Grootte uitsluiting chromatografie om bacteriële buitenste membraanblaasje heterogeniteit te analyseren

Grootte-uitsluitingschromatografie is een nuttige benadering voor het scheiden van de subpopulaties van heterogene bacteriële blaasjes en voor het verwijderen van nucleïnezuren en eiwitten uit bacteriële supernatanten. Grootte-uitsluitingschromatografie is goedkoper, sneller en reproduceerbaarder dan andere scheidingstechnieken, waaronder ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt. We hebben het potentieel van deze aanpak aangetoond met behulp van A.actinomycetemcomitans blaasjes, maar we verwachten dat het ook kan worden toegepast op andere heterogene bacteriële blaasjespopulaties.

Zorg ervoor dat u alle buffer- en kraaloplossingen goed ontgast en de oplossing langzaam pipeteert zonder bubbels te introduceren, maar snel genoeg dat de kralen homogeen verpakken zonder uit te drogen. Gebruik om te beginnen een glazen staaf om een voorraadfles gelfiltratiemedium te mengen en giet het volume dat nodig is om de kolom plus ongeveer 50% overmaat in een glazen fles te vullen. Laat de kralen bezinken en decanteer de overtollige vloeistof.

Resuspend de kralen in elutie buffer tot een uiteindelijke oplossing van ongeveer 70% gel en 30% buffer en ontgas de oplossing onder vacuüm. Monteer de kolom op een ringstandaard in de verticale positie en vul de kolom met elutiebuffer om de muren nat te maken voordat u de buffer aftapt totdat er slechts ongeveer één centimeter overblijft. Pipetteer vervolgens voorzichtig de gelparels in de kolom terwijl u tegelijkertijd de overtollige buffer aftapt om te voorkomen dat de kralen bezinken totdat de kolom is verpakt tot een hoogte van ongeveer twee centimeter onder de bodem van het kolomreservoir.

Voordat u het monster laadt, ontgast u de elutiebuffer onder vacuüm. Was de kolom met ongeveer twee keer het kolomvolume van de elutiebuffer. Zodra de buffer de bovenkant van de gellaag bereikt, voegt u voorzichtig twee milliliter van een 100 tot 200 nanomolar per liter buitenste membraanblaasjemonster bovenop de gellaag toe zonder het oppervlak te verstoren en laat u het monster in de gel komen.

Voeg langzaam de elutiebuffer toe aan de kolom zonder de gellaag te verstoren en plaats een buis van 50 milliliter onder de kolom. Om te voorkomen dat de kolom uitdroogt, voegt u tegelijkertijd elutiebuffer toe aan de bovenkant van de kolom. Plaats na het verzamelen van 20 milliliter eluaat een rek van 1,5 milliliter buizen onder de kolom.

Verzamel in totaal 96 fracties van één milliliter in elke buis. Voeg tijdens het verzamelen van de monsters continu elutiebuffer toe aan de kolom. Om de kolom schoon te maken, voert u één kolomvolume van 0,1 molair natriumhydroxide door de kolom, gevolgd door twee kolomvolumes elutiebuffer.

Om de lipideconcentraties te meten, pipeteert u 50 microliter van elke fractie in een 96-putplaat. Voeg 2,5 microliter lipofiele kleurstof toe aan elke put. Meet na 15 seconden de florescentie-intensiteit.

Om de concentratie van een interessant eiwit te meten, voegt u 100 microliter van elke fractie toe aan individuele putten van een ELISA-immunoplaat. Na drie uur bij 25 graden Celsius decanteer je de plaatinhoud. Was de plaat vijf keer met 200 microliter ELISA-wasbuffer per wasbeurt die de plaat na elke wasbeurt decanteert.

Voeg 200 microliter blokkeerbuffer toe aan elke put voor een incubatietijd van een uur bij 25 graden Celsius. Decanteer aan het einde van de incubatie de plaat en voeg 100 microliters primair antilichaam toe in de blokkeerbuffer voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende dag decanteer de plaat en was de plaat vijf keer met ELISA-wasbuffer zoals aangetoond.

Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliter secundair antilichaam in ELISA-wasbuffer toe aan elke put gedurende een incubatietijd van een uur bij 25 graden Celsius. Was aan het einde van de incubatie de plaat zoals aangetoond en voeg 100 microliter TMB-oplossing toe aan elke put gedurende een incubatietijd van 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Wanneer een blauwe kleur zich ontwikkelt, voegt u 50 microliter stopoplossing toe aan elke put en meet u de absorptie op 450 nanometer.

Na grootte uitsluiting kolom zuivering van een A.actinomycetemcomitans cultuur supernatant zoals aangetoond, werden twee verschillende lipide pieken waargenomen, overeenkomend met de grote en kleine buitenste membraanblaasjes geproduceerd door deze stam. Elisa-analyse van de monsterfracties toonde aan dat het toxine voornamelijk geassocieerd is met de subpopulatie van grote buitenste membraanblaasjes. Immunovlekanalyse gaf vergelijkbare maar meer luidruchtige resultaten, wat aangeeft dat deze aanpak minder gevoelig is dan ELISA.

Zoals waargenomen, is deze chromatografietechniek in staat om aanzienlijke hoeveelheden vrije eiwitten uit de preparaten van de buitenste membraanblaasjes te verwijderen. Het is echter belangrijk op te merken dat de totale eiwitconcentratie niet noodzakelijkerwijs correleert met de concentratie van specifieke eiwitten. Het is belangrijk om zeer voorzichtig te zijn tijdens het verpakken en uitvoeren van de kolom om bellen te voorkomen en om te voorkomen dat de kolom uitdroogt.

Dynamische lichtverstrooiing, deeltjestracering en bicroscopie kunnen worden uitgevoerd na grootte-uitsluitingschromatografie om de grootte en andere kenmerken van de gescheiden buitenste membraanblaasjes te bepalen.