Snelvriezen met behulp van sandwichbevriezingsapparaat voor goed ultrastructureel behoud van biologische monsters in elektronenmicroscopie

Om de prachtige natuurlijke ultrastructuur van cellen te observeren, is het noodzakelijk om cellen te fixeren door snel te bevriezen. Sandwichvriezen is een van de beste methoden om cellen in te vriezen zonder ijskristallen te vormen. Dit protocol demonstreert het gebruik van sandwich-vriesapparaat en beschrijft ook de procedure voor het maken van ultradunne secties van vriesvervangende monsters na het invriezen van de sandwich.

Begin met het bereiden van vloeibaar propaan door de vloeibare stikstofcontainer van het sandwichbevriezingsapparaat of SFD te vullen met vloeibare stikstof. Vul de vloeibare propaancontainer met vloeibaar propaan door propaangas in te brengen met behulp van een fijn mondstuk. Versnel de stolling van propaan met behulp van een gekoelde metalen staaf.

Om de koperen schijven van het platte type en het mandtype voor te bereiden, plaatst u ze op een glazen dia met de no-letterzijde omhoog en behandelt u met gloemontlading op 10 pascal, 400 volt, één milliampere gedurende 30 seconden om het schijfoppervlak hydrofiel te maken met behulp van een ionenspotterapparaat. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van twee milliliter en centrifugeer gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur bij 2.900 maal G. Verwijder het supernatant en hang de pellet op om een dikke suspensie te verkrijgen.

Plaats een kleine hoeveelheid of ongeveer 0,02 microliter van de celsuspensie op een koperen schijf. Dek het af met een andere koperen schijf en pak de schijven op met een pincet. Maak een put in het midden van het vaste propaan met de dunne metalen staaf.

Zet het pincet in een SFD en vries ze snel in door op de injectieknop van het apparaat te drukken. Week het gebruikte pincet in water op kamertemperatuur om ze te verwarmen om de volgende exemplaren te bevriezen. Gebruik dierlijke en menselijke weefsels gefixeerd in 2,5% glutaaraldehyde, 0,1 molaire fosfaatbuffer van pH 7,4.

Snijd ze in 0,1 tot 0,2 millimeter dikke secties met een scheermesje onder een stereomicroscoop. Plaats een kleine druppel van de glutaaraldehyde-oplossing op de koperen schijf van het mandtype en gebruik vervolgens een pincet om een stukje weefsel in het glutaaraldehyde op de koperen schijf te plaatsen en bedek het met de platte koperen schijf. Vries de schijven snel in met de weefsels in het smeltende propaan van de SFD zoals eerder aangetoond.

Breng de schijven over in vloeibare stikstof in een werkbad. Maak met behulp van een pincet, gekoeld in vloeibare stikstof, de schijven van elkaar los om het monster bloot te leggen. Plaats de schijven met de cellen in een glazen injectieflacon die is gevuld met één milliliter aceton met 2% osmiumtetroxide dat in vloeibare stikstof is geplaatst en gestold.

Breng de schijven over naar een diepvriezer en bewaar ze twee tot vier dagen op min 80 graden Celsius voor vriesvervanging van de cellen. Breng de monsters geleidelijk op kamertemperatuur door ze twee uur lang te broeden bij min 20 graden Celsius, twee uur bij vier graden Celsius en 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng de schijven over in twee milliliter plastic buizen die gevuld zijn met één milliliter aceton.

Bereid epoxyhars door de reagentia in een plastic wegwerpcontainer te mengen met behulp van een roerder. Wissel de aceton achtereenvolgens af met 30% hars in aceton, 60% hars en 90% hars bij kamertemperatuur gedurende elk een uur en wissel vervolgens de 90% hars 's nachts met 100% hars bij 37 graden Celsius. Sluit ten slotte de monsters in 100% hars in de siliconen inbeddingsmal en polymeriseer ze gedurende 24 uur bij 60 graden Celsius.

Haal de gepolymeriseerde blokken uit de silicium insluitvormen en schrijf het monsternummer op het blok. Verwijder de koperen schijven uit het blok met een scheermesje en trim de monsters die op het blokoppervlak zijn ingebed met behulp van een ultrasoon trimmenmesje en scheermesjes onder een stereomicroscoop. Breng vervolgens tape aan op de monsterblokhouder en de monsterhouder van de microtoom en knip de tape op de grens.

Verwijder het blok van de ultramicrotoom, zet het in een stereomicroscoop en trim het verder tot 0,2 millimeter bij 0,3 millimeter met behulp van een scheermesje. Breng neopreen aan op de roosters om ze klevend te maken. Plaats het blok terug op de ultramicrotoom door de afgeplakte delen uit te lijnen.

Bedek de ultramicrotoom met een plastic deksel en snijd 50 tot 70 nanometer dikke secties. Haal de secties op met behulp van een lus. Monteer ze op 300 of 400 mesh koperen roosters behandeld met neopreen en droog ze.

Stel de roosters in met secties in de groef van de halve siliconenbuis. Week de monsters gedurende drie minuten in uranylacetaatoplossing. Verzamel de gebruikte uranyloplossing en bewaar deze in een spuit.

Was de monsters in een halve buis met een waterstraal en week de exemplaren vervolgens drie minuten in loodcitraat. Voor gist- en schimmelmonsters plaatst u de roosters op een filterpapier, pakt u ze op met een pincet en bedekt u ze met plasmapolymeriseerde naftaleenfilm op het wateroppervlak. Plaats de roosters in de monsterhouder van een elektronenmicroscoop, plaats vervolgens de monsterhouder in de elektronenmicroscoop en observeer bij 100 kilovolt.

Ultradunne secties van zowel E.coli als S.cerevisiae wanneer waargenomen onder de elektronenmicroscoop toonden natuurlijke morfologie en duidelijke beelden. Ultradunne delen van gekweekte cellen die snel bevroren waren met SFD werden waargenomen onder de elektronenmicroscoop. De beelden van ultradunne delen van de menselijke huid waren zeer duidelijk en toonden een natuurlijke morfologie.

Kerndeeltjes van het hepatitis B-virus werden snel bevroren met SFD en waargenomen door cryo-elektronenmicroscopie. Het belangrijkste om te onthouden is dat je een zeer kleine hoeveelheid cellen op de koperschijven moet aanbrengen, zodat ijskristalvorming bij bevriezing wordt voorkomen. Door dierlijke weefsels vooraf met glutaaraldehyde te fixeren, wordt een goede bevriezing op een diepte van ongeveer 200 micrometer bereikt, vergelijkbaar met de diepte die wordt bereikt door hoge drukvriezen.

Deze techniek maakt de weg vrij voor een onderzoeker om de prachtige natuurlijke ultrastructuur van cellen gemakkelijk en tegen lage kosten te observeren.