Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Het doel van dit protocol is om heterochromatine aggregaten in Drosophila cellen te visualiseren. Om dit te bereiken, gebruiken we polytenecellen die worden gevonden in de speekselklieren van derde instar larven Het genoom van deze cellen wordt bijna duizend keer versterkt en de chromosomen behouden de kenmerken van interfacecellen. Ze hebben goed gedefinieerde telomeren en bruggen genaamd chromocenter waarin alle centromeren zich verzamelen, en het is voornamelijk heterochromatisch.

Met behulp van het derde instar larvenweefsel, kunnen we ook verandering in de heterochromatische aggregaten in de achtergrond van verschillende genetische mutanten evalueren. Om de derde instar-larvencultuur te optimaliseren, moet je eerst 5 tot 10 dagen oude volwassenen verzamelen en ongeveer 50 in een brede nekfles van een standaardmedium doen. 25 mannen en 25 vrouwen.

Plaats de fles gedurende 12 uur in een incubator met gecontroleerde temperatuur op 25 Graden Celsius. Nadat de incubatietijd voorbij is, verwijdert u de volwassenen en zet u ze over in een nieuwe fles om de procedure te herhalen. Laat de embryo's 22 uur lang groeien bij 18 graden Celsius.

Voor larvenverzameling, zorg ervoor dat u de zwervende larven kiest, die geen openlijke bolvormige kenmerken hebben. Ontleed 15 paar speekselklieren, of zoveel als je kunt in 30 minuten periode in koude PBS met protestremmers onder de microscoop. Breng de speekselklieren over naar een andere buis met ijskoud PBS.

Was één keer met koude PBS plus protestremmers. Vergeet niet, wacht altijd tot het weefsel de bodem van de buis bereikt. Nadat u de PBS van de laatste stap hebt verwijderd, voegt u direct 0,5 milliliter van één X-groep gomfixatiebuffer en 50% methanol plus 2% formaldehyde toe.

Incubeer gedurende twee uur bij vier Graden Celsius met milde rotatie. Voer een rotatiewas van vijf minuten uit met tris-tritonbuffer en voeg één milliliter toe. Wacht altijd tot het weefsel de bodem van de buis bereikt.

Opmerking: wacht tot het weefsel de bodem van de buis bereikt. Incubeer de speekselklieren met Tris-Triton, hetzelfde als hierboven, plus 1% bèta mercaptoethanol gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met licht schudden. Wassen met BO3 buffer, en incuberen met BO3 plus 10 millimolar DTT op 37 graden Celsius met mild schudden gedurende 15 minuten.

Voer aan het einde van de incubatieperiode alleen een wasbeurt uit met één milliliter BO3-buffer. Incubeer de speekselklieren gedurende twee uur bij kamertemperatuur bij kamertemperatuur met rotatie in één milliliter buffer B. Verwijder alle buffer B en voeg buffer A plus antilichaam van belang toe.

In dit geval gebruiken we HP één, A C 18 9 van Iridium bank. 1 op 3.000 's nachts bij vier graden met rotatie. Op dit punt is het belangrijk dat het schudden geen bubbels opwekt, wat het antilichaam kan beschadigen.

Geef traktatie door 15 minuten wasbeurten met buffer B, onder roeren bij kamertemperatuur met elke keer een millimeter. De klieren worden overgebracht naar buffer B samen met het secundaire antibioticumpaar naar een vloer verwijzen gedurende twee uur, onder rotatie bij vier graden. Bij deze stap is het belangrijk om de buis te bedekken met aluminiumpapierfolie om het secundaire antilichaam tegen het licht te beschermen.

Voer wasmachines van 2x15 minuten uit bij kamertemperatuur, terwijl u draait met een milliliter buffer B.Incubeer met een DNA-marker zoals Sydox of OH, en los op in één milliliter buffer B gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met rotatie. Voer één wasbeurt uit met buffer B en eenmaal met PBS, elke was duurt 10 minuten, terwijl u op kamertemperatuur draait. Monteer ten slotte de speekselklieren op een glijbaan en maak een zwembad met een afdekstrook.

Leg de speekselklieren in het midden van het zwembad en bedek met Sidiflor. Om vervorming van de bel te voorkomen, breidt u de stropende vloeistof overal uit. Sluit vervolgens alle dia's af met duidelijke nagellak.

Observeer onder een fluorescentie- of confocale microscoop. Als het monster niet op dezelfde dag wordt waargenomen, bewaar het dan bij vier graden uit het licht. Representatieve resultaten van HB1 monostaining in Drosophila speekselklieren worden getoond in figuur één.

Een positief resultaat is het observeren van één brandpunt zoals in A, athero chromatisch aggregaat of condensaat. Een negatief resultaat is geen signaal of een verspreid signaal. Soms kan een dubbel signaal worden waargenomen als een dubbel punt in C, maar komt meestal in kleinere hoeveelheden voor.

Om de gegevens te analyseren die ze kunnen weergeven als een staafdiagram, waarbij de verdeling van HP1 wordt vergeleken met verschillende mutante achtergronden. In figuur twee zien we bijvoorbeeld dat 98% van de kernen een verdeling van één punt vertoont. En 2% van twee foci in wild type.

In de mutant veranderde het aandeel en de aanwezigheid van twee foci steeg tot 40%Figuur drie toont representatief trimethylatielysine 9H3 in monostaining. Resultaat in Drosophila speekselklieren observeren van een brandpunt in B, het is een gunstig resultaat op het chromatische aggregaat of condensaat, een dubbel of drievoudig signaal in C kan worden gezien in zeldzame gevallen, maar in een kleine hoeveelheden. Aan het einde van dit protocol kunt u ondanks staatsbeperkingen een diachromatisch condensaat van HP1-eiwit zien, het zal een goede eerste benadering zijn.