Name: Bereiding van ratskeletspieren homogenaten voor nitraat- en nitrietmetingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer hoe je ratten skeletspierhomogenaten bereidt voor nauwkeurige nitraat- en nitrietmetingen. Dit protocol vergelijkt drie homogenisatiemethoden en behoudt deze belangrijke stikstofmonoxide-metabolieten betrouwbaar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door intramurale NIH/NIDDK subsidie ZIA DK 0251041-14 aan Alan N Schechter, MD.

Het dierprotocol is goedgekeurd door NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Dieren werden behandeld en behandeld volgens de huidige gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die vrij beschikbaar is op de AAALAC-website.
1. Rattenskeletspier collectie
<ol><li>Terwijl een rat onder diepe anesthesie is (5% isofluraan, bevestigd door afwezige reactie op staart/ beenknijpen), begint u perfusie met zoutoplossing met heparine door een naald van 19 G in een top van de linker ventrikel te plaatsen en een inkeping te maken op het rechter atrium. Laat zoutoplossing met heparine door de inwendige organen trekken totdat er minstens 1,5 liter/kg door het weefsel is gestroomd. Op dit punt zijn dieren dood door exsanguinatie en zijn karkassen klaar om te worden verwerkt voor monsterverzameling. OPMERKING: Het bereiken van een goede perfusie is van cruciaal belang, vooral voor nauwkeurige metingen van nitriet, omdat nitriet wordt geoxideerd tot nitraat door een achterblijvend hemoglobine.</li>
	<li>Identificeer doelspierweefsels en snijd ze uit de achterpoten22 met behulp van schone chirurgische instrumenten. Verwijder zoveel mogelijk vet en bindweefsel uit de spierweefsels.</li>
	<li>Plaats de gewenste hoeveelheid spieren in een microcentrifugebuis en plaats deze vervolgens op droogijs. Bewaar de met tissue gevulde buisjes in de vriezer van -80 °C. OPMERKING: In het geval van menselijke biopsiemonsters, dep ze onmiddellijk na het verzamelen grondig met schoon gaas om overtollig bloed te verwijderen.</li>
</ol>2. Voorbereiding voor homogenisatie
<ol><li>Bereiding van nitrietconserverende oplossing (stopoplossing)<ol><li>Bereid een heldergele oplossing met 890 mM kaliumfercyanide (K3Fe(CN)6) en 118 mM NEM (N-ethylmaleimide) in gedestilleerd water, zodat er geen kristallen zijn. Voeg niet-ionische oppervlakteactieve stof (detergent) toe in een verhouding van 1:9 (v/v, materiaaltafel) en meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen.</li>
		<li>Verdun de stopoplossing in een verhouding van 1:9 met gedestilleerd water. Plaats de verdunde stopoplossing (1:5 verhouding spierweefsel tot verdunde stopoplossing) in de homogenisatiebuis. OPMERKING: Twintig milligram weefsel vereist 100 μL stopoplossing en 200 mg weefsel vereist 1000 μL stopoplossing in de buis. De aanwezigheid van wasmiddel in de toegevoegde oplossing is van cruciaal belang voor verstoring van celmembranen. Elk niet-ionisch wasmiddel kan worden gebruikt, maar er moet voor worden gezorgd dat het niet interfereert met de chemiluminescentiemethode.</li>
	</ol></li>
	<li>Weefselvoorbereiding<ol><li>Haal het doekje uit de -80 °C vriezer en ontdooi langzaam in ijs. Verwijder het resterende vet en bindweefsel uit de skeletspieren. Snijd stukjes skeletspieren af en dep op gaas om te drogen.</li>
		<li>Weeg de hoeveelheid weefsel af (20, 50 en 200 mg). Plaats de voorgewogen skeletspieren in de stopoplossing in de homogenisatiebuizen of plaats het voorgewogen weefsel in een schone microcentrifugebuis voor later gebruik.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Homogenisatie
<ol><li>Roterende homogenisator (figuur 1)<ol><li>Plaats de M-type buis met de voorgewogen skeletspieren en de vooraf afgemeten stopoplossing in de machine. Homogeniseer elk monster tweemaal (zet op de meest destructieve homogenisatiecyclus) en plaats de buis onmiddellijk na elke homogenisatie gedurende 5 minuten op ijs om af te koelen.</li>
		<li>Centrifugeer kort bij 2.000 × g en 4 °C gedurende 5 minuten. Plaats de volle buis terug op ijs en voeg het juiste volume methanol toe (≥ 99,9 %, 10x van het gewicht van het weefsel). Vortex grondig voor 15 s. OPMERKING: Gebruik voor 20 mg weefsel 200 μL methanol. Methanol wordt gebruikt om eiwitten uit weefselhomogenaat neer te slaan en interfereert niet met de chemiluminescentiemethode. Als een andere eiwitprecipitatiemethode wordt gebruikt, test dan de compatibiliteit met chemiluminescentie.</li>
		<li>Homogeniseer nogmaals en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer de monsters gedurende 35 minuten bij 4 °C en 3.500 × g. Aspirateer het supernatant en meet nitriet/nitraat niveaus, of bewaar bij -80 °C voor later gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Kraalhomogenisator (figuur 2)<ol><li>Plaats het skeletspierweefsel in een kraalbevattende buis (verhouding 1:5 voor weefsel:verdunde stopoplossing) en homogeniseer tweemaal gedurende 45 s met de hoogste snelheid die beschikbaar is op het gebruikte instrument. Plaats de buis onmiddellijk na elke homogenisatie gedurende 5 minuten op ijs om af te koelen.</li>
		<li>Kortcentrifugeren met behulp van een kleine desktopcentrifuge (2.000 x g) gedurende 5 seconden. Plaats de buis terug op ijs en voeg een geschikt volume methanol toe (zuiverheid ≥ 99,9 %, 10x van het gewicht van het weefsel). Vortex grondig voor 15 s. OPMERKING 1: Gebruik voor 20 mg weefsel 200 μL methanol. OPMERKING 2: Methanol wordt gebruikt om eiwitten uit weefselhomogenaat neer te slaan en interfereert niet met de chemiluminescentiemethode. Als een andere eiwitprecipitatiemethode wordt gebruikt, test dan de compatibiliteit met chemiluminescentie.</li>
		<li>Homogeniseer nogmaals gedurende 45 s met de hoogste snelheid die beschikbaar is op het gebruikte instrument. Broed op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer bij 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirateer het supernatant en meet nitriet/nitraat niveaus, of bewaar bij -80 °C voor later gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Vergruizer (figuur 3)<ol><li>Bereid buisjes met verdunde stopoplossing (5x weefselgewicht) en weeg ze. Noteer het gewicht (buis + stopoplossing).</li>
		<li>Plaats het gereedschap voor de verpulverizer met vloeibare stikstof op droogijs en wacht ongeveer 30 minuten totdat het de gewenste temperatuur heeft bereikt.</li>
		<li>Breng met behulp van een pincet gekoeld in vloeibare stikstof één monster (weefselgewicht al gemeten) over naar de vergruizer. Voeg een kleine lepel vloeibare stikstof toe om ervoor te zorgen dat het weefsel op vloeibare stikstoftemperatuur is.</li>
		<li>Nadat 95% van de vloeibare stikstof is verdampt, plaatst u het breekgereedschap op het weefsel en drukt u stevig aan. Je zou het monster moeten voelen verpletteren. Gebruik de hamer en sla het breekgereedschap 3-5x.</li>
		<li>Controleer het monster op eventuele resterende brokken met een lepel gekoeld in vloeibare stikstof. Gebruik na het afkoelen in vloeibare stikstof een stuk tissuepapier om bevroren water weg te vegen voordat u het weefsel aanraakt. Als er een stuk aanwezig is, verplaats het dan naar het midden en sla dan nog 5-6 keer met de hamer.</li>
		<li>Wanneer het hele monster is verpulverd, gebruikt u de vloeibare stikstofgekoelde lepel om het gemalen weefsel rechtstreeks over te brengen in de vooraf gewogen buis met de verdunde stopoplossing (stap 3.3.1). Zorg ervoor dat u deze stap snel uitvoert, want wanneer de geplette skeletspier opwarmt, wordt deze plakkerig en moeilijk over te dragen.</li>
		<li>Vortex voor 15 s. Controleer of er geen weefsel aan de bovenkant van de buis vastzit door de buis te openen. Als dat het geval is, probeer het dan los te maken en vortex opnieuw.</li>
		<li>Centrifugeer het monster gedurende 2-3 s met behulp van een kleine desktopcentrifuge. Weeg de buis opnieuw. Bereken het weefselgewicht door het oorspronkelijke buisgewicht (stap 3.3.1) van dit nieuwe gewicht af te trekken. Plaats de tube op ijs. OPMERKING: De exacte gewichten helpen bij het bepalen van het exacte weefselgewicht en hoeveel weefsel verloren is gegaan tijdens verpulvering.</li>
		<li>Zodra alle monsters tot stap 3.3.8 zijn verwerkt, voegt u een geschikt volume methanol toe (≥ 99,9 %, 10x van het weefselgewicht). Vortex grondig gedurende 15 s en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. OPMERKING: Gebruik voor 20 mg weefsel 200 μL methanol. Methanol wordt gebruikt om eiwitten uit weefselhomogenaat neer te slaan en interfereert niet met de chemiluminescentiemethode. Als een andere eiwitprecipitatiemethode wordt gebruikt, test dan de compatibiliteit met chemiluminescentie.</li>
		<li>Centrifugeer bij 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirateer het supernatant en meet nitriet/nitraat niveaus, of bewaar bij -80 °C voor later gebruik.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nitriet/nitraatmeting met stikstofmonoxideanalysator (NOA)
<ol><li>Bereid alle monsters voor met een van de drie verschillende homogenisatiemethoden die hierboven zijn beschreven en injecteer ze in een NOA voor nitraat- en nitrietmeting. OPMERKING: Gedetailleerde protocollen voor NOA-gebruik werden eerder gepubliceerd19.</li>
</ol>

<ol><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system%3A+a+historical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).</li>
<li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-arginine-nitric+oxide+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li>
<li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li>
<li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li>
<li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomach+NO+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502(1994).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans%3A+measurements+in+expelled+air%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li>
<li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li>
<li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans%3A+role+for+nitrite-derived+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li>
<li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).</li>
<li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li>
<li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+nitrate+store%3A+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li>
<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Nitrite+and+Nitrate%2C+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway%2C+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).</li>
<li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li>
<li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li>
<li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li>
<li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA%28y%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben. Alan N. Schechter staat vermeld als mede-uitvinder van verschillende patenten die zijn uitgegeven aan de National Institutes of Health voor het gebruik van nitrietzouten voor de behandeling van hart- en vaatziekten. Hij ontvangt royalty's op basis van NIH-licenties van deze patenten voor klinische ontwikkeling, maar geen andere compensatie. Deze afspraken hebben geen invloed op zijn naleving van het jove-journaalbeleid.

Om veranderingen in de NO-metabolieten, nitraat en nitriet te volgen, als functie van fysiologische interventies, is het noodzakelijk om de niveaus van deze ionen in de verschillende organen te meten die cruciaal zijn in hun metabolisme. Omdat hemoglobine in het bloed zal reageren met NO en zijn metabolieten, is het ook belangrijk om bloed zo snel mogelijk uit weefselmonsters te verwijderen. Zo werden dieren doordrenkt met zoutoplossing voordat ze skeletspierweefsels verzamelden (gluteus, TA, EDL, gastrocnemiusspier) en ...

Stikstofmonoxide (NO), een klein gasvormig signaalmolecuul, speelt een cruciale rol in fysiologische en pathofysiologische processen1. NO kan worden geproduceerd uit L-arginine door endogene enzymen van de stikstofmonoxidesynthase (NOS) familie alvorens een snelle oxidatie tot nitraat (NO3-) en eventueel nitriet (NO2-) in bloed en weefselste ondergaan 2,3. Onlangs is aangetoond dat deze anionen weer zijn teruggebracht tot NO in zoogdiersystemen4. Nitraat wordt omgezet in nitriet, voornamelijk door commensale bacteriële nitraatreductasen in de mondholte die inwerken op ionen die door de speekselklieren worden uitgescheiden en direct worden ingenomen 5, en tot op zekere hoogte door zoogdierenzymen zoals xanthineoxidoreductase 6,7. Nitriet kan verder worden gereduceerd tot NO door verschillende mechanismen, waaronder deoxyhemoglobine8, deoxymyoglobine9, molybdeenbevattende enzymen10 en niet-enzymatische reductie in de aanwezigheid van protonen11,12.
Deze nitraat-nitriet-NO-route wordt versterkt onder hypoxische omstandigheden waarin de NOS-activiteit wordt verminderd omdat NOS zuurstof nodig heeft voor NO-generatie4. Veel recente studies hebben gunstige effecten van voedingsnitraat op bloeddrukregulatie en trainingsprestaties gemeld, wat suggereert dat nitraatreductieroutes bijdragen aan de toename van NO-signalering 13,14,15. Eerdere studies hebben aangetoond dat sommige skeletspieren waarschijnlijk de belangrijkste nitraatopslagplaatsen in het lichaam zijn16. In vergelijking met bloed of andere inwendige organen zoals lever, bevat de skeletspieren (gluteus maximus) significant hogere niveaus van nitraat en hebben ze een aanzienlijke massa in het lichaam van zoogdieren. Loopbandoefeningen bleken de nitraatreductie tot nitriet en tot NO in gluteus te verbeteren in een ratmodel7. Deze resultaten impliceren dat sommige skeletspieren belangrijke bronnen voor NO kunnen zijn via nitraatreductieroutes in fysiologische situaties. Meer recente studies suggereren dat deze bevindingen, inclusief veranderingen in spiernitraatniveaus tijdens inspanning, ook voorkomen bij mensen17.
Twee van de huidige auteurs hadden eerder een methode vastgesteld om het nitraat- en nitrietgehalte in bloed en andere vloeibare monsters te meten18. Toen de niveaus van deze anionen in weefselhomogenaten echter aanvankelijk werden geanalyseerd, waren er geen gedetailleerde protocollen beschikbaar. Om de nitraat-nitriet-NO-dynamiek in verschillende organen te begrijpen, was ons doel om een nauwkeurige en efficiënte methode te ontwikkelen om nitraat- en nitrietniveaus in zoogdierweefsels, waaronder skeletspieren, te meten. In eerdere studies werden knaagdierweefsels gebruikt om betrouwbare homogenisatieprocessen te ontwikkelen en vervolgens het nitraat- en nitrietgehalte in die homogenatente analyseren 7,16,19. Het gebruik van deze homogenisatiemethode werd uitgebreid tot menselijke skeletspierbiopsiemonsters, waarbij de waarden werden bevestigd, en belangrijker nog, de waargenomen waarden voor spieren in vergelijking met bloed / plasma waren in vergelijkbare bereiken en verhoudingen als die waargenomen bij knaagdieren17. In de afgelopen jaren zijn andere groepen ook begonnen met het meten van nitraat- en nitrietniveaus in skeletspierhomogenaten, waarbij vergelijkbare waarden werden gerapporteerd als die gerapporteerd door onze groep20,21.
Het doel van dit protocolartikel is om in detail de bereiding van skeletspierhomogenaten te beschrijven met behulp van drie verschillende homogenisatiemethoden voor latere metingen van nitraat- en nitrietniveaus. Bovendien werden de effecten van weefselgewicht dat wordt gebruikt voor homogenisatie op waarden van nitraat en nitriet in skeletspiermonsters onderzocht. Wij geloven dat deze methoden gemakkelijk kunnen worden toegepast op andere soorten weefsels van zoogdieren. Recent, vooral op het gebied van inspanningsfysiologie, was aandacht besteed aan de mogelijke verschillen in nitraat/nitriet/NO-fysiologie volgens spiergroepen. We rapporteren ook de hoeveelheden nitraat en nitriet in vier verschillende knaagdierspieren en vinden een niet-uniforme verdeling van beide ionen over deze verschillende spieren; een constatering die nader onderzoek vereist.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS M tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td>Lengte: 87 mm; Diameter: 30 mm</td></tr><tr><td>Heparine Natrium</td><td>Hospira</td><td>NDC-0409-7620-13</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>646377</td><td></td></tr><tr><td>Minilys bead homogenisator</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-ethylmaleïmide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>Stiikstofmonoxide analyzer</td><td>GE</td><td>Sievers NOA 280i</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonylfenylpolyethyleenglycol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanide; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Precellys lyseringskit</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td>bevat 2 mL buisjes met 2,8 mm keramische (zirconiumoxide) kralen voor homogenisatie</td></tr><tr><td>Pulveriseerkit</td><td>Cellcrusher</td><td>Cellcrusher kit</td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding van ratskeletspieren homogenaten voor nitraat- en nitrietmetingen

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitraationen (NO3-) werden ooit beschouwd als inerte eindproducten van stikstofmonoxide (NO) metabolisme. Eerdere studies toonden echter aan dat nitraationen bij zoogdieren kunnen worden omgezet in NO via een reductiemechanisme in twee stappen: nitraat wordt gereduceerd tot nitriet (NO2-), meestal door orale commensale bacteriën, waarna nitriet wordt gereduceerd tot NO door verschillende mechanismen, waaronder via heem- of molybdeenbevattende eiwitten. Deze reductieve nitraatroute draagt bij aan het verbeteren van NO-gemedieerde signaalroutes, met name in het cardiovasculaire systeem en tijdens spieroefeningen. De niveaus van nitraat in het lichaam vóór een dergelijk gebruik worden bepaald door twee verschillende bronnen: endogene NO-oxidatie en voedingsnitraatinname, voornamelijk van planten. Om de complexe NO-cyclus in fysiologische omstandigheden op te helderen, hebben we de dynamiek van zijn metabolieten, nitraat- en nitritionen, die relatief stabiel zijn in vergelijking met NO, verder onderzocht. In eerdere studies werd skeletspieren geïdentificeerd als een belangrijk opslagorgaan voor nitraationen bij zoogdieren, evenals een directe bron van NO tijdens inspanning. Daarom is het belangrijk om een betrouwbare methodologie vast te stellen voor het meten van nitraat- en nitrietniveaus in skeletspieren en zou het nuttig moeten zijn om de toepassing ervan uit te breiden naar andere weefselmonsters. Dit artikel legt in detail de voorbereiding van skeletspiermonsters uit, met behulp van drie verschillende homogenisatiemethoden, voor nitraat- en nitrietmetingen en bespreekt belangrijke kwesties met betrekking tot homogenisatieprocessen, waaronder de grootte van de monsters. Nitraat- en nitrietconcentraties zijn ook vergeleken in vier verschillende spiergroepen.

Om representatieve resultaten te verkrijgen, werden skeletspierweefsels van 8 Wistar-ratten (mannetjes en vrouwtjes, gewicht 250 ± 50 g) gebruikt. Rat skeletspieren homogenaten (50 mg gluteus maximus spier voor elke methode) werden bereid door drie verschillende homogenisatie-instrumenten (roterende homogenisator, kraalhomogenisator en vergruizer). Het nitraat- en nitrietgehalte van deze homogenaten werd vervolgens bepaald met behulp van een stikstofmonoxideanalysator (NOA) (figuur 4). De ni...

We presenteren protocollen voor drie verschillende methoden voor de homogenisatie van vier verschillende spiergroepen van rattenskeletspierweefsel om de niveaus van nitraat en nitriet te meten en te vergelijken. Verder vergelijken we verschillende monstergewichten om te onderzoeken of de grootte van het weefselmonster de resultaten van homogenisatie beïnvloedt.

Bereiding van ratskeletspieren homogenaten voor nitraat- en nitrietmetingen

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Skeletspieren dienen als een belangrijk reservoir van nitraat dat, na de omzetting in nitriet, dient als een bron van NO tijdens het sporten. Hier presenteren we methodologie om deze ionen in spieren en andere weefsels te meten. Bereid om te beginnen de nitraatconserverende of stopoplossing door 890 millimolair kaliumfercyanide en 118 millimolair n-methylmaleimide in gedestilleerd water te combineren, ervoor te zorgen dat er geen kristallen in oplossing achterblijven, voeg vervolgens een niet-ionische oppervlakteactieve stof toe in een verhouding van 1 op 9 en meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen.Verdun de stopoplossing in een verhouding van 1 op 9 met gedestilleerd water en voeg de verdunde stopoplossing toe aan de homogenisatiebuis. Ontdooi vervolgens het vorige geïsoleerde en bevroren rattenspierweefsel op ijs. Zodra het weefsel is ontdooid, verwijdert u het resterende vet en bindweefsel uit de skeletspieren.Snijd stukjes van de skeletspieren af en dep ze op een gaasje om te drogen. Weeg de juiste hoeveelheid skeletspierweefsel af en plaats vervolgens het pre-gewichtsweefsel in de homogenisatiebuizen met de stopoplossing. Voor homogenisatie in een roterende homogenisator plaatst u de M-type buis met de vooraf gewogen skeletspieren en de vooraf gemeten stopoplossing in de machine.Homogeniseer elk monster tweemaal en plaats na elke homogenisatie de buis onmiddellijk gedurende 5 minuten op ijs om af te koelen. Na homogenisatie, centrifugeer de buis kort. Plaats de buis terug op ijs en voeg het juiste volume methanol toe voordat u gedurende 15 seconden vortext.Homogeniseer het monster opnieuw en incubeer het gedurende 30 minuten op ijs, centrifugeer vervolgens het monster, adem het supernatant op en ga verder met het meten van het nitriet- en nitraatgehalte. Voor kraalhomogenisatie plaatst u het skeletspierweefsel in een kraalbevattende buis en homogeniseert u tweemaal gedurende 45 seconden met de hoogste snelheid die beschikbaar is op het instrument. Plaats na elke homogenisatie de buis onmiddellijk gedurende 5 minuten op ijs om af te koelen, centrifugeer vervolgens de buis, plaats de buis terug op ijs en voeg het juiste volume methanol toe voordat u gedurende 15 seconden vortext.Homogeniseer het monster opnieuw gedurende 45 seconden en incubeer het vervolgens gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer het monster, zuig het supernatant aan en ga verder met het meten van het nitriet- en nitraatgehalte. Voor homogenisatie op basis van verpulverizer bereidt u buizen voor die de verdunde stopoplossing bevatten en weegt u vervolgens het gewicht van de buizen en registreert u het.Na het koelen van het verpulverizergereedschap op droogijs gedurende 30 minuten, met behulp van een pincet gekoeld in vloeibare stikstof, brengt u het vooraf gewogen weefselmonster over naar de vergruizer en voegt u vervolgens een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof toe om ervoor te zorgen dat het weefsel op vloeibare stikstoftemperatuur is. Nadat 95% van de vloeibare stikstof is verdampt, plaatst u het breekgereedschap op het weefsel en drukt u stevig om het monster te voelen verpletteren, en vervolgens met behulp van een hamer, sla het breekgereedschap 3 tot 5 keer. Wanneer het hele monster is verpulverd, breng je met behulp van een vloeibare stikstofgekoelde lepel en pincet het gemalen weefsel rechtstreeks over in de vooraf gewogen buis met de verdunde stopoplossing.Vortex vervolgens de buis gedurende 15 seconden en open vervolgens de buis om te controleren op weefsel dat vastzit in het deksel. Als dat het geval is, probeer het dan los te maken en vortex opnieuw. Centrifugeer het monster kort gedurende 2 tot 3 seconden.Weeg de buis opnieuw en bereken het weefselgewicht door het oorspronkelijke buisgewicht van dit nieuwe gewicht af te trekken. Plaats de tube op ijs. Voeg een geschikt volume methanol toe aan de buis en vortex de buis grondig gedurende 15 seconden voordat u het gedurende 30 minuten op ijs incubeert, centrifugeer vervolgens het monster, adem het supernatant op en ga verder met het meten van de nitriet- en nitraatniveaus.Nitraatniveaus en spierhomogenaten van rattenskeleten bereid met behulp van een roterende homogenisator, kraalhomogenisator en vergruizer waren vergelijkbaar. Interessant is dat voor nitrietniveaus het homogenaatmonster bereid door een vergruizer de hoogste waarde vertoonde, die statistisch verschilde van de andere twee monsterwaarden. Een vergelijking van nitriet- en nitraatniveaus in gluteushomogenaten bereid uit 20, 50 en 200 milligram weefsel met behulp van een kraalhomogenisator toonde aan dat noch de nitraat- noch nitrietniveaus significant verschilden tussen de spiermonstergroottes.Het vergelijken van nitraatniveaus in verschillende knaagdierbeenskeletspierweefsels onthulde dat de gluteusspier ongeveer twee keer hogere nitraatniveaus had dan de andere drie spierweefsels. Deze verschillen bereikten echter geen statistische significantie. Net als bij de nitraatspiegels was de nitraatconcentratie in de gluteusspier ook hoger dan die in de andere drie spierweefsels en significant hoger dan die in het gastrocnemiusmonster.Onze methode is relatief eenvoudig en goed geschikt voor kleine monsters met behoud van nitraat en nitriet tijdens de monstervoorbereiding.

preparation-rat-skeletal-muscle-homogenates-for-nitrate-nitrite

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier tonen we de fabricage van op basis van collageen, weefsel constructen die het skelet myoblasten. Deze 3-D ontworpen constructies kunnen worden gebruikt om weefsels te vervangen of...

Fabricage van myogene Engineered Tissue constructen

We beschrijven а protocol voor isolatie van pure, sterk gekoppeld rat hart mitochondriën voor functionele of structurele studies van cellulaire bio-energetica, biofysische metingen, proteomics of mitochondriale DNA en lipiden-analyse.

Bereiding van zeer Gekoppeld Rat Hart Mitochondriën

Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van...

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Deze video toont de chirurgische voorbereiding en procedures die nodig zijn om de contractiele responsen van de rat mediale gastrocnemius spier voorbereiding...

Procedures voor Rat<em&gt; In situ</em&gt; Skeletspier contractiele eigenschappen

De endogene productie van stikstofoxide (NO) regelt diverse biologische functies. Het wordt steeds duidelijker dat verstoring of ontregeling van NO op basis van signalering is betrokken bij vele ziekten bij de mens. Methoden voor het kwantificeren van relevante NO metabolieten kunnen nieuwe diagnostische of prognostische biomarkers voor ziekte bij de mens.

Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Stikstofmonoxide (NO) is een belangrijk signaalmolecuul bij vasculaire homeostase. NO-productie in vivo is te laag voor directe meting. Chemiluminescentie biedt nuttige inzichten in de NO-cyclus via het meten van zijn precursoren en oxidatieproducten, nitriet en nitraat. De bepaling van nitriet/nitraat in lichaamsweefsels en -vloeistoffen wordt uitgelegd.

Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode

Hier presenteren we een protocol voor snelle spiervezels analyses, welke verbeterde kleuring kwaliteit en daardoor automatisch ophalen en kwantificering van vezelpopulaties door de vrij beschikbare software ImageJ mogelijk maakt.

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Intacte regulatie van spierglucoseopname is belangrijk voor het behoud van glucosehomeostase van het hele lichaam. Dit protocol presenteert een beoordeling van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren bij het afbakenen van de impact van verschillende fysiologische interventies op het glucosemetabolisme van het hele lichaam.

Meting van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren van muizen

Leer hoe je ratten skeletspierhomogenaten bereidt voor nauwkeurige nitraat- en nitrietmetingen. Dit protocol vergelijkt drie homogenisatiemethoden en behoudt deze belangrijke stikstofmonoxide-metabolieten betrouwbaar.

Bereiding van ratskeletspieren homogenaten voor nitraat- en nitrietmetingen

Meer video's verkennen