Efficiënte fragmentscreening bereiken in de XChem-faciliteit bij Diamond Light Source
29 mei 2021
Dit artikel beschrijft het volledige XChem-proces voor het screenen van fragmenten op basis van kristallen, vanaf het aanvragen van toegang en alle daaropvolgende stappen tot het verspreiden van gegevens.
De XChem-faciliteit bij Diamond Light Source biedt routinematige, grootschalige screening van kristalgrafische fragmenten, ter ondersteuning van het hele proces van kristal tot afzetting. Röntgenkristallografie is een essentieel onderdeel van de FBDD-toolkit. Het is gevoelig genoeg om zwakke bindmiddelen te identificeren en levert direct structurele informatie op over de interacties op moleculair niveau.
Fragment based drug discovery is een veelgebruikte strategie voor lead discovery. Het heeft zes geneesmiddelen geleverd voor klinisch gebruik en meer dan 50 moleculen zijn gevorderd tot klinische proeven. De impact van de vooruitgang en efficiëntie die het XChem-platform biedt ten opzichte van traditionele inweekmethoden, gegevensverzameling en analysemethoden, wordt het best visueel gedemonstreerd.
Begin met het kiezen van de kristallen en de locatie van de verbinding. Open TextRank vanaf een pc en selecteer de kristallade, hetzij in de lijst rechtsonder, hetzij door de streepjescode in het vak linksboven te typen. Selecteer het juiste beeldformaat en de weergave van één put.
Als u oplosmiddel of verbindingen aan een druppel wilt toevoegen zonder het kristal te raken, klikt u met de rechtermuisknop in de druppel, maar weg van het kristal wanneer een geschikt kristal voor een experiment wordt gevonden terwijl u door de druppelafbeeldingen beweegt. Open de Echo-software en selecteer nieuw om oplossingen te doseren met behulp van de akoestische dispenser. Kies de juiste bronputplaat en de vloeistofklasse.
Zorg ervoor dat het juiste plaattype is geselecteerd als bestemmingsplaat. Vink vervolgens het aangepaste vakje aan en ga verder. Selecteer importeren en kies het relevante batchbestand.
Voltooi vervolgens de importstappen zoals gevraagd door de software. Gebruik de plaatkaarten om de toe te dienen oplossing en de bestemmingslocaties te controleren. Voer vervolgens het protocol uit volgens de aanwijzingen zodra ze verschijnen.
De oplossingen van de bronplaat worden gedoseerd in de gekozen kristaldruppels. Bewaar de plaat gedurende de gewenste tijd in de couveuse. Om de kristallen te oogsten met behulp van het semi-automatische kristaloogstapparaat, drukt u op de startworkflowknop om naar de eerste geselecteerde putpositie te gaan.
Als het kristal het heeft overleefd, monteer je het in de lus en dompel je het in de vloeibare stikstof, waarbij je het op positie één in de eerste puck in de lijst plaatst. Selecteer de juiste beschrijving voor het kristal in de interface. Als de druppel een samengesteld bad is, noteer dan de beschrijving van de samengestelde toestand.
Als het kristal met succes is gemonteerd, selecteert u gekoppeld, anders selecteert u fail. Zodra de kristallen zijn geoogst, breng je de pucks naar de barcodescanner en plaats je ze één voor één in de houder om de puck- en pinbarcodes te scannen. Zodra het scannen is voltooid, plaatst u de deksels op de pucks en bewaart u ze in een opslagplaats voor vloeibare stikstof.
Als u zich de verkeerd gecentreerde monsters wilt herinneren, kijkt u naar de weergave van de monsterwisselaar in ISPyB en selecteert u rangschikking op AP-resolutie om de monsters te beoordelen op automatisch verwerkte resolutie in een kleurgradatie van groen naar rood. Klik op de monsters om te controleren op rode of gele monsters. Controleer vervolgens de kristalsnapshots om te zien of het kristal gecentreerd is.
Om de automatische verwerkingsresultaten van Diamond op te halen en te analyseren via XChem Explorer of XCE, gaat u in een terminal naar de submapverwerking en gebruikt u de alias XCE om XChem Explorer te openen. Selecteer de knop Tabellen bijwerken op basis van gegevensbron op het tabblad Overzicht om de samenvatting van de experimentele gegevens te vernieuwen. Selecteer op het tabblad Instellingen de map voor gegevensverzameling en open het tabblad Gegevenssets.
Kies het doel in het vervolgkeuzemenu Doel selecteren, selecteer Nieuwe resultaten ophalen uit automatische verwerking in het vervolgkeuzemenu Gegevenssets en klik op Uitvoeren. Om de eerste kaarten te berekenen met behulp van Dimple, opent u het tabblad Kaarten, kiest u het referentiemodel in het vervolgkeuzemenu en selecteert u de gewenste datasets, gevolgd door Dimple uit te voeren op geselecteerde MTZ-bestanden. Om ligandbeperkingen te genereren, selecteert u de gewenste gegevenssets, gevolgd door het maken van SCF- of PDB- of PNG-bestand van geselecteerde verbindingen in de vervolgkeuzelijst Kaarten en beperkingen.
Om treffers te identificeren met behulp van Panda, selecteert u het tabblad Panda's, zorgt u ervoor dat de uitvoermap correct is gedefinieerd en voert u panda uit. Analyseer vanuit het vervolgkeuzemenu Hitidentificatie. Als u treffers wilt analyseren die door Panda zijn geïdentificeerd, voert u panda uit.
Inspecteer in het vervolgkeuzemenu Hitidentificatie. Om Meerkoet te openen met het Panda-configuratiescherm. Laad gemiddelde en 2mFo-DFc kaarten van Dimple voor vergelijking met de event map en het model.
Zodra een ligand is aangebracht, klikt u op ligand samenvoegen met model en model opslaan voordat u naar een andere gebeurtenis navigeert om te voorkomen dat wijzigingen in het gebonden toestandsmodel verloren gaan. Annoteer de bindingsgebeurtenis met behulp van het veld met commentaar op de gebeurtenis en annoteer de bindingssites met behulp van informatie over de recordsite. Zodra alle levensvatbare liganden zijn gemodelleerd, samengevoegd en opgeslagen op basis van de gebeurteniskaart, sluit u panda.inspect.
Exporteer de Panda-inspectiemodellen terug naar de projectdirectory en start een eerste verfijningsronde voor de geselecteerde datasets, en de verfijning zal nu zichtbaar zijn op het tabblad Verfijning. De XChem-pijplijn voor het screenen van fragmenten door middel van röntgenkristallografie is uitgebreid gestroomlijnd, waardoor het door de wetenschappelijke gemeenschap kan worden overgenomen. Deze grafiek toont de acceptatie en consolidatie van het gebruikersprogramma van 2015 tot en met 2019 met de oprichting van bloktoewijzingsgroepen in 2019 en de veerkracht van het platform tijdens de COVID-19-pandemie in 2020.
Succesvolle campagnes leveren een driedimensionale kaart op van potentiële interactieplaatsen op het doeleiwit. Een typische uitkomst is de XChem-screening van de belangrijkste protease van SARS-CoV-2. De bekende interessante plaatsen, zoals enzymactieve plaatsen en subzakken, worden in geel weergegeven.
De vermeende allosterische sites, zoals die welke betrokken zijn bij eiwit-eiwitinteracties, worden weergegeven in magenta en kristalverpakkingsinterfaces die over het algemeen als vals-positieven worden beschouwd, worden in groen weergegeven. Historisch gezien was het moeilijk om kristallografie te gebruiken als een primair fragmentscherm. Deze studie documenteerde de XChem-pijplijnprotocollen vanaf de monstervoorbereiding tot de uiteindelijke structuren.
Kristallografische fragmentscreening is een aanvulling op andere biofysische technieken en is meestal essentieel voor het ontwikkelen van fragmenttreffers tot loodverbindingen. Het kan worden toegepast op elke doelklasse voor het ontdekken van geneesmiddelen.
Overzicht
Dit artikel beschrijft het volledige XChem-proces voor fragment-screening op basis van kristallen, met details over de stappen van de aanvraag voor toegang tot de verspreiding van de gegevens. De XChem Facility bij Diamond Light Source optimaliseert fragment-gebaseerde geneesmiddelenontwikkeling door middel van efficiënte röntgendiffractie-kristallografie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Fragment-gebaseerde geneesmiddelenontwikkeling (FBDD)
- Röntgendiffractie
- Structurele biologie
Achtergrond
- Fragmentgebaseerde geneesmiddelenontdekking is een strategie voor het vinden van leadverbindingen.
- Röntgenkristallografie biedt structurele inzichten in moleculaire interacties.
- Traditionele soakingsmethoden hebben beperkingen die door XChem worden aangepakt.
- Het XChem-platform heeft veerkracht getoond tijdens de COVID-19-pandemie.
Doel van de studie
- Om de XChem-pijplijnprotocollen te documenteren, van monsterpreparatie tot de uiteindelijke structuren.
- Om de efficiëntie van het XChem-platform voor fragment screening aan te tonen.
- Om de impact van crystallographic fragment screening op geneesmiddelenontwikkeling te belichten.
Gebruikte methoden
- Selectie van kristallen en verbindingen voor screening.
- Gebruik van akoestische dispensers voor het dispenseren van oplossingen.
- Oogsten van kristallen met behulp van halfautomatische apparatuur.
- Data-analyse via XChem Explorer- en Panda-software.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle campagnes leveren driedimensionale kaarten van interactieplaatsen op.
- Gedocumenteerde adoptie van het gebruikersprogramma van 2015 tot 2019.
- Identificatie van potentiële allostere plaatsen en actieve plaatsen op eiwitten.
- Gestroomlijnde protocollen maken toegang voor een bredere wetenschappelijke gemeenschap mogelijk.
Conclusies
- De XChem-pijplijn verhoogt de efficiëntie van fragment-screening aanzienlijk.
- Crystallografische fragment-screening vult andere biofysische technieken aan.
- Verbeteringen in het XChem-platform ondersteunen de voortdurende inspanningen op het gebied van geneesmiddelenontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Fragmentgebaseerde geneesmiddelenontwikkeling is afhankelijk van de gevoelige detectie van zwakke moleculaire interacties, waarbij röntgendiffractie zowel de bindingsaffiniteit als de structurele details verschaft die essentieel zijn voor lead-optimalisatie. De XChem-faciliteit bij de Diamond Light Source stroomlijnt crystallografische fragmentscreening van monsterpreparatie tot datadepositie, waardoor routinematige identificatie van zwakke binders met een hoge structurele getrouwheid mogelijk wordt. Deze capaciteit ondersteunt vroege targetvalidatie en de progressie van hit naar lead over diverse therapeutische gebieden, wat de mechanistische onzekerheid in discovery-pipelines vermindert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door directe observatie van ligandbindingsmodi op atomaire resolutie.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door target-interactie en de toegankelijkheid van de bindingsplaats te bevestigen voorafgaand aan investeringen in de campagne.
- Voorspellende waarde: Genereert betrouwbare startpunten voor medicinale chemie door het identificeren van fragmenten met gedefinieerde interactiegeometrieën.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare structurele resultaten die een betrouwbare evaluatie van verbindingen over verschillende campagnes mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Faciliteert high-throughput screening via geautomatiseerde monsterverwerking en onbemande gegevensverzameling op de I04-1 beamline.
- Datakwaliteit: Produceert kwantitatieve elektronendichtheidskaarten en ligand-restraints die hit-validatie en daaropvolgende verfijning ondersteunen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Levert structurele inzichten die aansluiten bij de ontwikkeling van biomarkers door interactieplaatsen in kaart te brengen die relevant zijn voor de functie.
- Preklinische Risicoreductie: Maakt een snelle follow-up mogelijk van hits uit opkomende targets, zoals aangetoond tijdens de screening van het SARS-CoV-2 hoofdprotease met een doorlooptijd van 3 weken.
- Portfolio-relevantie: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door structureel bewijs van binding te leveren voor diverse targetklassen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het XChem-platform is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, en biedt structurele gegevens die de selectie van hits en optimalisatiestrategieën onderbouwen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door direct structureel bewijs van interacties tussen verbinding en target te leveren, waardoor bindingsmechanismen worden verduidelijkt.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via geautomatiseerde kristalbehandeling, oplosmiddeldispensering en dataverwerkingsworkflows die reproduceerbaarheid garanderen.
- Analytics: Genereert meetbare output, waaronder kaarten van ligand-bindingsgebeurtenissen, verfijningsklare modellen en site-annotaties die vergelijkende analyses onder verschillende condities mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt fragment-hits met preklinische continuïteit door structurele context te bieden voor target-engagement en allostere modulatie.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare structurele screeningscapaciteit die toegankelijk is via peer-reviewed academische en propriety industriële trajecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door directe structurele visualisatie van interacties van zwakke binders, waardoor ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gestroomlijnde protocollen, geautomatiseerde dispensering en gecentraliseerd databeheer via XChem Explorer.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het leveren van structurele hit-bevestiging die de biofysische screenings-triage aanvult.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk gemaakt door structurele gegevens over de plasticiteit van de bindingsplaats en interactie-hotspots.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in kristallografie, het beheer van fragmentbibliotheken en de interpretatie van structurele gegevens.
- Is afhankelijk van toegang tot synchrotron-beamlines, akoestische doseersystemen en geautomatiseerde hulpmiddelen voor het oogsten van kristallen.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor monsterregistratie, naamgeving van gegevens en depositieprotocollen via ISPyB en XChem Explorer.
- Omvat overwegingen voor aanpassing met betrekking tot kristalkwaliteit, oplosmiddelcompatibiliteit en doelspecifieke soak-condities.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van de verkrijgbaarheid van kristallen en de röntgensensitiviteit van bepaalde targets, zoals vermeld in de studie.
