Met behulp van de fluorescerende kleurstof, Rhodamine B, om paringsconcurrentievermogen bij mannelijke Aedes aegypti-muggen te bestuderen
7 mei 2021
Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de paringsconcurrentie van mannelijke Aedes aegypti met fluorescerende kleurstof als marker. Vrouwelijke muggen worden blootgesteld aan zowel gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes voor copulatie. Na de paring worden hun spermathecae onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop om hun paringspartner te bepalen.
Dit protocol meet het concurrentievermogen van mannelijke muggenparing, wat een voorwaarde is voor op mannelijke vrijlating gebaseerde muggenpopulatieonderdrukkingsprogramma's. Dit geschiktheidscriterium wordt beoordeeld als onderdeel van kwaliteitscontrole en stamevaluatie. Deze methode vermindert de experimentele tijd met 90% en maakt de directe vergelijking van de paringsconcurrentie tussen twee steriele of Wolbachia-geïnfecteerde lijnen mogelijk.
Deze procedure wordt uitgevoerd door Irene Li en Keng Wai Mak. Om te beginnen, seks de mannelijke en vrouwelijke muggen in het popstadium, volgens hun grootteverschillen. Breng voor elke set muggen 100 mannelijke poppen over in een vooraf gelabelde kooi voor sucrosevoeding of Rhodamine B sucrose-voeding.
Plaats de vrouwelijke poppen in kleine partijen van 40 tot 50 per kooi. Controleer bij het verschijnen van de imago's de kooien op de aanwezigheid van mannelijke muggen. Om de 0,2% Rhodamine B sucrose-oplossing te bereiden, lost u 200 milligram Rhodamine B-poeder op voor elke 100 milliliter 10% sucrose-oplossing.
Meng goed om ervoor te zorgen dat al het poeder is opgelost. Bereid 20 suikervoederflessen voor met een lont. Voeg 10 milliliter 10% sucrose toe aan 10 feederflessen en 10 milliliter 0,2% Rhodamine B sucrose-oplossing voor de andere 10 feederflessen.
Plaats vijf voederflessen in elke voorbereide mannelijke kooi en laat de mannelijke muggen zich drie dagen voeden voor het paringsexperiment. Zet de kwikbranderlamp en de stereomicroscoop aan. Laat de lichtbron naar de kwikbranderlamp gedurende 10 minuten stabiliseren.
Stel vervolgens de fluorescentiefilters in voor rode fluorescentie-eiwit één. Aspirateer een klein aantal muggen tegelijk in de glazen buis van de orale aspirator. Observeer door de glazen buis het lichaam van de mannelijke muggen onder de fluorescerende stereomicroscoop.
Gebruik alleen mannelijke muggen gemarkeerd met Rhodamine B voor het experiment. Transfer set Een mannelijke muggen in 12 papieren bekers vastgezet met gaas. Plaats 10 sucrose gevoede mannelijke muggen per kopje in zes kopjes, en 10 Rhodamine B sucrose gevoed mannelijke muggen per kopje in de andere zes kopjes.
Herhaal deze stap voor set B mannelijke muggen. Stel 12 kooien in voor de paringstest. In elk van de zes kooien, omvatten 10 set A mannelijke muggen die Rhodamine B gemarkeerd zijn, 10 ongemarkeerde set B mannelijke muggen en 10 maagdelijke wilde vrouwelijke muggen.
In de andere zes kooien, omvatten 10 ongemarkeerde set A mannelijke muggen, 10 Rhodamine B gemarkeerde set B mannelijke muggen en 10 maagdelijke wilde vrouwelijke muggen. Label deze kooien om duidelijk onderscheid te maken tussen de twee paringscombinaties. Plaats de respectievelijke kopjes van mannetjes in de paringskooien volgens de labels.
Verwijder het gaas en tik zachtjes op de beker om de mannetjes uit de beker te duwen. Verwijder voorzichtig de papieren beker en het gaas uit de kooi om ervoor te zorgen dat er geen muggen uit de kooi ontsnappen. Laat de mannelijke muggen minstens een uur acclimatiseren in de paringskooi.
Breng met behulp van een orale aspirator maagdelijke wilde vrouwelijke muggen over in 12 papieren bekers, elke beker bevat 10 muggen. Na de acclimatisatieperiode voor de mannelijke muggen, breng een kopje vrouwtjes over in elke paringskooi en verwijder het gaas. Duw de beker voorzichtig om eventuele resterende vrouwelijke muggen uit de beker te halen en verwijder vervolgens voorzichtig de papieren beker en het gaas uit de kooi om ervoor te zorgen dat er geen muggen uit de kooi ontsnappen.
Laat de paring drie uur plaatsvinden en beëindig vervolgens het paringsexperiment door alle muggen uit elke kooi te verwijderen met een mechanische aspirator. Verdoof de muggen op ijs gedurende ten minste vijf minuten. Wanneer de muggen volledig zijn verdoofd, pak je de vrouwelijke muggen voorzichtig op en huisvest je ze in een aparte papieren beker die is beveiligd met gaas.
Label de papieren beker door het betreffende etiket van de paringskooi op de beker over te brengen. Om vrouwelijke spermathecae te scoren, verdoving je de vrouwelijke muggen op ijs gedurende ten minste vijf minuten voordat ze onder een stereomicroscoop worden gediscedeerd. Ontleed de vrouwelijke mug onder de stereomicroscoop.
Onderzoek de spermathecae onder microscoop. Als het vrouwtje niet geïnsemineerd is, zouden alle drie de spermathecae leeg zijn en als ze geïnsemineerd zouden twee of drie van de spermathecae gevuld zijn met beweeglijk sperma. Voor geïnsemineerde individuen, bepaal of de spermathecae Rhodamine B gemarkeerde zaadvloeistof bevatten door ze te onderzoeken onder de fluorescerende stereomicroscoop uitgerust met een RFP1-filter.
Als de spermathecae is gevuld met zaadvloeistof die niet is gemarkeerd met Rhodamine B, wordt geen fluorescentie waargenomen. Aan de andere kant, als de spermatheca Rhodamine B gemarkeerde zaadvloeistof bevat, zou het oranje fluoresceren. Het doel van deze paringsconcurrentietest was om te bepalen of er een verlies in mannelijke paringsfitheid zou kunnen zijn na verschillende generaties inteelt.
Experimentele drievoud van de paringsconcurrentietest werden uitgevoerd en de inseminatiegegevens worden hier weergegeven. Wild-type vrouwtjes werden geïnsemineerd door de inteelt- of outcross-mannetjes, met wederzijdse markering. De resultaten tonen aan dat het aandeel vrouwtjes geïnsemineerd door de inteelt- of outcross-mannetjes niet werd beïnvloed door de Rhodamine B-markering.
Een significant hoger percentage vrouwtjes paarde met de outcross-mannetjes dan met de inteeltmannetjes in alle drie de replicants, wat aangeeft dat inteelt kan leiden tot verlies van paringsfitheid. Het is belangrijk om extra kooien van vrouwelijke muggen voor te bereiden. Gebruik geen vrouwelijke muggen uit een kooi die is besmet met mannelijke muggen, omdat vooraf geïnsemineerde vrouwtjes alle gegevens ongeldig zouden maken.
Anders dan laboratoriumgebaseerde paringsconcurrentietest, kan deze procedure worden gebruikt in mark release-recapture-experimenten om de biologie van de paring van insecten, populatiedynamiek en de verspreiding ervan te bestuderen.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het beoordelen van de paringsconcurrentie bij mannelijke Aedes aegypti muggen, een belangrijke overweging in strategieën voor muggenpopulatiecontrole. Door Rhodamine B te gebruiken als een fluorescente marker, kunnen onderzoekers het paringssucces van gemarkeerde versus ongemarkeerde mannetjes direct vergelijken na blootstelling aan vrouwelijke muggen.
Belangrijke onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Paringsconcurrentie van muggen
- Strategieën voor populatieonderdrukking
- Gedrag en biologie van insecten
Achtergrond
- De noodzaak van effectieve muggenpopulatiecontrole vanwege hun rol bij ziekteoverdracht.
- Belang van het beoordelen van mannelijke paringsfitness voor kwaliteitscontrole in programma's met steriele insectentechniek.
- Gebruik van fluorescente markers om de experimentele nauwkeurigheid en efficiëntie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gecontroleerde paringsproeven met gemarkeerde en ongemarkeerde mannelijke muggen.
- Aedes aegypti als modelorganisme.
- Fluorescentiemicroscopie voor het analyseren van paringsuitkomsten en sperma-aanwezigheid.
Belangrijkste resultaten
- Inteelt vermindert mannelijke paringsfitness, zoals blijkt uit lagere inseminatiepercentages bij inteelt mannetjes vergeleken met buitenkruis mannetjes.
- Fluorescente markering had geen invloed op het percentage geïnsemineerde vrouwtjes.
- Efficiënte methode maakt snelle beoordeling van paringsconcurrentie mogelijk.
Conclusies
- Deze studie benadrukt de impact van genetische factoren op het paringssucces bij Aedes aegypti.
- De bevindingen zijn relevant voor toekomstig onderzoek naar muggenbestrijding en populatiedynamiek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
