Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur
May 29th, 2021
Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.
Cryo-EM-analyse met één deeltje is een routinetechniek geworden in de gereedschapskist van de structuurbioloog die van toepassing is op een breed scala aan monsters, waaronder membraaneiwitten, amyloïde fibrillen, nucleïnezuurbindende eiwitten en virussen. Zodra de monstervoorbereiding is voltooid en de rasters in de microscoop zijn geladen, kan de gegevensverzameling op afstand worden uitgevoerd in veel cryo-EM-faciliteiten zoals het Astbury Biostructure Laboratory en eBIC. Belangrijke belemmeringen voor een succesvolle structuurbepaling liggen vaak in de monstervoorbereidings- en rasterscreeningfasen met meerdere iteraties die soms nodig zijn door dit proces.
Hier zullen we rasterscreening op afstand en gegevensverzameling met één deeltje demonstreren. In het tabblad auto-loader van de gebruikersinterface van de microscoop, tikt u het optiedialoogvenster uit met behulp van de pijl en drukt u op de inventarisknop. Hiermee wordt achtereenvolgens elke positie in de cassette gecontroleerd om te bepalen of er een cartridge aanwezig is.
De inventaris wordt achtereenvolgens op elke sleuf uitgevoerd. Wanneer alle bezette slots in kaart zijn gebracht, stopt de inventaris. Markeer het raster dat naar de microscoopkolom moet worden overgebracht en klik op laden.
Het slotlabel verandert van blauw naar geel zodra het raster met succes op het podium is geladen. Als u de rasters wilt screenen, opent u de EPU-software. Selecteer op de voorbereidingspagina acquisitieoptiek en -instellingen en selecteer vervolgens de atlasvoorinstelling in het vervolgkeuzemenu.
Kies de juiste voorinstellingen voor het instellen van de bundel en druk op set om de parameters naar de microscoop te duwen. Druk hierop om kolomkleppen te openen en plaats het griepscherm. Controleer of een straal zichtbaar en voldoende verspreid en gecentreerd is om de detector te bedekken.
Navigeer indien nodig naar een dunner gebied van het raster met behulp van de joystick of virtuele handpanelen om podiumbewegingen in X en Y te regelen.Til het griepscherm op en maak een afbeelding met behulp van de voorbeeldknop in EPU. Ga in EPU naar de atlaspagina en druk op nieuwe sessie. Selecteer de MRC-afbeeldingsindeling en voer een geschikte mapnaam en locatie in voor het opslaan van de screeningsessie en klik vervolgens op Toepassen.
Selecteer screening in het menu aan de linkerkant. Vink de selectievakjes naast elk raster aan om een atlasmontage te verkrijgen en start vervolgens de screeningsessie in EPU. Voor elk gecontroleerd raster wordt een atlas verkregen en de beschikbare rastervierkanten worden na voltooiing vermeld.
Elke atlas kan worden bekeken door deze te markeren op de screeningspagina. Als u klaar bent, bekijkt u de verzamelde atlassen en identificeert u de rasters die geschikt zijn voor het beoordelen van de monsterkwaliteit bij hogere vergrotingen. Markeer het gekozen raster in het EPU-screeningsmenu en klik op voorbeeld laden.
Selecteer in het atlasscreeningmenu het raster dat momenteel is geladen en verplaats het werkgebied naar een rastervierkant met de opgevulde gaten door met de rechtermuisknop op de gewenste locatie op de rasterafbeelding te klikken en hier het werkgebied verplaatsen te selecteren. Ga terug naar de EPU-voorbereidingspagina en selecteer de rastervakvoorinstelling. Open de pagina met automatische functies van de EPU en voer auto-eucentrisch uit door fasekanteling met de rastervierkantvoorinstelling om het monster naar eucentrische hoogte te verplaatsen.
Maak in de EPU-voorbereiding een nieuwe raster vierkante voorbeeldafbeelding. Let op de grijswaarden over verschillende gaten die verschillende ijsdiktes aangeven. Verplaats het werkgebied over een gat met de rechtermuisknop en verplaats het werkgebied hierheen.
Selecteer de vooraf ingestelde opening of eucentrische hoogte en klik vervolgens op Voorbeeld. Selecteer de voorinstelling voor gegevensverzameling en stel een vergroting in waarmee de deeltjes eenvoudig kunnen worden geïdentificeerd. Stel de onscherpteverschuiving in op negatief drie tot vijf micrometer.
Herhaal stappen om een reeks ijsdiktes opnieuw te beoordelen voor deeltjesverdeling, oriëntatie en verontreiniging over het raster. Afhankelijk van de beschikbaarheid van de microscoop, gaat u rechtstreeks door naar de gegevensverzameling of kunnen rasters uit de microscoop worden verwijderd voor toekomstige verzameling, ook op andere locaties. Verzamel een atlas als er geen beschikbaar is voor screening door atlasinstellingen in te stellen en raster te selecteren om atlas te verkrijgen.
Verkrijg atlas en klik op rasterlocatie om de uitvoer te zien. Zodra de atlas is voltooid, definieert u elk van de voorinstellingen voor bundelinstellingen op basis van de experimentele behoeften van het project. Voer kalibraties voor beeldverschuivingen uit.
Stel de EPU-sessie in door de sessie-instelling van de EPU-pagina te selecteren en vervolgens een nieuwe sessie of een nieuwe te selecteren in de voorkeuren. Na het selecteren van een nieuwe sessie verschijnt er een pop-up met een optie om eerdere instellingen te gebruiken. De instellingen worden automatisch geladen van de vorige naar de huidige EPU-sessie.
U kunt ook nieuw selecteren in voorkeuren en een bestand met opgeslagen voorkeuren kiezen om deze informatie vooraf in de huidige EPU te laden. Vul de naam van de sessie in met iets informatiefs. Selecteer in tekst handmatig.
Selecteer voor de acquisitiemodus nauwkeurige gatcentrering of snellere acquisitie als aberratievrije beeldverschuivingsverzameling beschikbaar en gewenst is. Selecteer het gewenste afbeeldingsformaat en selecteer vervolgens de opslagmap en EPU maakt een map met de sessienaam. Selecteer het juiste raster op basis van de afstand tussen de rastergaten en druk op toepassen.
Selecteer een eerste rastervierkant en stel een acquisitiesjabloon in. Ga naar vierkante selectie. Als alle vierkanten groen zijn, klikt u linksboven op Alles opheffen.
Open tegels door met de rechtermuisknop te klikken en vervolgens tegel openen te selecteren. Voeg een rastervierkant toe of kies dit door op selecteren te klikken, vervolgens met de rechtermuisknop te klikken en werkgebied naar rastervierkant te verplaatsen. Ga naar hole selection en druk op auto-eucentric.
Wacht totdat een vierkante rasterafbeelding is gemaakt. Als de automatische functie uitvalt, kan dit zijn omdat de hoogte aanzienlijk is uitgeschakeld. Het kan handmatig worden aangepast met behulp van het griepscherm bij raster vierkante vergroting.
Om de grootte van het gat te meten, verplaatst en past u de gele cirkels aan zodat ze over de gaten met de juiste grootte en afstand zijn. Druk op zoek gaten. Controleer of de gaten correct zijn gevonden.
Zo niet, verander dan de grootte van het gat en druk opnieuw op zoekgaten. Als dit proces consequent mislukt, overweeg dan om over te gaan naar een lager getal of een helderdere vlekgrootte bij rastervierkantvergroting. Gebruik het histogram van filterijskwaliteit aan de rechterkant om de selectie van gaten aan te passen.
Dit kan handig zijn om gebieden met dik ijs en dun ijs uit te sluiten. Dit zal worden onthouden voor toekomstige rastervierkanten die tijdens de sessie worden geselecteerd. Optimaliseer de gatselectie met de gereedschappen in het selectiemenu bovenaan.
Klik bijvoorbeeld op gaten dicht bij de rasterbalk verwijderen. Ga naar sjabloondefinitie en druk op acquire. Klik op zoeken en centreer het gat.
Wijzig de vertraging na faseverschuiving en vertraging na beeldverschuivingstijden in één tot vijf seconden, controleer vervolgens of de maximale beeldverschuivingswaarde naar wens is. Klik op acquisitiegebied toevoegen en klik ergens op de afbeelding. Verplaats het acquisitiegebied naar de gewenste locatie.
Voeg het onscherpbereik rechtsboven toe. Een typische onscherptelijst voor een membraaneiwitproject is negatief 0,8 tot negatief drie micrometer onscherpte, voeg vervolgens andere acquisitiegebieden toe en rangschik ze zo dat acquisitiegebieden niet dubbel worden blootgesteld met de bundel. Klik op autofocusgebied toevoegen en klik ergens op de afbeelding.
Verplaats het autofocusgebied naar de koolstof rond een gat. Standaardpraktijk is om automatisch scherp te stellen na centreren bij gebruik van AFIS of om de vijf tot 15 micrometer, afhankelijk van de Z-hoogtevariatie over het vierkant. Klik op Driftmeetgebied toevoegen.
Driftmeting eenmaal per rastervierkant uitgevoerd met een ingestelde drempel van 0,05 nanometer per seconde als standaardinstelling. Het driftmeetgebied kan direct overlappen met het autofocusgebied. Zorg ervoor dat drift- of autofocusgebied niet overlappen met een acquisitiegebied.
Ga terug naar vierkante selectie en selecteer de vierkanten voor acquisitie op het raster. Gebruik het aantal acquisitiegebieden en de verwachte data-acquisitiesnelheid om te voorspellen hoeveel acquisitiegebieden nodig zijn. Wanneer alle gewenste vierkanten zijn geselecteerd, drukt u op alle vierkanten voorbereiden.
Zodra elk vierkant is verzameld, navigeert u tussen de rastervierkanten en stemt u de gaten af met het selectiepenseel. Ga naar een podiumlocatie boven het monster en gebruik automatische functies om de eucentrische hoogte in te stellen. Voer microscoopuitlijningen uit met behulp van microscoopsoftware zoals eerder beschreven en in de tekst.
Voer coma-vrije uitlijning uit binnen de automatische functies voordat u het objectiefopening opnieuw plaatst en centreert en het astigmatisme van de objectieflens corrigeert met EPU. Zorg ervoor dat beide uitlijningen convergeren naar geschikte waarden. Voordat u de geautomatiseerde acquisitierun start, moet u ervoor zorgen dat de turbopomp met automatische lader is uitgeschakeld en dat de objectiefopening indien nodig is geplaatst.
Bij geautomatiseerde acquisitie, druk start run om te beginnen met geautomatiseerde data-acquisitie. Met behulp van dit protocol kunnen gebroken of droge roosters worden gescreend en weggegooid in de atlasfase. Een gradiënt van ijs wordt waargenomen over de meeste rasters.
Tijdens het screenen wordt een ideale deeltjesverdeling monodispersed met een reeks deeltjesoriëntaties zichtbaar. Als ijs te dun is, kan het smelten wanneer het wordt verlicht met de elektronenbundel, waardoor overmatige beweging in micrografie ontstaat. Dit wordt meestal waargenomen wanneer er wasmiddel in de buffer zit.
Het ijs moet glasachtig zijn, dus delen van het raster waar de meerderheid van de beelden kristallijn ijs laat zien, werden uitgesloten. Grafische samenvatting van de gegevens werd opgenomen om de kwaliteit van micrografen te beoordelen en om te beslissen of wijzigingen in de gegevensverzameling nodig zijn. Deeltjeskiezers zoals crYOLO werken voldoende goed voor een eerste doorgang van de gegevens, waardoor progressie naar 2D-klassegemiddelden mogelijk is.
Klassen die secundaire structuurdetails tonen, moeten worden gekozen voor 3D-analyse, terwijl rommeldeeltjes moeten worden weggegooid. Een subset van deeltjes kan worden gebruikt om een eerste model voor 3D-classificatie en verfijning te genereren. In het geval van RagAB bevatte de dataset drie verschillende conformers die tijdens 3D-classificatie kunnen worden gescheiden.
Het is belangrijk om te onthouden dat succes bij de gegevensverzameling en de daaropvolgende beeldanalysestappen afhankelijk is van het verkrijgen en identificeren van goed geoptimaliseerde rasters tijdens de screeningsfase. Zodra een 3D EM-dichtheidskaart is verkregen, kan deze verder worden geïnterpreteerd door een eiwitmodel aan te passen en te verfijnen of een atoommodel de novo te bouwen. Cryo-EM single-particle analyse maakt gestructureerde bepaling van vele doelen mogelijk die voorheen niet mogelijk waren.
Met name zijn deze workflows onlangs gebruikt om structuren van COVID-19-gerelateerde macromoleculen op te lossen.
Overzicht
Dit artikel vat de structuurbepaling van macromoleculaire complexen samen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), waarbij de pijplijn van monstervoorbereiding tot data-acquisitie wordt beschreven. Het benadrukt het belang van rasterscreening en biedt inzichten in de uitdagingen die tijdens het proces worden geconfronteerd.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Structuurbiologie
- Cryo-Elektronenmicroscopie
- Macromoleculaire Complexen
Achtergrond
- Cryo-EM is een routinetechniek geworden voor structuurbiologen.
- Toepasbaar op verschillende specimens, inclusief membraaneiwitten en virussen.
- Monstervoorbereiding en rasterscreening zijn cruciaal voor succesvolle structuurbepaling.
- Externe dataverzameling is mogelijk in veel cryo-EM faciliteiten.
Doel van het Onderzoek
- Om de cryo-EM pijplijn voor structuurbepaling samen te vatten.
- Om begeleiding te bieden bij monstervoorbereiding en rasterscreening.
- Om lezers te leiden naar verdere bronnen voor uitdagende specimens.
Gebruikte Methoden
- Monstervoorbereiding en rasterbelasting in de microscoop.
- Externe rasterscreening met behulp van EPU software.
- Data-acquisitie en verwerking van verzamelde beelden.
- Iteratieve beoordeling van ijsdikte en deeltjesverdeling.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle belasting en screening van rasters werd aangetoond.
- Richtlijnen voor het aanpassen van stralingsinstellingen en het verkrijgen van atlassen werden gegeven.
- Geschikte rasters voor beoordelingen met hogere vergroting werden geïdentificeerd.
- De belangrijkheid van iteratieve processen in de evaluatie van monsterkwaliteit werd geschetst.
Conclusies
- Cryo-EM is een krachtig hulpmiddel voor structuurbiologie.
- Juiste monstervoorbereiding en rasterscreening zijn essentieel voor succes.
- Externe dataverzameling vergroot de toegankelijkheid tot cryo-EM faciliteiten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Cryo-electron microscopy enables high-resolution structural determination of macromolecular targets, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The technique provides predictive confidence by revealing structural details of disease-relevant proteins, including membrane complexes and viral antigens, which are often intractable to other methods. Remote operation capabilities enhance accessibility and throughput in shared structural biology core facilities, accelerating hit-to-lead timelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving 3D structures of target proteins and complexes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target conformation and ligand-binding sites.
- Predictive Value: Facilitates structure-based drug design and lead optimization by providing atomic-level insights into target dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated structural models that serve as references for assay development and screening campaign design.
- Operational Value: Enables standardization of target constructs through structural feedback on expression, purification, and complex formation.
- Scalability: Supports panel screening of target variants or mutants to assess structural integrity and druggability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides structural basis for biomarker alignment by identifying epitopes, allosteric sites, or conformational states relevant to disease.
- Preclinical De-risking: Informs safety assessment by revealing off-target binding mechanisms or structural similarities to human proteins.
- Mechanistic Insight: Clarifies mechanism of action for biologics or small molecules through visualization of bound states.
Pipeline & Workflow Integration
Cryo-EM fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical candidate selection, particularly for structurally challenging targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving structures of native complexes and transient states.
- Screening: Enables assay readiness by providing structural feedback on target quality and stability for downstream screening applications.
- Analytics: Delivers quantitative structural metrics such as resolution, map quality, and ligand occupancy that inform go/no-go decisions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling structure-based prediction of pharmacokinetic and pharmacodynamic properties.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable structural platform across multiple targets and projects within a portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing structural ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized grid screening and data collection protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early failure of structurally unsound targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on structural feasibility and druggability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in structural biology, sample preparation, and cryo-EM data processing.
- Dependent on access to high-end cryo-EM microscopes and stable power, cooling, and vibration isolation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between protein production, purification, and imaging groups for consistent sample quality.
- Involves adaptation across diverse sample types including detergents, lipids, and nucleic acids that affect ice quality and particle distribution.
- Limited by sample quantity, stability, and homogeneity, which directly impact grid screening success and data usability.
