td>Gebaten bij Chirurgie</td></tr><tr><td>7-0 absorbable sutures</td><td>PROLENE</td><td>EH8021E</td><td>Gebaten voor het binden van de slagader</td></tr><tr><td>7-0 absroable suture</td><td>PROLENE</td><td>EP8755</td><td>Gebaten bij Chirurgie</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Roth</td><td>6755.1</td><td>Gebaten voor hematoxyline en eosin kleuring</td></tr><tr><td>Albumin Fraktion V</td><td>Roth</td><td>8076.2</td><td>Gebaten voor immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec GmbH</td><td>Systec VX-150</td><td>Gebaten voor de sterilisatie van de chirurgische instrumenten</td></tr><tr><td>Axio vert A1 microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Gebaten voor het bekijken en nemen van de foto's van hematoxyline en eosin kleuring en immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td><td>Bruker Biospin MRI GmbH</td><td>N/A</td><td>Scan de blokkade van de femorale slagader</td></tr><tr><td>Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td><td>Bayer AG</td><td>2542 (WDT)</td><td>Gebaten in postoperatief pijnbeheersing. Dosis - 0,1 mg/kg lichaamsgewicht elke 8 uur gedurende 48 uur na de operatie</td></tr><tr><td>CD31 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Gebaten voor immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>Eosin Y solution 0.5 % in water</td><td>Roth</td><td>X883.1</td><td>Gebaten voor hematoxyline en eosin kleuring</td></tr><tr><td>Epitope Retrieval Solution pH 6</td><td>Leica Biosystems</td><td>6046945</td><td>Gebaten voor immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>Ethanol &ge; 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5054.1</td><td>Gebaten voor hematoxyline en eosin kleuring en immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Cayman Chemical</td><td>437-38-7</td><td>Gebaten voor anesthesie</td></tr><tr><td>Fine point forceps</td><td>Medixplus</td><td>93-4505S</td><td>Gebaten voor het scheiden van de slagader van zenuw en ader</td></tr><tr><td>Glass bead sterilisator</td><td>Simon Keller</td><td>Type 250</td><td>Gebaten voor sterilisatie van de chirurgische instrumenten</td></tr><tr><td>Graefe iris forceps curved</td><td>VUBU</td><td>VUBU-02-72207</td><td>Gebaten voor het doffe scheiden van huid en onderhuids weefsel</td></tr><tr><td>Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>108972</td><td>Haar verwijderen van achterste ledematen van muizen</td></tr><tr><td>Heating plate</td><td>ST&Ouml;RK-TRONIC</td><td>7042092</td><td>Houd de temperatuur van muizen constant</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Roth</td><td>T865.2</td><td>Gebaten voor hematoxyline en eosin kleuring en immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>Leica surgical microscope</td><td>Leica</td><td>M651</td><td>Vergroot het gezichtsveld om de operatie te vergemakkelijken</td></tr><tr><td>Liquid DAB+Substrate Chromogen System</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>Gebaten voor immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>Male ApoE-/- mice</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>Gebaten voor het vestigen van het muismodel voor perifere arteriële ziekte</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Cayman Chemical</td><td>128366-50-7</td><td>Gebaten voor anesthesie</td></tr><tr><td>Micro Needle Holder</td><td>Black &amp; Black Surgical</td><td>B3B-18-8</td><td>Houd de naald vast</td></tr><tr><td>Micro suture tying forceps</td><td>Life Saver Surgical Industries</td><td>PS-MSF-145</td><td>Gebaten om te helpen bij het knopen tijdens de chirurgie</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Biobase</td><td>Bk-Mt268m</td><td>Gebaten voor weefselsneden</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm</td><td>44856.01.00</td><td>Gebaten voor anesthesie</td></tr><tr><td>MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025</td><td>SA Instruments</td><td>N/a</td><td>bewaken van de vitale functies van dieren tijdens MRI-scan</td></tr><tr><td>Octeniderm farblos</td><td>Sch&uuml;lke &amp; Mayr GmbH</td><td>180212</td><td>Gebaten voor desinfectie van de huid</td></tr><tr><td>Ointment for the eyes and nose</td><td>Bayer AG</td><td>1578675</td><td>Houd de ogen vochtig onder de anesthesie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Roth</td><td>0335.1</td><td>Gebaten voor fixatie van het weefsel</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Nembutal</td><td>76-74-4</td><td>Gebaten voor anesthesie</td></tr><tr><td>Saline</td><td>DeltaSelect</td><td>1299.99.99</td><td>Gebaten voor anesthesie</td></tr><tr><td>Spring handle scissors with fine, sharp tips</td><td>Black &amp; Black Surgical</td><td>B66167</td><td>Gebaten voor het snijden van de slagader</td></tr><tr><td>SuperCut Scissors</td><td>Black &amp; Black Surgical</td><td>B55992</td><td>Gebaten voor het snijden van de huid</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>9002-93-1</td><td>Gebaten voor immunohistologische kleuring</td></tr><tr><td>Western diet, 1.25% Cholesterol</td><td>ssniff Spezialdi&auml;ten GmbH</td><td>E15723-34</td><td>Dieet voor de muizen</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Roth</td><td>4436.3</td><td>Gebaten voor hematoxyline en eosin kleuring en immunohistologische kleuring</td></tr></tbody></table>

een gewijzigd chirurgisch model van ischemie van de achterpoten in apoe-/- muizen met behulp van een miniatuurincisie

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Het doel van deze studie is het introduceren en evalueren van een aangepaste chirurgische aanpak om acute ischemie bij muizen te induceren die in de meeste dierlaboratoria kan worden geïmplementeerd. In tegenstelling tot de conventionele benadering voor dubbele ligatie van de dijbeenslagader (DLFA), werd een kleinere incisie op het rechter inguinale gebied gemaakt om de proximale femorale slagader (FA) bloot te leggen om DLFA uit te voeren. Vervolgens werd de incisie met behulp van een 7-0 hechting naar het kniegebied gesleept om de distale FA bloot te leggen. Magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) op bilaterale achterpoten werd gebruikt om FA-occlusie na de operatie te detecteren. Op 0, 1, 3, 5 en 7 dagen na de operatie werd het functionele herstel van de achterpoten visueel beoordeeld en beoordeeld met behulp van de Tarlov-schaal. Histologische evaluatie werd uitgevoerd na het euthanaseren van de dieren 7 dagen na DLFA. De procedures werden met succes uitgevoerd op het rechterbeen bij tien ApoE-/- muizen, en geen muizen stierven tijdens de daaropvolgende observatie. De incisiegroottes bij alle 10 muizen waren minder dan 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MRI-resultaten toonden aan dat de FA-bloedstroom in de ischemische kant duidelijk geblokkeerd was. De resultaten van de Tarlov-schaal toonden aan dat de functie van de achterpoten na de procedure aanzienlijk afnam en langzaam herstelde in de volgende 7 dagen. Histologische evaluatie toonde een significante ontstekingsreactie aan de ischemische kant en verminderde microvasculaire dichtheid in de ischemische achterpoot. Concluderend introduceert deze studie een aangepaste techniek met behulp van een miniatuurincisie om ischemie van de achterpoten (HLI) uit te voeren met behulp van DLFA.

Kenmerken van ApoE-/- muizen DLFA-operaties werden met succes uitgevoerd op 10 muizen om het HLI-model vast te stellen, en geen van de muizen stierf na de procedure. Om veranderingen in lichaamsgewicht te volgen, werden muizen gewogen vóór de DLFA-procedure (Pre-DLFA) en 7 dagen na de DLFA-operatie (Post-DLFA). Pre-DLFA-gewichten varieerden van 29,6 tot 38,0 g (gemiddeld 34,74 ± 2,47 g) en post-DLFA-gewichten varieerden van 26,5 tot 34,1 g (gemiddeld 30,77...

Dit artikel demonstreert een efficiënte chirurgische aanpak om acute ischemie vast te stellen bij muizen met een kleine incisie. Deze aanpak kan door de meeste onderzoeksgroepen worden toegepast zonder laboratoriumupgrades.

Een gewijzigd chirurgisch model van ischemie van de achterpoten in ApoE-/- Muizen met behulp van een miniatuurincisie

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

Wat we vandaag hebben geïntroduceerd, is een vereenvoudigde aangepaste en chirurgisch efficiënte methode om ischemie van de achterpoten bij ApoE-muizen vast te stellen. Deze methode kan in elke dierenfaciliteit worden geïmplementeerd. Het belangrijkste voordeel van de synoviale methode is een lage invasiviteit, met behulp van een incisie van minder dan vijf millimeter.De methode heeft een leerhof. We adviseren daarom om te oefenen met microchirurgische modellen voordat we aan de dieren werken, die in de uiteindelijke analyse zullen worden opgenomen. De methode zal worden gedemonstreerd door Kaixuan Yan, een arts in de geneeskunde en de student van mijn lab.Begin met het voorbereiden van de benodigde apparatuur en hulpmiddelen voor de operatie. Breng na het toedienen van de anesthesie aan de muis die zalf op de ogen aan om uitdroging te voorkomen. Plaats de muis vervolgens op een verwarmingskussen om de kerntemperatuur van het lichaam op ongeveer 37 graden Celsius te houden.Gebruik een wattenstaafje en ontharingscrème en verwijder voorzichtig het haar van de huid van de achterpoten aan de rechterkant. Leg de muis in rugligging op het verwarmingskussen onder een ontleedmicroscoop. Gebruik alcohol om de huid te desinfecteren en veeg met het katoen weg van de plantenkant van de incisie.Maak met behulp van de punttang en chirurgische schaar een incisie van ongeveer drie tot vier millimeter in het midden van het liesgebied. Verwijder voorzichtig het onderhuidse vetweefsel met behulp van een fijne puntige tang om de proximale femorale neurovasculaire bundel bloot te leggen. Gebruik een wattenstaafje bevochtigd met zoutoplossing en beweeg de dijbeenslagader voorzichtig weg van de heupzenuw en de dijbeenader.Gebruik vervolgens de punt van een 7.0 hechting en doorboort voorzichtig het membraan van de femurschede. Ga vervolgens naar 7-0 absorbeerbare hechtingen door de proximale dijbeenslagader en maak dubbele knopen met behulp van de verenschaar. Daarna transect de dijbeenslagader tussen de twee banden.Passeer de 6-0 absorbeerbare hechting door de onderrand van de incisie en sleep de incisie voorzichtig naar het gebied van de rechterkant van de knie van de achterpoot om de distale foetale slagader bloot te leggen. Beweeg het onderhuidse weefsel voorzichtig opzij om de neurovasculaire bundel bloot te leggen. Ontleed de dijbeenslagader van de dijbeenader en de heupzenuw en gebruik katoen om de zenuw te beschermen.Gebruik vervolgens de punt van een 7.0 hechting en doorboort het membraan van de dijbeenschede. Passeer twee 7-0 absorbeerbare hechtingen door de distale femorale slagader en maak dubbele knopen met behulp van de veerschaar om de dijbeenslagader tussen twee banden te transecteren. Hecht daarna de incisie met behulp van de 6-0 absorbeerbare hechtingen.Plaats de muis op een verwarmingskussen in een schone kooi en blijf de vitale parameters controleren tot het herstel. Bepaal het succes van dubbele ligatie van de femorale slagader of DLFA op de volgende dag via MRI. Vóór de DLFA-procedure varieerden de gewichten van muizen van 29,6 tot 38,0 gram.Zeven dagen na de DLFA-operatie varieerden de gewichten van 26,5 tot 34,1 gram, aanzienlijk lager dan de pre-DLFA-gewichten. De proximale en distale regio's van de rechter FA vertoonden geen perfusie. De resultaten van de Tarlov-schaal waren een dag na de operatie significant afgenomen.Hoewel ze de volgende dagen langzaam toenamen, waren ze nog steeds lager dan de uitgangswaarde tot dag zeven. De poten van de ischemische achterpoten bij zeven muizen waren niet in staat om op natuurlijke wijze uit te rekken in vergelijking met de contralaterale kant. Bovendien vertoonden vier van de muizen een lichte verkleuring van de poten in vergelijking met de contralaterale zijde.H&E-kleuring van de rechter GM-spier onthulde myofiberen die onregelmatige ischemische necrose vertoonden, waarbij prolifererende satellietcellen de necrotische myofiberen hadden vervangen en in een massa of met een regelmatige dispersie werden verdeeld. Myofiberen die inflammatoire infiltratie door multinucleaire macrofagen vertoonden, hadden hun normale morfologische kenmerken verloren, waarbij zeer weinig geregenereerde myofiberen aanwezig waren. Dwarsdoorsneden van deze geregenereerde myofiberen waren rond.Het cytoplasma was rood gekleurd en één kleine kern of meerdere kernen bevonden zich in het midden. Dit soort ontstekingspatroon werd echter niet waargenomen in de linker GM. CD31-antilichaamkleuring uitgevoerd om microvasculaire dichtheid te observeren, gaf aan dat ischemische achterpoten significant meer microvasculaire dichtheid vertoonden dan de niet-ischemische kant. Het belangrijkste is dissectie van de dijbeenslagader.De operator moet ervaring hebben met microchirurgische technieken en bekend zijn met de anatomie van de achterpoten van muizen. In principe zou deze methode ook gebruikt kunnen worden om Ischemia-reperfusieletsel in het been te bestuderen. Hierbij kan de slagader worden afgesloten met een zachte vaatklem voordat reperfusie wordt toegestaan.

a-modified-surgical-model-hind-limb-ischemia-apoe-mice-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De chirurgische procedure voor het induceren van eenzijdige achterbeen ischemie is aangetoond, met bevestiging van ischemie door een laser Doppler perfusie beeldvorming.

Muizenmodel van achterbeen ischemie

We demonstreren a novel arteriële ligatie model in muizen spinotrapezius spier, inclusief een stap-voor-stap procedure en beschrijving van de vereiste instrumenten. We beschrijven de operatie en relevante uitkomstmaten met betrekking tot vasculaire netwerk remodeling en functionele vasodilatatie met intravitale en confocale microscopie.

Murine Spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire Ligatie beoordelen op microvasculaire functie en Remodeling

Het raam van de muizen dorsale huidplooi kamer gepresenteerd visualiseert een zone van acute aanhoudende ischemie van een musculocutane flap. Intravitale epi-fluorescentie microscopie vergunningen voor directe en repetitieve evaluatie van de microvasculatuur en kwantificering van hemodynamiek. Morfologische en hemodynamische resultaten kunnen verder worden gecorreleerd met histologische en moleculaire analyses.

Ischemische Tissue Injury in de dorsale huidplooien kamer van de Muis: A Skin Flap Model naar Acute Persistent Ischemia Onderzoek

Een zeer reproduceerbaar model voor myocardinfarct bij muizen met minimale invasieve manipulaties wordt beschreven. Het model kan eenvoudig worden uitgevoerd, wat resulteert in een hoge reproduceerbaarheid en overlevingsgraad. Daarom zal het beschreven model het aantal benodigde dieren verminderen zoals gevraagd door het 3R-principe (Vervanging, Verfijning en Vermindering).

Minimaal invasieve chirurgische procedure voor het induceren van Myocardinfarct in Muizen

Dit nieuwe model voor orthotope achterste ledematen transplantatie in de muis, van een niet-hechtingsmanchet techniek voor super-microvasculaire anastomose, een krachtig hulpmiddel voor in vivo mechanistische immunologisch onderzoek naar gevasculariseerd samengestelde allotransplantatie (VCA).

Orthotope Hind Limb Transplantation in de muis

Chirurgische inductie van hindlimbischemie bij muizen is nuttig om angiogenesis te onderzoeken, maar dit wordt bemoeilijkt bij bepaalde ingefokt muizenrassen die duidelijke ischemie-geïnduceerde weefsellethale schade vertonen. Er worden methoden beschreven om subacute ledemaatische ischemie te induceren met behulp van ameroïde constrictors om dit probleem te omzeilen door de inductie van geleidelijke arteriële occlusie.

Methoden voor acute en subacute muizen achterbeen ischemie

We beschrijven een muismodel van een beroerte veroorzaakt door de occlusie van de middelste hersenslagader met behulp van een met siliconen omhulde naald. Het protocol kan worden toegepast om een permanente occlusie of een tijdelijke ischemie te induceren, gevolgd door reperfusion.

Inductie van ischemische beroerte en ischemie-reperfusie in Muizen met behulp van het Midden-slagader occlusie Techniek en Visualisatie van Infarct Area

Hier wordt een kritisch hindledemaat ischemie-experimentele model gepresenteerd, gevolgd door een batterij met functionele, histologische en moleculaire tests om de effectiviteit van angiogene therapieën te beoordelen.

Beoordeling van therapeutische angiogenese in een Muriene model van Hindledemaat ischemie

Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode die myocardinfarct of myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen kan induceren door precisieligatie van de linker voorste dalende kransslagader door middel van micromanipulatie.

Inductie van myocardinfarct en myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen

Dit protocol beschrijft het oogsten, hechten en bewaken van fasciocutane flappen bij ratten die een goede visualisatie en manipulatie van de bloedstroom door de oppervlakkige inferieure epigastrische vaten mogelijk maken door middel van het klemmen en ligeren van de dijbeenvaten. Dit is van cruciaal belang voor studies met ischemische preconditionering.

De oppervlakkige inferieure epigastrische arterie axiale flap om ischemische preconditioneringseffecten in een rattenmodel te bestuderen

We presenteren een reproduceerbaar muismodel van heterotopische vascularisatie allotransplantatie van achterpoot tot hals. Dit supermicrochirurgisch protocol, waarbij 0,3-0,5 mm vatenanastomosen worden gebruikt, integreert nylonfilamentgeleiding en veneuze manchetten. Het biedt een betrouwbaar platform voor translationele studies naar tolerantie, ischemie-reperfusieschade en immunologische mechanismen bij vasculariseerde samengestelde allotransplantatie.

Heterotopische achterpoot-naar-nek transplantatie bij de muis: een supermicrochirurgisch model van vasculariseerde composietallotransplantatie

Leer een minimaal invasieve chirurgische techniek om acute ischemie van de achterpoten te induceren bij ApoE-/- muizen. Deze methode gebruikt een kleine incisie en is toegankelijk voor de meeste onderzoeksgroepen.

Een gewijzigd chirurgisch model van ischemie van de achterpoten in ApoE^-/- Muizen met behulp van een miniatuurincisie

Meer video's verkennen