Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen
10 mei 2021
Dit artikel beschrijft de isolatie van muis aortaklepcellen door een twee-stap collagenase procedure. Geïsoleerde muisklepcellen zijn belangrijk voor het uitvoeren van verschillende assays, zoals deze in vitro verkalkingstest, en voor het onderzoeken van de moleculaire paden die leiden tot aortaklepmineralisatie.
Het gebruik van geïsoleerde muizenklepcellen is essentieel om de signaleringsroute te onderzoeken die leidt tot klepverkalking bij het gebruik van genetisch gemodificeerde cellen van transgene muizen. De tweestapsvertering is een snelle en efficiënte methode. Het meest uitdagende deel van dit protocol is de isolatie van de aortaklep van muizen van acht weken.
Het is beter om op oudere muizen te oefenen om de aortaklep beter te visualiseren. Voordat u met het experiment begint, reinigt en steriliseert u alle chirurgische instrumenten en werkruimte met 70% ethanol en autoclaaf de chirurgische instrumenten gedurende 30 minuten. Wanneer de eerste installatie klaar is, begint u met het reinigen van de borst en het buikgebied van een acht weken oude geëuthanaseerde muis met ethanol.
Open met een schaar de buik en de borst van de muis en snijd vervolgens met een kleine chirurgische schaar tussen het linkeratrium en de linkerventrikel. Verwijder bloed uit het hart door 10 milliliter koude PBS te doorsnijden en snijd het hart door, waarbij drie millimeter van de oplopende aorta behouden blijft. Ontleed onder een stereomicroscoop de aortaklep door het hart horizontaal in het midden van de ventrikels te snijden en de linkerventrikel naar de aorta te snijden en vervolgens de aortaklep voorzichtig te ontleden.
Pool de kleppen samen in een kleine 35 millimeter weefselkweekschaal. Was de geïsoleerde kleppen in een celkweekschaal van 75 milliliter met vijf milliliter vers bereide 10 millimol koude HEPES aangevuld met antibiotica en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in vijf milliliter collagenase type 1 met continu schudden. Centrifugeer na incubatie de buis gedurende vijf minuten, op 150 keer G en was de pellet eenmaal met twee milliliter hepes van 10 millimolar met vortexing op hoge snelheid gedurende 30 seconden.
Verzamel de resulterende suspensie van de buis in een kweekschaal van 35 millimeter en gebruik een dun pincet om de weefselfragmenten voorzichtig in een verse buis over te brengen. Incubeer vervolgens de pellet in een buis van 15 milliliter met vijf milliliter collagenase type één bij 37 graden Celsius onder continue agitatie gedurende 35 minuten. Scheid de cellen door te resuspenderen met een pipet van één milliliter en centrifugeer bij 150 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Reinig de cellen tweemaal door de gescheiden pellet opnieuw te gebruiken in twee milliliter volledige DMEM en gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius bij 150 maal G te centrifugeren. Voor het plateren, resuspend de pellet in een milliliter van volledig medium en voeg het toe aan een put van een zes goed cel kweekschaal in een minimale hoeveelheid medium. Houd de platen ongestoord bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.
Bevestig na drie dagen incubatie de groei dicht bij het weefselafval door de cellen onder de microscoop te observeren. Zodra 1.000 cellen zichtbaar zijn, verwijdert u voorzichtig het weefselresten met een autoclaaf-pincet en verandert u het medium. Probeer de cellen na het bereiken van 70% samenvloeiing en breng ze over naar een 75 milliliter weefselkweekschaal.
Reinig de bioveiligheidskap voordat u met de test begint met 70% ethanol en verwarm het DMEM-medium tot 37 graden Celsius. Vervolgens zaaien 100.000 cellen per conditie in zes putplaten in volledige DMEM en cultuur bij 37 graden Celsius. Vervang na 24 uur het supernatant medium door het verkalkingsmedium en incubeer de cellen gedurende zeven dagen bij 37 graden Celsius, waarbij het medium op de derde dag wordt vervangen.
Meet na zeven dagen de calciumconcentratie in een putplaat van 96 put met behulp van het Arsenazo III-reagens en registreer de absorptie op 650 nanometer. In de representatieve analyse werden verschillende klepcelfenotypes geïdentificeerd met immunofluorescente kleuring na drie tot vijf dagen kweek. Mouse VIC's uitgedrukt vimentine en alpha SMA, de significante markers van klepcellen.
Bovendien verifieerde CD31 immunofluorescente kleuring geen besmetting van endotheelcellen in VIC-cultuur. Het cultiveren van VIC's met fosfaatrijk verkalkingsmedium stimuleert een verkalking in cellen, verder bevestigd met de rode positieve kleuring voor calciumknopen. Het protocol is gebaseerd op een pool van drie tot vijf kleppen van verschillende muizen.
Het gebruik van nestmat en drie verschillende biologische replica's is belangrijk om de bevindingen te valideren. Het gebruik van muizenklepcellen is van vitaal belang om de moleculaire route te begrijpen die leidt tot aortastenose door cellen te isoleren van transgene muizen. Dit protocol is eerder gebruikt om de implicatie van de weg naar receptor in minerale regressie van verkalkte aortaklep te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een twee-stappen collagenase procedure voor het isoleren van muis aortaklepcellen, essentieel voor het bestuderen van moleculaire paden betrokken bij aortaklepcalcificatie. De isolatiemethode maakt daaropvolgende assays mogelijk om klepmineralisatie te evalueren.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Signaalroutes
- Aortaklepcalcificatie
Achtergrond
- De betekenis van geïsoleerde klepcellen bij het begrijpen van calcificatiemechanismen.
- De uitdagingen geassocieerd met het isoleren van aortakleppen van acht weken oude muizen.
- De belangrijkheid van transgene muismodellen bij het onthullen van moleculaire paden.
Gebruikte methoden
- Twee-stappen collagenase spijsvertering voor celisolatie.
- Muismodel, specifiek aortakleppen van transgene muizen.
- In vitro assays, inclusief calciumconcentratiemeting met Arsenazo III reagens.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en cultivatie van klepcellen.
- Identificatie van klepcelfenotypes via immunofluorescente kleuring.
- Validatie van bevindingen door middel van meerdere biologische replica's.
Conclusies
- Deze studie presenteert een efficiënte methode voor het isoleren van aortaklepcellen, die het begrip van moleculaire mechanismen in aortastenose verbetert.
- De bevindingen dragen bij aan breder biologisch onderzoek naar hartklepcalcificatie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of mouse valve interstitial cells (VICs) enables mechanistic interrogation of aortic valve calcification, a key driver of aortic stenosis. This workflow supports early discovery and target validation by providing a disease-relevant in vitro system for pathway analysis and pharmacological testing. The method enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by isolating VICs for pathway interrogation in calcification.
- Supports functional target validation using genetically modified mouse models.
- Facilitates hypothesis-driven testing of molecular drivers and inhibitors of mineralization.
- Provides a platform for evaluating new pharmacological targets in a controlled system.
Screening & Assay Development
- Delivers validated primary cell cultures for reproducible in vitro calcification assays.
- Standardizes cell phenotype confirmation via immunofluorescence for assay reliability.
- Enables quantitative measurement of calcification using calcium reagent and alizarin red staining.
- Prepares scalable systems for compound screening and comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mechanisms observed in aortic stenosis.
- Supports continuity from genetic models to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Provides a platform for biomarker discovery and mechanistic studies in valve pathology.
- Reduces translational risk by modeling human disease processes in primary mouse cells.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in cardiovascular research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in valve calcification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of calcification across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights to in vivo disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse genetic backgrounds and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and assay protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early-stage cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and compounds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and primary cell culture techniques.
- Needs access to sterile surgical instruments, biosafety hoods, and analytical reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell isolation and phenotype validation.
- Adaptable to various transgenic mouse models for pathway-specific studies.
- Dependent on careful dissection and pooling of valves to ensure sufficient cell yield and reproducibility.
