Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Tot op heden is CRISPR slechts in een handvol Hemipterans gebruikt. Het hier geschetste protocol kan onderzoekers helpen crispr en kiembaantransformatie toe te passen in andere hemipteransoorten. Dit protocol is speciaal ontwikkeld voor insectenembryo's die gevoelig zijn voor uitdroging.

Veel stappen in het protocol kunnen mogelijk de resultaten bij andere insectensoorten verbeteren. De mogelijkheid om transgene planthoppers te genereren opent de deur voor nieuwe bestrijdingsmethoden, zoals het creëren van insecten die geen virussen meer kunnen overbrengen. Deze techniek zal revolutionair zijn voor het bestuderen van de genfunctie bij andere plagen, zoals de westelijke bloemtrips.

We hebben deze CRISPR-techniek aangepast voor tripsembryo's met veelbelovende resultaten. We vinden dat oefening in dit systeem essentieel is voor succes. De hier getoonde methoden, wanneer ze routinematig worden uitgevoerd, moeten flexibel gebruik in verschillende omgevingen mogelijk maken.

Om een kamer te maken om de volwassen Peregrinus maidis-insecten vast te houden, snijdt u een gat in de bodem van een beker van een ons en lijmt u een scherm over het gat voor luchtuitwisseling. Voor de selectie van een week oude volwassen vrouwelijke insecten, zuig de kolonie gedurende een uur in een conische buis van 15 milliliter, voordat u de insecten kort op ijs koelt. Identificeer de vrouwtjes door de aanwezigheid van de legboor, die meestal donkerder is dan de rest van de buik, aan de ventrale kant van de buik.

Breng de vrouwtjes over in de beker terwijl ze worden verzameld. Wanneer 15 vrouwtjes zijn geselecteerd, sluit u de beker af met een stuk paraffinewasfilm van vijf bij vijf centimeter. Breng 400 microliter van een 10% sucrose-oplossing aan op de bovenkant van de film en plaats een tweede stuk film van vijf bij vijf centimeter over de oplossing.

Plaats de volwassen kamer op een eieropvangschaal met de plastic paraffinewasfilmzijde in direct contact met het ovipositiemedium en wikkel de hele eierlegkamer met plasticfolie zonder de luchtgaten te bedekken. Plaats vervolgens de kamer op 25 graden Celsius met 70% luchtvochtigheid en 14 uur licht, 10 uur donkere cyclus. Voor het verzamelen van embryo's, na de gewenste legperiode van eieren, brengt u een strook dubbelzijdige tape van één bij 15 millimeter aan op een afdekplaat van 22 bij 30 millimeter en plaatst u de afdekplaat op het ovipositiemedium van de eierlegkamer.

Verplaats met behulp van een fijne borstel en een ontleedmicroscoop individuele semi-transparante embryo's van het agaroppervlak naar de dubbelzijdige tape. Wanneer ongeveer 25 embryo's zijn geselecteerd, rangschik je de banaanvormige embryo's op hun zijkanten met de grotere uiteinden op de tape geplakt. Voor micro-injectie van de embryo's, plaats eerst de dekselslip op een petrischaal van 100 bij 15 milliliter spoeling met 1% agar onder een ontleedmicroscoop in een bevochtigde kap.

Om de injectiedruk te controleren, plaatst u de punt van een kwartsinjectienaald in een druppel water en start u de injectiecyclus. Nadat u de drukinstelling hebt bevestigd en vanaf de linkerkant van de afdekslip nadert, steekt u de naald in het grotere uiteinde van één embryo. Breng de injectie-oplossing in het ei en trek de naald er snel uit.

Wanneer alle eieren zijn geïnjecteerd, plaatst u de dekselslip op het oppervlak van een nieuwe 1% agarschaal en plaatst u de schaal in een vochtigheidskamer. Gebruik na zes dagen schoon water en een fijne borstel om eventuele overlevende embryo's over te brengen naar een petrischaal van 35 bij 10 millimeter met met water bevochtigd filterpapier. Sluit de petrischaal af met plastic paraffinewasfilm en plaats de broedkamer in een broedmachine van 25 graden Celsius.

Gebruik na zes tot acht dagen een fijne borstel om eventuele opkomende eerste instar nimfen over te brengen naar een petrischaal met bladknipsels en sluit de schaal af met plastic paraffinewasfilm. Gebruik na 48 uur bij 25 graden Celsius een fijne borstel om alle twee dagen oude nimfen over te brengen naar een opfokkooi met maïsplanten. Als injectees met zichtbaar fenotype in voldoende aantallen worden teruggevonden, kooi deze insecten dan afzonderlijk om het herstel van de doeleigenschap in de volgende generatie te maximaliseren.

Kweek de insecten onder de juiste temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden met regelmatige overdrachten naar verse maïsplanten indien nodig, en screen het nageslacht regelmatig op verwachte fenotypen, waarbij individuen die het gewenste fenotype vertonen in hun eigen kooien worden geplaatst om homozygote lijnen vast te stellen. In deze representatieve analyse werden in totaal 6.483 eieren verzameld van in totaal 645 vrouwtjes in vier weken. Vrouwtjes beginnen meestal na twee dagen met het leggen van eieren en leveren de meeste eieren van dag vier tot zes, waarbij de ovipositieactiviteit op dag negen vertraagt.

Cas9 negen injectie heeft geen invloed op de ontwikkeling van P.maidis, omdat de ontwikkelingssnelheden voor embryo's behandeld met injectiebuffer, injectiebuffer aangevuld met Cas9 en injectiebuffer aangevuld met Cas9 en drie gids-RNA's, vergelijkbaar zijn. De hatch rates voor de buffer en Cas9 controls zijn ook vergelijkbaar. De broedsnelheden van individuen die de driegeleidersmix ontvangen, zijn echter meestal relatief lager.

In dit representatieve experiment, van de 71 gids-geïnjecteerde individuen die zich ontwikkelden, vertoonden 23 een zekere mate van pigmentverlies en negen kwamen uit, wat resulteerde in een knock-outpercentage van ongeveer 30% De driegeleidermix zal naar verwachting ongeveer 180 basenparen uit de witte locus verwijderen, zoals waargenomen in de PCR-producten die zijn versterkt uit genomisch DNA geïsoleerd van geïnjecteerde individuen, evenals in de bijbehorende volgorde gegevens die uit die producten worden gegenereerd. We raden het gebruik van afgeschuinde naalden aan om injectietrauma te minimaliseren. Als de embryo's lijken te lekken na injectie, onderzoek dan uw naaldpunten voor betere resultaten.

Voortdurende oefening zal de overleving van embryo's verhogen. Tot op heden zijn er geen publicaties die kiembaantransformatie in Hemipterans beschrijven. We hebben dit protocol echter gebruikt om Cas9-expressing planthoppers te maken.

Over het algemeen opent het vermogen om kiembaantransformatie uit te voeren in Hemipterans de deur naar een breed scala aan genetische plaagbestrijdingsstrategieën, waardoor het gebruik van insecticiden wordt verminderd.