Screening van peptiden die MRGPRX2 activeren met behulp van Engineered HEK Cells

Vandaag zullen we een methode demonstreren om een peptidebibliotheek te screenen, tegen een onlangs ontdekte masterreceptor, mas-gerelateerde G-eiwitreceptor X2, ook bekend als MRGPRX2-receptor. Mestcellen zijn een integraal onderdeel van het immuunsysteem en spelen een cruciale rol in zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen. Mestcellen worden geactiveerd door de antigeengebonden Fc epsilon R1-receptor of door de recent ontdekte X2-receptor.

Activering van oppervlaktegebonden X2-receptor, is in verband gebracht met verschillende immunologische en ontstoken ziekten en daarom is het belangrijk om het bindingsmechanisme van deze receptor aan zijn liganden te begrijpen. Om dit te doen, hebben we een bibliotheek van kleine peptidemoleculen ontwikkeld en deze gescreend tegen X2-receptoren die te veel tot expressie komen op hexis. In de studie werd een peptidebibliotheek geconstrueerd met behulp van eenvoudige en veelzijdige technieken van Alanine-scanning en aminozuur-truncaties.

Heck293 zegt, het tot expressie brengen van X2-receptoren wanneer geactiveerd met de peptiden en wide-type hexis werden gebruikt als controle. In truncation release bij activering werd gecontroleerd om de X2-gebaseerde activering te bestuderen. Experimenteel wordt Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye geëxtst op 340 en 380 nanometer, terwijl de emissie wordt geregistreerd op 510 nanometer.

Bij calciumbinding neemt de fluorescentie-intensiteit bij 340 toe, terwijl die van 380 nanometer afneemt. De kleurstof wordt vervolgens afgezet in de verhouding van de fluorescentie-intensiteit bij 340 tot die van 380 nanometer. De 340 van een 380-verhouding, is evenredig met het intracellulaire calcium, de waarde ervan kan worden berekend door de Grynkiewicz-vergelijking.

De tabbing ratio van twee fluorescentie-intensiteiten, effect van experimentele factoren zoals verdunning, fotobleaching, kleurstoflekkage en geurdichtheden worden gedetecteerd. Dus laten we zonder verder uitstel het experiment starten. Om de liganden van de mestcel MRGPR X2 receptor, generator N-Truncated, C-Truncated en N+C-Truncated peptide library te identificeren, door de N-terminale, C-terminale en N+C-terminale aminozuren van pam-12 misproctivity af te kapen.

Gebruik vaste fase peptide synthese om de peptiden te synthetiseren. Wijzig de eindterminal in een ingestelde getijdengroep en de C-terminal in een amidegroep. Genereren en alanines kunnen peptide bibliotheek, door het vervangen van de respectieve aminozuren van pam-12 door Alanine, een voor een.

Wijzig de eindterminal in een setidegroep en de C-terminal in een amidegroep. Bereid kweekmedium door dmem met hoge glucose aan te vullen met 10% foetaal runderserum, twee millimolaire L-glutamine, honderd eenheden penicilline per ml en honderd microgram per ml streptomycine. Naast de cellen in de tee sue cultuur eigenschap, 375 kweekkolf bij 37 graden Celsius, 5% CO2, totdat ze 75 tot 80% confluent zijn.

Zodra 75% confluent, wast u de cellen en voegt u twee tot drie ml Proof-C toe om de cellen los te maken. Zodra de cellen zijn losgemaakt, verzamelt u de cellen in Proof-C. Voeg zes tot negen ml vers medium toe.

Centrifugeer de cellen op 1620g gedurende drie tot vijf minuten. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg om de pellet op te vangen. Resuspend de cellen in vers kweekmedium.

Verdun de cellen, volgens de gewenste concentratie. Bij 200 microliter van de celsuspensie met de concentratie van 200.000 cellen, giet de ambon in elke put om 40.000 cellen per put te zoeken. Bewaak de cellen gedurende 24 uur in de incubator 37 graden Celsius, 5% CO2.

Gebruik Fura-2 AM-kleurstof voor het experiment. Voeg 50 microliter DMSO toe in 50 microgram Fura-2 AM, om een millimolar grimmige oplossing van Fura-2 AM-kleurstof te bereiden. Voeg één microliter van één millimolar Fura-2 AM-kleurstof per ml vers medium toe om het verdunningsmedium van één micromolaire kleurstofconcentratie te bereiden.

Haal de 96-well plaat uit de couveuse en gooi het medium weg. Vervang het medium door vers verdunningsmedium. Voeg in elke put 200 microliter verdunningsmedium toe.

Incubeer de cellen gedurende 30-40 minuten in 37 graden Celsius, 5% CO2-incubator. Terwijl de cellen worden geïncubeerd, stelt u de plaatlezer in. Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius.

Selecteer flex in instellingen. Stel de leesmodus in op Fluorescentie en Onderste gelezen. Stel in Golflengten het aantal golflengten in op twee.

Stel de excitatie in op 340 nanometer en 380 nanometer. Stel de emissie in op 510 nanometer. Laat de gevoeligheid op Standaard staan.

Stel in Timing het interval in op 3,9 seconden. Stel de looptijd in op 94 seconden om 25 leescijfers te krijgen. Selecteer vervolgens het type testplaat.

Selecteer vervolgens de te lezen putten. Stel in Compound Transfer de overdracht in op één en Het beginvolume op honderd microliter. Stel pipethoogte in op honderd microliter, volume op 50 microliter en tijdspunt op 36 seconden om de verbinding toe te voegen en de meting te verzorgen.

Selecteer vervolgens het type compoundbronplaat. Laat Triturate op niet gebruiken. Selecteer de lay-out tips en pipetpunten.

Voor samengestelde en tipkolommen wordt de verbinding overgebracht in kolom één van de samengestelde plaat. Stel de tipkolom in op één en samengestelde kolom op één. Laat AutoCalibrate op Aan.Klik op OK. Verwijder na 40 minuten incubatie het medium.

Was de cellen met de XDB-buffer. Voeg honderd microliter XDB-buffer toe voor fluorescentiemeting. Neem de plaat voor fluorescentiemeting.

Wanneer pritchett 37 graden Celsius heeft bereikt, drukt u op de leeskamer om de testplaat in de fluorescentieplaatlezer te plaatsen. Druk op de bron om de samengestelde plaat te plaatsen. Bereid de samengestelde plaat voor door 200 microliter gerespecteerde peptiden ionomysine en EGTA toe te voegen aan turn X-oplossingen.

Druk op de tip pratt om de tip box te plaatsen. Gebruik een zwarte punt om autofluorescentie van de tip te voorkomen. Zodra de platen zijn bewaard en als u de instellingen van de software gebruikt en op Lezen drukt.

Bepaal de calciumconcentratie uit de fluorescentieverhouding met behulp van de Grynkiewicz-vergelijking. Getoond zijn de fluorescentiegegevens van pam good peptide. Zoals te zien is, neemt na peptidetoevoeging na 36 seconden de fluorescentie op 340 nanometer die lauw is toe met die van 380 nanometer record neemt af.

Gegevens worden weergegeven als de verhouding van 340 tot die van 380 signaal. Ze laten zien dat de signalen toenemen na toevoeging van peptiden. Dit cijfer zijn de representatieve gegevens voor een activerend peptide.

Figuur A toont de fluorescentiesignalen voor een activerend peptide. Representieve gegevens komen overeen met cram12 Peptide werd toegevoegd na het maken van een basislijn voor aanbestedingscycli, zoals blijkt uit het ado. Figuur B toont de verhouding van fluorescentie-emissie na excitatie op 340 nanometer, tot die van fluorescentie-emissie na excitatie op 380 nanometer.

Dit cijfer is de representatieve gegevens voor de lege. Figuur A toont de fluorescentiesignalen voor de blanco. HTB werd toegevoegd na het verdunken van een baseline voor 10 voedingscycli zoals blijkt uit het ado.

Figuur B toont het rantsoen van fluorescentie-emissie na excitatie op 340 nanometer tot dat van florescentie-emissie na excitatie op 380 nanometer. Dit cijfer is de representatieve gegevens voor de normen voor kleurstofkalibratie. Figuur A laat zien dat ionomycine werd toegevoegd bij de 10e metingen, zoals blijkt uit het ado om maximale fluorescentie te krijgen in cashem-gebonden toestand.

EGPA Triton X hundred werd toegevoegd na 20 metingen zoals blijkt uit de ado die een minimaal signaal krijgen. Figuur B toont de verhouding van fluorescentie-emissie na excitatie bij 340 nanometer tot die van fluorescentie-emissie na excitatie bij 380 nanometer. Deze waarden worden verder in de Grynkiewicz-vergelijking geplaatst om de intracellulaire cache van concentratie te krijgen.

Deze figuur toont de karakterisering van een representatief peptide om de sequentie en zuiverheid te bevestigen. Figuur A toont de verticale massa van de representatieve peptidesequentie WNK WAL was 857,90 kleurstofverdunning. Dat blijkt uit de N over Zed ratio in Massaspectroscopie.

Figuur B toont een peptidezuiverheid van 99%, zoals bevestigd door HPLC. Dit peptide behoort tot de N+C-afgeknotte peptidebibliotheek. Kortom, de hier beschreven methode is een eenvoudige en veelzijdige die efficiënt en helder kan zijn voor de laatste schaal op calcium gebaseerde screening.

Er zijn echter verschillende factoren die de kwaliteit van de gegevens bepalen, en dus moet de samenstelling worden geoptimaliseerd voor een bepaald celinstrumentsysteem. Bedankt.