Een vereenvoudigde methode voor het genereren van nierorganoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Deze methode kan worden uitgevoerd in elk laboratorium dat is uitgerust voor celkweekexperimenten. Met behulp van deze methode kunnen we ons begrip van nierontwikkeling en ziekteroutes vergroten. Dit is een relatief eenvoudige en goedkope methode in vergelijking met anderen voor het genereren van nierorganoïden.

De grootste uitdaging van deze techniek is het handhaven van hoogwaardige menselijke pluripotente stamcelkweek. Het is van cruciaal belang dat de cellen op minder dan 80% confluentie worden gehouden en regelmatig worden gesplitst. Onderzoekers die nieuw zijn in de menselijke pluripotente stamcelcultuur moeten zich vertrouwd maken met de stamcellijnen voordat ze overgaan tot differentiatie.

Begin de nierorganoïde-test door twee milliliter volledig E5-ILP-medium toe te voegen aan elke put van een ultralage bevestigingsplaat met zes putten. Kweek menselijke pluripotente stamcellen, of hPSC's, in met weefselkweek behandelde platen van 100 millimeter totdat ze 60% confluentie bereiken. Was de hPSC's tweemaal met ongeveer acht milliliter DPBS.

Aspiraleer de DPBS, voeg vervolgens twee milliliter Dispase druppelsgewijs toe om de cellen te bedekken en incubeer ze gedurende zes minuten bij 37 graden Celsius. Was de cellen driemaal met ongeveer 10 milliliter DPBS. Zuig de DPBS op, kantel de plaat vervolgens 45 graden en schraap de cellen naar beneden met een cellifter.

Spoel de kolonies van bovenaf af met zes milliliter compleet E5-ILP-medium met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter. Houd vervolgens de pipet verticaal en breek grote kolonies op door voorzichtig op en neer te pipetteren, waarbij u ervoor zorgt dat u de zijkanten van de kweekplaat niet raakt. Verdeel de kolonieclusters gelijkmatig door één milliliter per put toe te voegen aan de zes-putplaat en plaats de plaat vervolgens op een orbitale shaker in een incubator van 37 graden Celsius.

Als alternatief, als er geen orbitale shaker beschikbaar is, kunnen de cellen statisch worden gekweekt. Op dag twee, nadat je de embryoïde lichamen aan de onderkant van de plaat hebt laten bezinken, kantel je de plaat 45 graden en zuig je het medium langzaam van bovenaf op, waardoor er één milliliter per put overblijft. Voeg twee milliliter bereid medium per put toe en breng de plaat terug naar de shaker.

Op dag drie, na het aanzuigen van het medium zoals eerder aangetoond, verzamelt u alle embryoïde lichamen zorgvuldig uit elke put met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter en brengt u ze over naar een conische buis van 50 milliliter. Om eventuele resterende embryoïde lichamen te verzamelen, spoelt u elke put met één milliliter dmem met lage glucose en voegt u ze toe aan dezelfde conische buis van 50 milliliter. Terwijl u wacht tot de embryoïde lichamen zich op de bodem van de buis hebben gevestigd, voegt u twee milliliter Stadium II-medium toe aan elke put van de plaat met zes putten.

Zeef vervolgens grote embryoïde lichamen uit door een celzeef van 200 micrometer bovenop een nieuwe conische buis van 50 milliliter te plaatsen en alle embryoïde lichamen zorgvuldig over de celzeef te pipetteren. Spoel de celzeef met nog eens vijf milliliter DMEM om eventuele embryoïde lichamen die vastzitten in de zeef te verzamelen. Gebruik in latere stadia eerst een zeef van 500 micrometer om zeer grote embryoïde lichamen uit te zeven en passeer vervolgens het filtraat door een zeef van 200 micrometer om zeer kleine embryoïde lichamen zonder tubuli uit te zeven.

Verzamel de juiste grootte embryoïde lichamen, tussen 200 en 500 micrometer, door de zeef van 200 micrometer om te keren in een nieuwe buis van 50 milliliter en de zeef te wassen met DPBS. Laat na het persen de embryoïde lichamen zich op de bodem van de conische buis nestelen, anspiraleer vervolgens het supernatant en was met ongeveer 10 milliliter DMEM. Resuspend de embryoïde lichamen vervolgens in zes milliliter stadium II-medium.

Breng de embryoïde lichamen terug in de ultralage bevestigingsplaat met zes putten en verdeel ze gelijkmatig over de putten. Omdat de meeste organoïden zich aan de bovenkant van de pipet verzamelen, laat u ongeveer een halve milliliter aan het einde achter en raakt u vervolgens voorzichtig de punt aan de media in elke put, waardoor organoïden in de put kunnen stromen. Breng de embryoïde lichamen over in een spinnerkolf van 125 milliliter met 45 milliliter stadium II-medium.

Stel de magneetroersnelheid in op 120 rpm en plaats de kolf in de couveuse. Om de embryoïde lichamen of nierorganoïden te voeden, laat u ze kort op de bodem van de spinnerkolf bezinken, til dan het deksel van één zijarm van de kolf op en plaats de aanzuigende pipet binnenin met de punt die de tegenoverliggende binnenwand raakt. Richt de pipet langzaam naar beneden en zuig ongeveer de helft van het medium op.

Vul aan met 20 milliliter vers Stage II medium door het door dezelfde opening te pipetteren. Gebruik een lange steriele tang om voorzichtig één magnetische roerstaaf in elke put van een zes-well plaat met embryoïde lichamen of nierorganoïden te plaatsen. Plaats de plaat op de zeswielige magneetroerplaat en stel de snelheid in op 120 tpm.

Om de magneetroerstaven in positie te klikken en te laten draaien, stelt u eerst het vermogensniveau in op 100. Zodra alle balken beginnen te draaien, breng je het vermogensniveau terug naar 25. Onderhoud de nierorganoïden door de helft van het medium te veranderen, zoals eerder is aangetoond.

Immunofluorescentie van paraffinesecties van dag 14 nierorganoïden vertonen de aanwezigheid van nefronsegmenten zoals niertubuli die hepatocytenkernfactor-1 bèta en Lotus tetragonolobus lectine tot expressie brengen, evenals podocytenclusters die V-maf musculoaponeurotisch fibrosarcoom tot expressie brengen opcogene homoloog B en nefrine. De modificaties in dit protocol kunnen de uitbreiding van endotheelcellen ondersteunen, zoals bevestigd door kleuring met bloedplaatjes en endotheelceladhesiemolecuul-1 op dag 26 van de kweek. Menselijke pluripotente stamcellen moeten gedurende de juiste tijd met Dispase worden behandeld en vervolgens grondig worden gewassen om alle sporen te verwijderen.

Als Dispase niet volledig wordt verwijderd, kan dit leiden tot celdood en clustering van embryoïde lichamen. Deze methode heeft ons geholpen de ontwikkeling van aangeboren nierziekten te onderzoeken, evenals verschillende routes voor nierbeschadiging en potentieel voor therapeutische interventies in vitro.