Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Dit protocol is zeer belangrijk omdat het de state-of-the-art workflow vertegenwoordigt voor de wereldwijde analyse van eiwit arginine methylatie door massaspectrometrie. Dit is de enige methode om R-gemethyleerd eiwit te identificeren en te profileren met een resolutie in één stijl die niet haalbaar is met andere biochemische technieken. In combinatie met het gebruik van PRMT-remmers, waarvan er verschillende in klinische onderzoeken en geneesmiddelen tegen kanker zijn, maakt dit protocol een diepgaande analyse van hun werkingsmechanisme mogelijk.

Om te beginnen, voer reductie van de thiolgroep van eiwitten uit met behulp van een stamoplossing van DTT opgelost in ultrapuur water in een uiteindelijke concentratie van 4,5 millimolar en laat de reactie gedurende 30 minuten gaan bij 55 graden Celsius. Voer alkylering van de thiolgroep van eiwitten uit door jodoacetamide toe te voegen in een concentratie van 10 millimolar en gedurende 15 minuten te broeden bij kamertemperatuur in het donker. Om de proteolyse-efficiëntie te verifiëren, slaat u een aliquot eiwitextract op voor latere analyse op SDS-PAGE Coomassie-gekleurde gel en vergelijkt u deze met een overeenkomstige hoeveelheid monster bij de spijsvertering.

Verdun het resterende eiwitextract met vier volumes van 20 millimol HEPES bij pH 8,0 om een uiteindelijke ureumconcentratie van twee kiezen te bereiken. Splits het monster in twee delen en voeg vervolgens sequencing grade gemodificeerd trypsine toe aan de ene en LysargiNase protease aan de andere. Laat de monsters een nacht bij 37 graden Celsius in een ThermoMixer met 600 rotaties per minuut om enzymatische spijsvertering mogelijk te maken.

Verzamel voor elke chromatografische gradiënt alle fracties in een diepe 96-well plaat. Bundel de fracties die vóór het begin van de gradiënt zijn verzameld in één enkele fractie met de naam pre. Voeg de 60 fracties van de hoge pH omgekeerde fase vloeistofchromatografische gradiënt samen door ze op een niet-aaneengesloten manier te bundelen in 14 laatste fracties.

Om niet-aaneengesloten aaneenschakeling te verkrijgen, poolt u de hoge pH omgekeerde fasefracties zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bundel de fracties die na de gradiënt zijn verzameld in een unieke breuk met de naam post. Voer sequentiële immunoaffiniteitsverrijking van het gemodificeerde peptide afzonderlijk uit voor de twee monsters van trypsine- en LysargiNase-verteringen.

Verdun de 10X geconcentreerde immuno-affiniteitszuivering of IAP-buffer 10 keer. Centrifugeer de gelyofiliseerde peptiden op 2.000 G gedurende vijf minuten om de peptiden naar de bodem van de buis te laten draaien. Resuspendeer de peptiden met 250 microliter verdunde IAP-buffer per buis van 15 milliliter en breng over naar een 1,5 milliliter buis met lage binding.

Gebruik een lakmoespapier om te controleren of de pH hoger is dan zes. Bewaar een kleine aliquot van elke fractie als input voor de daaropvolgende MS-analyse. Splits elke fractie in twee delen om de immunoverrijking van asymmetrisch gedimethyleerde of ADMA en symmetrisch gedimethyleerde of SDMA-peptiden parallel uit te voeren.

Bereid drie injectieflacons van de geselecteerde anti-pan R-gemethyleerde antilichamen geconjugeerd aan eiwit A agarose kralen per 10 milligram van het oorspronkelijke eiwitextract. Bereid de juiste hoeveelheid antilichaam geconjugeerd aan agaroseparels door elke injectieflacon gedurende 30 seconden op 2.000 G te centrifugeren en de buffer uit de kralen te verwijderen. Was de kralen drie keer met één milliliter 1X PBS door ze gedurende 30 seconden op 2.000 G te centrifugeren.

Na de laatste wasbeurt resuspenseer je de kralen in 40 microliter 1X PBS voor elke injectieflacon, pool ze en verdeel ze uiteindelijk gelijk in 16 fracties. Voeg 250 microliter 1X IAP-buffer toe aan elke buis en meng door omkeren. Incubeer vervolgens de buizen op een draaiend wiel gedurende twee uur bij vier graden Celsius.

Na de incubatie centrifugeert u de buizen van 1,5 milliliter die peptiden en pan R-methylantilichaam geconjugeerde kralen bevatten bij 2.000 G gedurende 30 seconden om de kralen te pelleteren en de stroom van elke fractie over te brengen in een schone 1,5 milliliter lage bindingsbuis. Voeg de kralen toe aan de flowthrough geconjugeerd aan antilichamen tegen R-monomethylatie en herhaal de resuspensie in PBS, incubatie met IAP-buffer en centrifugatie. Was tijdens de incubatie van de peptidemonsters met monomethylisatie of MMA-kralen de fracties die eerder immunoprecipiteerden met anti-ADMA en SDMA met 250 microliter IAP-buffer tweemaal en gooi het supernatant na elke wasbeurt weg.

Was vervolgens drie keer met water van LC-MS-kwaliteit. Elute de affiniteit verrijkte SDMA of ADMA peptiden uit de agarose kralen door het toevoegen van 50 microliter van 0,15 TFA aan elke buis. Laat deze oplossing 10 minuten op kamertemperatuur staan en keer de buisjes om de twee tot drie minuten om.

Breng de eerste elutie over in schone 1,5 milliliter laagbindende buizen en herhaal de elutie met 50 microliter van 0,15 TFA. Bundel de twee elutiedracties in één buis. Herhaal dit proces voor de R-mono-gemethyleerde peptiden die werden geïncubeerd met de anti-MMA-antilichaamparels.

Na het mengen van de lichte en zware gelabelde cellen, werden eiwitten geëxtraheerd en onderworpen aan de spijsvertering door trypsine en LysargiNase. Een SDS-PAGE Coomassie-gekleurde gel werd gebruikt om de efficiënte enzymatische vertering van totale eiwitten in peptiden te verifiëren. De efficiëntie van de zuiveringsstap uitgevoerd door de C18 Sep-Pak-kolom werd geëvalueerd, wat de afwezigheid van peptiden in de flowthrough van de C18-kolom en in de eerste en tweede wasbeurt bevestigde, evenals hun verwachte aanwezigheid in het eluent.

De juiste MET4-opname in het zware kanaal en de juiste zware of lichte menging werden geëvalueerd. Het chromatogram van de offline hoge pH omgekeerde fase vloeistofchromatografie fractionering van peptiden en de daaropvolgende niet-aaneengesloten aaneenschakeling van fracties worden hier getoond. Peptiden werden gedetecteerd door 250 nanometer UV, terwijl potentieel resterende onverteerde eiwitten werden geëvalueerd door 280 nanometer UV. De volledige MS-spectra van peptiden die echte positieve methylpeptide-annotatie vertegenwoordigen, werden verkregen.

De M over Z-verschillen tussen de drie pieken komen overeen met de aanwezigheid van enzymatisch gemethyleerd residu. De volledige MS-spectra van peptiden die vals-positieve methylpeptide-annotatie vertegenwoordigen, werden verkregen. De waargenomen M over Z-verschillen tussen het licht gemethyleerde peptide en zijn punitieve zware tegenhanger wijken af van de verwachte waarde met 0,0312.

De protocolworkflow is over het algemeen lineair, maar er zijn een paar stappen die speciale aandacht nodig hebben. Bijvoorbeeld de IPH-chromatografiescheiding met niet-aaneengesloten fractie-aaneenschakeling, evenals de IP-opstelling. Hetzelfde protocol kan worden gekoppeld aan standaard SILAC of labelvrije kwantificering om de methylatiedynamiek van arginine te profileren als reactie op een verscheidenheid aan verstoringen.

Dit protocol effent de weg naar de karakterisering van de omvang en dynamiek van eiwitmethylatie in verschillende celtypen en modelsystemen die alle aspecten van fundamenteel en translationeel onderzoek gericht op PRMT's ondersteunen.