Analyse van levermicro-omgeving tijdens vroege progressie van niet-alcoholische leververvetting-geassocieerd hepatocellulair carcinoom bij zebravissen

Onze zebravis leverkanker modellen en protocol bieden een unieke kans om in vivo, niet-invasief, de lever micro-omgeving en het immuunlandschap te visualiseren met behulp van intravitale microscopie. De transparantie van de zebravislarven is ongetwijfeld het belangrijkste voordeel van dit systeem, dat ons in staat stelt om niet-invasieve intravitale microscopie uit te voeren en inzicht te krijgen in de micro-omgeving en immuuncelinfiltratie van een diep weefsel en orgaan, zoals lever. Ons dieet-geïnduceerde nefrotische model en de beeldvormingstechnieken beschreven in dit protocol kunnen gemakkelijk worden toegepast op de ingewikkelde cel-celinteracties in andere leverziekten of onderzoeksgebieden, waaronder het metabool syndroom en hart- en vaatziekten.

Cassia Michael, onze laborant, en Dr. Francisco Juan Martinez-Navarro, een postdoctoraal fellow in mijn laboratorium, demonstreren de procedure. Om te beginnen, weeg vier gram commercieel droogvoerdieet voor zebravislarven in twee glazen bekers van 25 milliliter, een voor een normaal dieet en de andere voor het 10% hoge cholesteroldieet of HCD. Weeg 0,4 gram cholesterol in een glazen bekerglas van 10 milliliter en bedek het bekerglas met folie.

Meet in een zuurkast vijf milliliter diethylether met een spuit van 10 milliliter met een naald van 20 gauge. Voeg vervolgens de diethylether toe aan het normale dieetbeker en meng het onmiddellijk met het droge voedsel met behulp van een spatel. Meet nog eens vijf milliliter diethylether met dezelfde spuit en naald en voeg deze toe aan het HCD-bevattende bekerglas.

Meng onmiddellijk door op en neer te zuigen met de spuit. Voeg snel de cholesteroloplossing toe aan het HCD-bekerglas en meng het onmiddellijk met een spatel totdat de oplossing uniform is. Laat bekers tot 24 uur in de kap zitten om de diethylether volledig te verdampen.

Maal de volgende dag de diëten tot fijne deeltjes met behulp van een stamper en vijzel. Breng elk dieet over naar een kleine, gelabelde plastic zak of een centrifugebuis van 50 milliliter en bewaar ze bij min 20 graden Celsius. Stel transgene vislijnen op dag min één.

Verzamel op dag nul eieren in een gaaszeef nadat de vissen hebben gebroed. Spoel de eieren met een wasfles met E3 grondig af en breng ze voorzichtig over naar petrischalen van 10 centimeter met E3-medium. Reinig de platen van al het puin dat zich mogelijk in de kweekdozen heeft opgehoopt, inclusief dode of onbevruchte eieren om de ongecontroleerde groei van micro-organismen en daaruit voortvloeiende defecten in de ontwikkeling van larven te voorkomen.

Verdeel vervolgens de eieren met een dichtheid van 70 of 80 eieren per gerecht met 25 milliliter E3. Controleer en reinig op de eerste dag dode embryo's of embryo's met ontwikkelingsstoornissen onder een dissectiescope uitgerust met een transilluminatiebasis. Combineer op dag vijf larven uit alle gerechten in een petrischaaltje van 15 centimeter en voeg E3 toe zonder methyleenblauw. Verdeel larven in de voerbakken en voer ze zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Houd de larven in de zebraviskamer of een couveuse op 28 graden Celsius in een donker-lichtcyclus en voer ze twee keer per dag van dag 5 tot dag 12. Verwijder dagelijks voedselresten en 90 tot 95% van het medium met behulp van een vacuümsysteem dat is bevestigd aan een pipetpunt van één milliliter. Giet vervolgens voorzichtig de nieuwe E3 zonder methyleenblauw in een hoek van de voerbak om te voorkomen dat de larven worden beschadigd.

Als alternatief kunnen de larven worden verdeeld in tanks van drie liter met systeemwater en worden geplaatst als een op zichzelf staande systeemeenheid met een lage waterstroom. Dit alternatief bespaart de tijd die nodig is voor het dagelijkse reinigingsproces en het filtratiesysteem helpt de larven gezond te houden tot het eindpunt. Bereid op dag 13 verzamelgerechten op basis van het aantal experimentele omstandigheden dat is ingesteld.

Giet voldoende E3 zonder methyleenblauw om de bodem van elk gerecht te bedekken. Zuig vervolgens voorzichtig, met behulp van het vacuümsysteem, het water uit de voerbakken. Wanneer het waterniveau laag begint te worden, til dan langzaam de voederbox op om larven naar een van de hoeken te laten zwemmen en adem dan in de tegenovergestelde richting.

Zodra er slechts ongeveer 20 tot 30 milliliter van de vloeistof overblijft, decanteert u larven voorzichtig in de voorbereide petrischaal en plaatst u de gelabelde tape van de voerdoos op het deksel van de schaal. Scherm op een fluorescentiemicroscoop de verdoofde larven op gewenste fluorescerende markers. Voeg vervolgens tricaïne E3 toe aan de kamers van het verwondings- en beknellingsapparaat.

Verwijder luchtbellen uit de kamers en het fixatiekanaal met behulp van een P-200 micropipette. Verwijder alle overtollige tricaine E3, zodat er slechts voldoende volume overblijft om de kamers te vullen. Breng vervolgens een verdoofde larve over in de laadkamer van het verwondings- en beknellingsapparaat en positioneer deze voor beeldvorming van de linkerkwab met behulp van een wimpergereedschap.

Beeld de morfologie van alle benodigde cellen in de lever af onder een confocale microscoop zoals beschreven in het tekstmanuscript. Open de Fiji-software. Open vervolgens het afbeeldingsbestand en vink de optie Kanalen splitsen aan op het tabblad Importopties voor bio-indeling.

Nadat u maximale intensiteitsprojecties voor elk kanaal hebt gemaakt, creëert u een ROI rond de larvale lever en meet u het levergebied. Voeg vervolgens een schaalbalk toe als referentie en creëer een tweede ROI inclusief het levergebied en 75 micrometer van het omliggende gebied. Selecteer in het menu Plug-ins de optie Analyseren gevolgd door Celteller en tel de immuuncellen binnen het rekruteringsgebied.

Noteer het aantal gerekruteerde immuuncellen in een spreadsheet. Bereken de neutrofiele, macrofaag- en T-celdichtheden door het aantal immuuncellen per levergebied te normaliseren. HCC-zebravislarven gevoed met een normaal dieet vertonen geen hepatische steatose, zoals gemeten door Oil Red O-kleuring.

HCC-larven gevoed met HCD vertonen echter een significante toename van leversteatose. Na acht dagen blootstelling aan een cholesteroloverschot werd leververgroting waargenomen bij HCC-larven. Om hepatomegalie te beoordelen, werden het levergebied, het leveroppervlak en het levervolume geëvalueerd.

Bij niet-alcoholische steatohepatitis-geassocieerde HCC waren het hepatocytengebied, samen met het nucleaire gebied, en de nucleair-cytoplasmatische ratio verhoogd. Een significante afname van nucleaire circulariteit werd ook waargenomen in de vetrijke dieet-gevoede HCC-groep. Met behulp van de H2B-mCherry marker werd een grotere incidentie van micronuclei gedetecteerd in de HCC-larven gevoed met HCD.

Hepatische vasculatuurevaluatie toonde een significante toename van de vaatdichtheid bij HCC-larven gevoed met HCD. Infiltratie van macrofagen en neutrofielen vond plaats in zowel HCC als HCC gevoed met HCD-larven. Kwantificering van neutrofielen in macrofagen in de lever en omgeving ervan toonde een significante toename van het aantal en de dichtheid van de cellen in HCC-larven gevoed met HCD.

Daarentegen werd een significante afname van de T-celdichtheid in het totale aantal waargenomen bij HCC-larven die met HCD werden gevoed. Het reinigen van de tanks en het voeren zijn de belangrijkste stappen om de levensvatbaarheid van larven te garanderen en de ontwikkeling van steatose of lever en systemische chronische ontsteking in de controles als gevolg van slechte kwaliteit van het water of onjuiste voeding te voorkomen. Andere methoden zoals time-lapse microscopie en analyse van de interactie tussen de verschillende cellen die de lever bevolken, kunnen worden uitgevoerd.

Bovendien kan eencellige RNA-zoektocht van ontleedde levers in verschillende leverkankerstadia worden uitgevoerd om volledig te begrijpen hoe het leverimmuunlandschap evolueert met ziekteprogressie.